Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

El objetivo general del siguiente experimento es realizar un mapeo del destino y el rastreo del linaje de células individuales seleccionadas en embriones de pez cebra. Esto se logra mediante la conjugación química de fluoresceína enjaulada con dextrano de alto peso molecular. A continuación, la fluoresceína dextrano preparada en jaula se microinyecta en embriones de pez cebra, que luego se fotoactiva en células seleccionadas mediante la absorción de dos fotones.

Después de la fotoactivación de los embriones, se realiza un análisis inmunohistoquímico para detectar la fluoresceína dextrano no enjaulada con el fin de mapear el destino de las células activadas. En última instancia, este método se puede utilizar para determinar la contribución del linaje y la localización tisular de las células individuales fotoactivadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía de fluorescencia estándar, es que se puede utilizar para marcar diferencialmente células individuales para el mapeo de fe.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cómo las células precursoras indiferenciadas pueden contribuir a diferentes tipos de tejidos, La demostración visual es fundamental ya que los pasos de montaje del embrión y fotoactivación son difíciles de aprender basándose solo en la descripción del texto. Antes de comenzar, sintetice fluoresceína dextrano en jaula y guárdelo en tubos cubiertos de papel de aluminio. A continuación, microinyecte embriones en la etapa de una a dos células con la jaula sintetizada fluoresceína dextrano.

Una vez que los embriones hayan alcanzado la etapa apropiada de desarrollo, cúbralos. A continuación, monte los embriones recubiertos en aeros de bajo punto de fusión para la fotoactivación. Cuando el surgido, se ha solidificado, cargue el software LSM five 10.

Coloque un filtro amarillo transparente en la trayectoria del haz de luz blanca y, a continuación, seleccione escanear nueva imagen y haga clic en iniciar el modo experto. Seleccione la pestaña láser, encienda la plancha de argón y las fuentes láser mi tai. Establece la longitud de onda del mi tai en siete 40 nanómetros.

A continuación, seleccione la pestaña de configuración. Establezca las configuraciones de ruta óptica para el ion argonne y el láser mi tai. A continuación, seleccione la pestaña de escaneo.

Cambia el objetivo a 20 veces 0.8. Establezca la velocidad máxima de escaneo haciendo clic en el método y el número máximos establecidos en la línea media y uno respectivamente, en la pestaña de canales, deseleccione todas las fuentes láser excepto el mi tai. A continuación, coloque un medidor de potencia en la trayectoria del haz óptico y, a continuación, seleccione el botón con para activar el escaneo continuo.

Ajuste el porcentaje de transmisión hasta que el medidor de potencia marque una potencia láser promedio de 47 milivatios. A continuación, detenga el escaneo seleccionando el botón de parada en la pestaña de canales. Anule la selección de la fuente láser mi tai y seleccione la plancha argonne.

A continuación, vuelva a seleccionar el botón XY rápido en la pestaña de canales, ajuste el agujero de alfiler. Detecte la ganancia, amplifique un desplazamiento y vuelva a amplificar para que el láser de hierro Argonne logre la mejor calidad de imagen. Con el controlador de etapa, busque y concéntrese en la celda que desea activar y, a continuación, haga clic en el botón Detener Con la herramienta de recorte, recorte la celda activada para que el factor de recorte en la pestaña de modo muestre de 50 a 70.

A continuación, detenga el escaneo seleccionando el botón de parada en la pestaña de canales. Anule la selección del láser de iones de argonne y seleccione el láser My Tai en la pestaña de modo. Establezca la velocidad de escaneo en 31,46 segundos.

A continuación, seleccione el botón único para iniciar el escaneo de la activación de dos fotones de la fluoresceína dextrano enjaulada de la célula seleccionada. Después de la activación, vaya a la pestaña de canales y ahora anule la selección del láser mi tai y vuelva a seleccionar el láser de iones de argón. Luego, en modo, establezca el factor de zoom en uno. Próximo.

Debajo del encabezado de velocidad, haga clic en el botón máximo para establecer la velocidad de escaneo más rápida. Para revisar la región activada por la foto, seleccione xy rápido. A continuación, seleccione la pestaña de canales y ajuste el agujero de alfiler y vuelva a detectar, compruebe que la región activada por la foto no esté ablacionada con láser.

Después de preparar los embriones fotoactivados para la detección inmunológica de fluoresceína dextrano sin jaula siguiendo el protocolo descrito en el manuscrito adjunto. Lavar los embriones seis veces en PBT y dos veces en tampón AP. A continuación, transfiera los embriones a nueve placas de pocillos en tampón AP.

A continuación, aspire el búfer AP y agregue N-B-T-B-C-I-P. Detenga el desarrollo de la tinción N-B-T-B-C-I-P aspirando la solución N-B-T-B-C-I-P. A continuación, lavar los embriones en PBT.

Ahora recupera los embriones y agítalos en una plataforma giratoria durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, repita el lavado PBT dos veces más. Por último, monte los embriones en aros de bajo punto de fusión al 0,6% y adquiera imágenes de las células fotoactivadas utilizando un microscopio compuesto vertical.

En esta figura, se muestra una imagen de campo claro a la izquierda y una imagen fluorescente a la derecha de un embrión de pez cebra microinyectado con fluoresceína dex en jaula antes de la fotoactivación. Como se muestra aquí, el embrión ha sido fotoactivado en uno de los somitas indicados por la flecha en la figura de campo claro de la izquierda con una longitud de onda de siete 40 nanómetros, un tiempo de escaneo de 31 segundos y una potencia láser promedio de 47 milivatios. En la figura de la derecha, se puede observar la fluorescencia posterior a la fotoactivación de la fluoresceína dextrano sin jaula.

La tinción inmunitaria de fluoresceína dextrano no enjaulada se representa en una pequeña región en la placa lateral, mesodermo de un 10. Por lo tanto, el embrión en etapa de ácaros fue fotoactivado utilizando los mismos parámetros láser que en la figura anterior utilizando el procedimiento de inmunodetección. La región activada como se indica aquí con la flecha, se puede identificar con una tinción de fondo mínima siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar análisis adicionales, como la tinción inmunológica para diferentes marcadores específicos de tejidos, con el fin de caracterizar mejor la ubicación y el destino de las células marcadas. El uso de esta técnica, allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología vascular estudien el origen de las células progenitoras arteriales en venosas en embriones de pez cebra en desarrollo. No olvide que cuando se trabaja con reactivos químicos como NBT y BCIP, pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben usar guantes.