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Tome un plato de imágenes con fondo de vidrio que contenga neuronas corticales embrionarias de ratón.
Coloque el plato dentro de la cámara ambiental de un microscopio de contraste de interferencia diferencial, o DIC, para mantener la viabilidad celular durante la obtención de imágenes.
La microscopía DIC divide la luz polarizada en dos haces que atraviesan la muestra.
Las variaciones en el índice de refracción a través de la muestra introducen cambios de fase entre estos haces.
Cuando los haces se recombinan, su interferencia genera una imagen de alto contraste, haciendo visibles estructuras celulares más finas.
Identifique neuronas con axones no ramificados y utilice imágenes de lapso de tiempo para visualizar la ramificación axonal.
Tratar con netrina-1, una señal de guía extracelular que se une a los receptores axonales y desencadena la exocitosis localizada.
Las vesículas exocíticas entregan componentes de membrana a los sitios mientras el citoesqueleto se reorganiza para apoyar la expansión de la membrana.
Bajo el microscopio, estos cambios aparecen como pequeñas protuberancias, marcando el inicio de la ramificación axonal.
Con el tiempo, estas protuberancias se convierten en ramas axonales maduras, lo que ilustra el proceso dinámico del desarrollo neuronal.
A los dos días in vitro, coloque el plato de imágenes con fondo de vidrio que contiene neuronas no transfectadas en una cámara ambiental húmeda precalentada. Utilice un microscopio equipado con un apocromático plano de 60x, una lente de objetivo DIC de 1,4 NA y un condensador de alta apertura numérica para obtener la mejor calidad y resolución de imagen. A continuación, con iluminación de luz transmitida, ajuste el plano focal para encontrar neuronas a través de los oculares.
Para las imágenes DIC de la ramificación de axones, la configuración adecuada de la iluminación más fría será integral para la optimización de la imagen y es fundamental para producir resultados analizables. Luego, con las neuronas de interés dentro del campo de visión, use la función de adquisición de múltiples áreas en el software de imágenes para encontrar y guardar las ubicaciones XYZ de al menos seis células. Ahora, agregue una concentración final de 250 nanogramos por mililitro de netrina-1 u otro factor de interés para estimular las células y presione Iniciar adquisición de áreas múltiples.
Secuencialmente, adquiera imágenes en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, pausando la adquisición y reenfocando según sea necesario. Dentro del software de imágenes, revise las imágenes eligiendo App, Review Multi-Dimensional Data y abra el archivo deseado. Identifique las ramas axonales estables que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de región de trazado para medir una rama de axón estable desde la base del axón hasta la punta.