Obtención de imágenes de transitorios rápidos de calcio en terminaciones nerviosas de ratón mediante microscopía confocal

Comience con una cámara experimental recubierta de elastómero de silicona que contenga un músculo de ratón asegurado colocado bajo un microscopio confocal.

El músculo se sumerge en una solución fisiológica que contiene inhibidores que bloquean las contracciones musculares.

El muñón nervioso marcado con un tinte de calcio fluorescente se coloca dentro del electrodo de succión, que está conectado a un estimulador eléctrico.

En la unión neuromuscular, el nervio periférico está conectado al músculo.

Aplique un estímulo eléctrico al nervio usando el electrodo. Esto desencadena una rápida afluencia de iones de calcio que se unen al colorante de calcio intracelular.

Iluminar la unión neuromuscular para excitar el tinte de calcio, haciendo que sea fluorescente.

Luego, capture imágenes de alta resolución para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas.

Seleccione la región de interés y mida la intensidad de fluorescencia.

Un rápido aumento en la intensidad de la fluorescencia indica una entrada de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas, mientras que una disminución refleja la eliminación de calcio.

Llene el sistema de perfusión con la solución de Ringer que contiene 10 D-tubocurarina micromolar y encienda la bomba de succión de perfusión para iniciar la perfusión. En el microscopio confocal de barrido láser, o software LSCM, elija el modo de electrofisiología y adquisición para establecer los parámetros de imagen. En la configuración del menú Trabajo, seleccione la configuración de Disparador para activar el estimulador con el pulso de sincronización del microscopio y configure el campo Disparador de salida en el marco en el canal OUT 1.

Cambie el modo de escaneo a xyt a una frecuencia de escaneo de 1,400 Hertz. El factor de zoom debe ser 6.1 con el orificio completamente abierto. Asegúrese de que el modo x bidireccional de transpaso secuencial esté activado. A continuación, establezca el tiempo mínimo para formar un fotograma en 52 milisegundos y recopile fotogramas en un vídeo sin procesar a 20 fotogramas. Establezca la longitud de onda de excitación del láser de argón en 488 nanómetros, con un 8% de potencia de salida.

Cuando se establezcan los parámetros, presione el botón Modo en vivo para obtener una vista previa en vivo de las terminales nerviosas cargadas con el tinte. En el modo en vivo, busque la región de interés, o ROI, para obtener el mejor enfoque, luego cambie el retraso en el estimulador en 2 milisegundos menos en relación con el valor anterior. Y ejecute el software de adquisición de datos para adquirir 26 secuencias cambiando cada secuencia dos milisegundos de la anterior.