Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio
1 de octubre de 2007
Demostramos un método sencillo para colocar las células en los puntos deseados en un substrato. Este método de los patrones de las células al lanzar un chip de silicona que contiene micropocillos llena de células en el sustrato. Este método ofrece una nueva forma de modular la señalización difusibles y juxtacrine entre las células.
Soy Nickel Mital. Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Bowman. Hoy voy a hablar sobre un dispositivo desarrollado por dos antiguos estudiantes de nuestro laboratorio, que se llama biochip flip.
Y este dispositivo permite la entrega de células sobre un sustrato de elección del experimentador, en una configuración también elegida por el experimentador. Así, el dispositivo en sí, tenemos uno aquí, es muy sencillo. Básicamente consiste en pequeños pozos en un trozo de silicona.
Cada pocillo está diseñado habitualmente para alojar solo una célula, pero si es necesario, por supuesto, podemos hacerlos más grandes. La fabricación del dispositivo se realiza de manera que los pocillos tengan la misma disposición que las células tendrán finalmente sobre el sustrato. Así, el dispositivo mismo se fabrica utilizando litografía suave.
En particular, utilizamos PDMS, que es poli(dimetilsiloxano), y lo moldeamos a partir de una oblea de silicio. Tenemos una aquí. La oblea moldeadora en sí se fabrica mediante litografía fotográfica estándar para crear un patrón en una resistencia fotográfica SUA, que se deposita por centrifugación sobre la oblea de silicio.
Entonces, en resumen, las células se transfieren al sustrato elegido llenando básicamente los pocillos del chip bio flip con estas células. Luego aplicamos el chip al sustrato deseado, a menudo un cultivo celular de poliestireno. Y finalmente, invertimos el conjunto, permitiendo que las células salgan de los pocillos y caigan sobre el sustrato.
Soy Stephanie Flavin. Soy investigadora pregrado en el laboratorio Goldman, y hoy demostraré cómo usar el biochip de inversión para sembrar células el día anterior. Queremos realizar un experimento de patrones.
Vamos a unir por plasma el PDMS a una placa de vidrio de una pulgada por una pulgada. Luego, sumergiremos el chip durante toda la noche, con el lado del pocillo hacia abajo, en una solución de PBS. También cortaremos juntas que se utilizarán en el experimento de patrones y recopilaremos pinzas de sujetar que se usarán asimismo.
Aplique 200 microlitros de BSA sobre la superficie de cada chip. Agite suavemente la superficie del chip con la punta de pipeta para eliminar burbujas y permitir que la solución de BSA llene los pocillos. Deje los chips reposar bajo la campana durante una hora bajo luz ultravioleta en las celdas de paso como es habitual.
Transcurrida una hora, aspire la solución de albúmina sérica bovina (BSA) de las placas y enjuague cada placa con 200 microlitros de tampón fosfato salino (PBS). Aplique 200 microlitros de solución de células de paso a una densidad de 10⁶ células por mililitro. Después de esperar entre cinco y diez minutos para que las células caigan en los pozos, enjuague la superficie de la placa con PBS. Incline la placa hacia una esquina aproximadamente a un ángulo de 15 grados y retire lentamente la solución celular mediante pipeta desde la esquina inferior de la placa.
Devuelva el chip a nivel y agregue lentamente 50 microlitros de PBS a la esquina superior. Repita el paso de lavado tantas veces como sea necesario. Una vez que se hayan eliminado las xls de la superficie del chip, agregue aproximadamente 50 microlitros de medio al empaque interno del recipiente.
Agregue medio en la parte superior de cada chip. A continuación, invierta el plato e inclínelo y bájelo hacia la superficie del chip, comenzando por una esquina. Luego, aplane el plato sobre el chip de manera que se evite la formación de burbujas entre el plato y el chip.
Agregue clips sujetadores a cada lado del chip para asegurarlo en su lugar. Retire las manijas de cada clip sujetador para que, cuando se invierta el chip, este quede nivelado sobre el recipiente; mueva el chip al incubador e inviértalo rápidamente, evitando todo movimiento innecesario.
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Descripción general
Este estudio presenta un método novedoso para posicionar células sobre un sustrato utilizando un dispositivo denominado biochip de inversión. Al invertir un chip de silicona con micropocillos cargados con células sobre el sustrato, los investigadores pueden controlar eficazmente la colocación celular, mejorando así la modulación de la señalización entre células.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Neurociencia
- Bioingeniería
Antecedentes
- La posición celular es crucial para estudiar las interacciones celulares.
- Los métodos actuales pueden carecer de precisión en la colocación de células.
- El biochip flip ofrece una solución sencilla y eficaz.
- Esta técnica puede influir tanto en la señalización difusible como en la juxtacrina.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la colocación de células sobre sustratos.
- Profundizar en el entendimiento de los mecanismos de señalización celular.
- Proporcionar una herramienta para investigadores en diversos campos biológicos.
Métodos Utilizados
- Diseño y fabricación del biochip inverso.
- Llenado de micropozos con células.
- Volteo del chip sobre el sustrato deseado.
- Observación y análisis de la colocación celular y la señalización.
Resultados Principales
- Colocación exitosa de células en ubicaciones específicas.
- Mejora en la modulación de la señalización celular.
- Demuestra la facilidad de uso del dispositivo.
- Aplicaciones potenciales en diversos montajes experimentales.
Conclusiones
- El biochip inverso es una herramienta innovadora para la colocación de células.
- Este método puede tener un impacto significativo en los estudios de señalización celular.
- La investigación futura puede ampliar esta técnica para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El control espacial preciso de poblaciones celulares permite la interrogación mecanicista de vías de señalización difusibles y juxtacrinas, fundamentales para la validación de dianas en modelos de enfermedades basados en células madre. El Bio Flip Chip proporciona un método independiente del sustrato y que preserva la química para configurar microentornos celulares definidos, facilitando el desarrollo reproducible de ensayos para cribado fenotípico. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al reducir la variabilidad en el contacto célula-célula y en la exposición a factores paracrinos, mejorando así la continuidad traslacional desde modelos in vitro hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite probar hipótesis sobre cómo la densidad celular localizada y la disposición espacial influyen en las vías de diferenciación y autorrenovación de las células madre.
- Valor operativo: Elimina la variabilidad estocástica derivada de la siembra aleatoria, asegurando entradas consistentes de señales juxtacrinas y paracrinas en todos los réplicas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al aislar la contribución de la señalización dependiente del contacto frente a la señalización soluble en estudios de interacción con el blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera matrices celulares cuantificables y espacialmente definidas compatibles con imágenes de alto contenido y lecturas multiplexadas.
- Valor operativo: Permite la estandarización de ensayos de interacción célula-célula en policarbonato para cultivo de tejidos, vidrio, Matrigel y capas de alimentación sin alterar la química del sustrato.
- Escalabilidad: Compatible con la impresión por microcontacto para crear patrones de matriz extracelular, lo que permite un control combinatorio de las señales de adhesión y señalización.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Organiza células madre embrionarias en nichos definidos para modelar vías de señalización del desarrollo relevantes para trastornos congénitos y medicina regenerativa.
- Modelado Preclínico: Facilita el análisis de la relación dosis-respuesta de morfógenos o terapéuticos en microentornos espacialmente controlados, mejorando la relevancia fisiológica.
- Avance Ajustado al Riesgo: Reduce los falsos positivos en la identificación de compuestos activos al minimizar el ruido proveniente de la agregación celular no controlada o de la frecuencia variable de contacto.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El Bio Flip Chip se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir el patrón reproducible de células madre antes de la exposición al compuesto, apoyando la selección basada en hipótesis y el seguimiento mecanicista en la optimización de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa cómo la organización espacial definida de las células madre embrionarias modula la especificación de linajes y la actividad de vías.
- Tamizaje: Proporciona sustratos celulares estandarizados y reproducibles para evaluar los efectos de compuestos sobre señales dependientes del contacto y señales difusibles.
- Análisis: Permite la cartografía espacial cuantitativa de la expresión de marcadores, la proliferación y la apoptosis como variables dependientes en co-cultivos con patrones definidos.
- Investigación Traducional: Modela cascadas de señalización del desarrollo humano en sistemas con control espacial para orientar la selección de dianas en fases preclínicas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma modular de patrones adaptable a múltiples tipos celulares, sustratos y configuraciones de matriz extracelular en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir el ruido biológico proveniente de interacciones célula-célula no controladas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad del ensayo mediante una colocación precisa de las células definida por el usuario, independiente de la variabilidad en las técnicas de siembra.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al aumentar la relación señal-ruido en cribados fenotípicos dirigidos a la comunicación intercelular.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de moduladores de vías juxtacrinas (por ejemplo, Notch, Wnt) en áreas de enfermedades mediadas por células madre.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en litografía suave y manipulación de PDMS para la fabricación o adquisición del chip.
- Depende del acceso a equipos de enlace por plasma y tratamiento con UV/ozono para la preparación del sustrato.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación y lavado de células para garantizar una carga y liberación eficientes en los pocillos.
- La adaptación a matrices 3D o sistemas microfluídicos puede requerir la optimización del momento del volteo y de la energía superficial.
- Limitación práctica: La ocupación de los pocillos debe determinarse empíricamente para cada tipo y tamaño celular, a fin de evitar la carga múltiple en pocillos diseñados para una sola célula.
