De corte de carga: una herramienta útil para examinar el grado de acoplamiento Marcador brecha unión entre las neuronas retinianas
12 de enero de 2012
Un método sencillo y práctico para determinar el grado de acoplamiento marcador brecha unión entre neuronas de la retina se describe. Esta técnica le permite a uno para investigar la función de las sinapsis eléctricas entre las neuronas de la retina intacta bajo condiciones de iluminación diferentes y en diferentes momentos del día y de noche.
El objetivo general del siguiente experimento de carga de corte es examinar el alcance del acoplamiento del trazador de unión gap entre las neuronas de la retina intacta en condiciones de iluminación controlada. El primer paso se logra cortando las retinas con una cuchilla afilada sumergida en una solución de neurobiotina, una molécula trazadora que puede difundirse a través de los canales de unión abiertos, pero no a las membranas celulares. En el segundo paso, las retinas se incuban en la solución del timbre, lo que permite la difusión del trazador a través de canales de unión de espacio abierto.
Si el acoplamiento de la unión gap es débil, la fluorescencia de la neurobiotina se restringirá a las neuronas de la retina que estén cerca del corte. Por el contrario, si el acoplamiento de la unión gap es fuerte, la fluorescencia se detectará en las neuronas de la retina alejadas del corte. La principal ventaja de la carga de corte sobre las técnicas existentes es que es más fácil de realizar en neuronas con cuerpos celulares pequeños en tejido retiniano neural intacto.
También es más fácil controlar las condiciones de iluminación durante la carga de corte que durante un estudio electrofisiológico de neuronas individuales en tejido retiniano intacto. Debido a que los estímulos de luz utilizados durante el registro eléctrico pueden conducir a cambios en el acoplamiento de la unión de brecha, la demostración de la técnica será del Dr. Chu Choi, un postdoctorado de mi laboratorio. En este procedimiento, un pez dorado se mantiene en oscuridad constante durante el día durante al menos una hora antes de la cirugía, y todos los pasos siguientes hasta que se fija el tejido de la retina, también se realizan durante el día en oscuridad constante, anestesia profundamente al pez dorado agregando 150 miligramos por litro de sulfonato de metano al agua del acuario.
Luego, sacrifique el pez dorado de acuerdo con las pautas federales y universitarias y retire sus globos oculares con cuidado. A continuación, retire la porción anterior de cada globo ocular. A continuación, coloque un trozo de papel de filtro en la parte posterior del ojo e invierta el papel de filtro y el ojo de modo que el papel de filtro quede por debajo de la parte posterior del ojo.
Ahora, retire suavemente la parte posterior del ojo, incluida la esclerótica y el epitelio pigmentario del pez dorado adaptado a la oscuridad. La retina corta el nervio óptico con unas tijeras finas. El pez dorado neural, con el fotorreceptor orientado a la retina hacia arriba, ahora debe estar unido al papel de filtro antes de la enucleación, mientras que el pez se somete a anestesia a cinco mililitros oxigenada por una solución de ringer a base de carbonato con o sin fármaco de prueba en cada pocillo de una placa de seis pocillos después de la disección de la retina neural intacta de la porción posterior del ojo.
Transfiere las retinas a los pozos durante la oscuridad constante. A continuación, selle los pocillos con paraform y deje incubar el tejido durante 30 minutos. Prepare 100 microlitros de solución trazadora disolviendo la neurobiotina al 0,5% en la solución de ringer inmediatamente antes de cortar la retina.
A continuación, agregue la solución de neuro biotina a una placa de Petri de vidrio. A continuación, golpee suavemente el papel de filtro al que está unida la retina sobre una toalla de papel. Para eliminar el exceso de timbres, sumerja una cuchilla de afeitar en la solución de neurobiotina y haga un corte radial perpendicular a través de la retina y el papel de filtro.
Después de eso, sumerja la hoja de afeitar en la solución de neurobiotina nuevamente y corte la retina por segunda vez. Repite esto hasta cuatro cortes por retina. En este paso, transfiera la retina a timbres frescos, medio con o sin fármaco de prueba durante 15 minutos para permitir la carga y difusión.
Lávelo tres veces con timbres frescos, medio con o sin medicamento de prueba durante cinco minutos cada uno. A continuación, fije la retina con un 4% de formaldehído en una solución tampón de fosfato 0,1 molar a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, lavar la retina con PBS 0,1 molar durante toda la noche a cuatro grados centígrados colocándola en un refrigerador al día siguiente.
Reaccione la retina con 2% de estreptavidina Alexa 4 88 en PBS 0,1 molar y Triton X 100 al 0,3% a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incubado durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente. Lave la retina tres veces con PBS 0.1 molar a temperatura ambiente cada vez durante 10 minutos.
Separe la retina del papel de filtro en PBS. Luego, con un pincel fino, monte el lado del fotorreceptor de la retina hacia arriba en un portaobjetos con medio de montaje de escudo vectorial. Transfiera el portaobjetos a un microscopio confocal de barrido láser y tome imágenes con el mismo aumento, resolución y configuración para cada condición experimental, de modo que se puedan mostrar comparaciones de los efectos de diferentes condiciones experimentales en el alcance del acoplamiento del trazador funcional de la brecha.
Este es el grado de acoplamiento de los trazadores de células fotorreceptoras durante el día en oscuridad constante en comparación con durante el día en oscuridad constante en presencia de un antagonista selectivo de los receptores de dopamina D dos. Tenga en cuenta que el corte de la navaja en ambas imágenes está a la izquierda. Aunque una sola imagen puede contener todas las celdas etiquetadas, se recomienda que una recoja una pila Z del área de interés y la contraiga en una sola imagen que se muestra.
Aquí está el alcance del acoplamiento de los trazadores de células fotorreceptoras a medida que uno se mueve secuencialmente a través de un Zack de este tipo. Tenga en cuenta que el corte de la navaja en esta imagen está a la derecha. Para cuantificar el alcance del acoplamiento del trazador en el navegador de imágenes LSM, abra la imagen, luego haga clic en exportar y guarde la imagen como un archivo TIF de 16 bits no comprimido Se debe incluir una barra de escala en esta imagen TIFF utilizando el software NIH image J.
Mida la intensidad de fluorescencia de la neurobiotina marcada con Alexa 4 88 a partir de imágenes de bajo aumento de retinas montadas en orificios. Abra el archivo TIFF con el software Image J y luego dibuje una línea recta correspondiente a la barra de escala. A continuación, vaya a analizar, establezca la escala e ingrese la distancia conocida y la unidad de longitud.
A continuación, haga clic en Aceptar. Ahora las mediciones de fluorescencia se pueden presentar en unidades calibradas como milímetros. A continuación, seleccione el área de interés con la herramienta de selección rectangular.
El pico de fluorescente debe colocarse en el borde izquierdo de su selección. Asegúrese de que no haya señal fluorescente cerca del borde derecho. Haga clic en analizar y trazar el perfil para los datos de control diurno obtenidos en oscuridad constante.
Una curva con un decaimiento exponencial se muestra de izquierda a derecha. A continuación, haga clic en copiar en la ventana emergente y péguelo en Excel. Ahora hay dos columnas, una que muestra la distancia desde el corte y la otra que muestra la intensidad de fluorescencia en función de la distancia desde el corte.
A modo de comparación, los pasos anteriores se repiten con datos obtenidos en oscuridad constante durante el día. En presencia de escupitajo, divida cada valor de fluorescencia bruto por el valor de fluorescencia máximo para obtener la intensidad de fluorescencia relativa. Copie dos columnas correspondientes a la distancia desde el corte y la intensidad de fluorescencia relativa, y luego péguelas en el software de origen.
Estos pasos se muestran tanto para el control diurno como para el asador diurno. Los datos de ejecución en este punto ajustan los resultados con el decaimiento exponencial. Función número uno, compare los valores de las constantes del espacio en diferentes condiciones experimentales utilizando una prueba T o Inova.
Se muestran las funciones exponenciales y los análisis estadísticos de los datos de control diurno, pip rone diurno y control nocturno para su comparación. Mostrado. Aquí hay ejemplos del grado de acoplamiento de los trazadores de células fotorreceptoras en la retina oscura adaptada de los peces dorados en el día A, la noche B, y en el día en presencia de un antagonista selectivo de dos receptores de dopamina D, según lo revelado por la técnica de carga de corte. Todas las imágenes confocales se tomaron utilizando la misma configuración para la comparación.
En este gráfico, la intensidad de fluorescencia para tres condiciones experimentales se representa en función de la distancia desde el corte y se ajusta mediante la función exponencial. La técnica de carga de corte se utiliza para cuantificar el alcance del acoplamiento del trazador de unión de brecha mediante el cálculo de valores constantes del espacio como se muestra aquí para tres condiciones experimentales. La técnica de carga de corte también se puede utilizar para investigar las sinapsis eléctricas entre otros tipos de células en la retina y en otras especies.
Por ejemplo, estas dos figuras ilustran que las células horizontales de conejo, tipo A y tipo B, exhiben acoplamiento de trazador homólogo en el seguimiento, la carga de corte y la difusión de neurobiotina en condiciones oscuras adaptadas. Hemos utilizado la técnica de carga de corte para estudiar el grado de difusión del trazador a través de las uniones entre varillas y conos durante el día y la noche. Además, esta técnica se puede utilizar para determinar si el acoplamiento de trazadores entre otras neuronas de la retina está controlado por el reloj de la retina y/o por condiciones específicas de luz y oscuridad.
También se puede utilizar para estudiar el acoplamiento de trazadores entre neuronas en otras regiones del cerebro.
Visión general
Este artículo describe un método para determinar el alcance del acoplamiento del trazador de unión gap entre las neuronas de la retina. La técnica permite la investigación de las sinapsis eléctricas en la retina intacta bajo diversas condiciones de iluminación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología retinal
- Comunicación celular
Antecedentes
- Las uniones gap facilitan la comunicación entre neuronas.
- Entender el acoplamiento del trazador puede revelar información sobre la función neuronal.
- Los métodos existentes pueden ser desafiantes para cuerpos celulares pequeños en tejidos intactos.
- Las condiciones de iluminación pueden afectar el acoplamiento de las uniones gap.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método conveniente para evaluar el acoplamiento de unión gap.
- Investigar los efectos de la iluminación en las sinapsis eléctricas en las neuronas de la retina.
- Mejorar las técnicas existentes para estudiar estructuras neuronales pequeñas.
Métodos utilizados
- Las retinas se cortan y se cargan con trazador de neuro biotina.
- La incubación en solución de Ringer permite la difusión del trazador.
- Se analiza la fluorescencia para evaluar la fuerza del acoplamiento.
- Las condiciones experimentales se controlan para minimizar influencias externas.
Principales resultados
- La intensidad de la fluorescencia indica el alcance del acoplamiento del trazador.
- Los resultados varían según las condiciones de iluminación y la hora del día.
- Se demuestra que la carga de corte es efectiva para estructuras neuronales pequeñas.
- Se facilita el análisis comparativo entre diferentes configuraciones experimentales.
Conclusiones
- El método de carga de corte es una herramienta valiosa para estudiar las neuronas de la retina.
- Las condiciones de iluminación impactan significativamente el acoplamiento de las uniones gap.
- Esta técnica puede mejorar nuestra comprensión de la comunicación neuronal.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Assessing gap junction-mediated communication in retinal neurons supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling mechanistic de-risking of synaptic modulators. The cut-loading technique provides quantitative, spatially resolved tracer diffusion data under controlled illumination, improving predictive confidence in early-stage target engagement studies. This approach addresses a key technical barrier in studying small neuronal structures in intact tissue, facilitating reproducible assay development for pathway clarification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying gap junction tracer coupling as a functional readout of electrical synaptic strength.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized tracer diffusion measurements that clarify target modulation by neurotransmitters or drugs.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative space constant values that reflect coupling efficacy across experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (intact retinas) with gap junction permeability suitable for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized tracer loading and diffusion protocols under constant darkness, reducing variability from light-induced conductance changes.
- Quantitative Output: Produces fluorescence intensity profiles that can be normalized and fitted to exponential decay models for inter-condition comparison.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports investigation of retinal circadian regulation of gap junctions, a mechanism relevant to visual processing disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical continuity by enabling consistent assessment of tracer coupling across light/dark conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on modulator effects (e.g., D2 receptor antagonists) to inform go/no-go progression based on target engagement evidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of gap junction modulators prior to lead identification, with outputs directly informing target confidence and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the effect of illumination and pharmacological agents on tracer diffusion through gap junctions.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable tracer diffusion, supporting reliable evaluation of compound effects on neuronal coupling.
- Analytics: Generates calibrated fluorescence intensity and space constant measurements that allow statistical comparison (e.g., T-test) of coupling strength across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling assessment of tracer coupling regulation by retinal clock and light/dark cycles, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying gap junction coupling across retinal neuron types and species, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in electrical synaptic communication.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled illumination and standardized tracer loading procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on quantitative target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing empirical data on modulator effects across temporal and pharmacological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, tracer handling, and fluorescence microscopy under controlled darkness.
- Dependent on instrumentation for microcutting, incubation, confocal imaging, and fluorescence quantification (e.g., ImageJ, Origin).
- Necessitates cross-team standardization of illumination protocols, tracer concentration, and cut depth to ensure reproducible coupling measurements.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other neuronal systems or species with varying tissue thickness and gap junction permeability.
- Practical limitations include the need for permeable tracers like neuro biotin and the inability to assess non-tracer-coupled electrical synapses directly.
