Entrega intranasal de ARNip al cerebro del ratón mediante un dispositivo de posicionamiento

Comience con ratones anestesiados colocados en un dispositivo de posicionamiento con la espalda paralela al respaldo de la silla y perpendicular al asiento.

Los ratones se colocan en una postura de cabeza hacia abajo y hacia adelante y se aseguran con cinturones de silla.

Usando una micropipeta cargada con un complejo péptido-ARNip dirigido a neuronas, coloque una gota cerca de una fosa nasal, permitiendo que el ratón inhale la solución de forma natural.

Presione suavemente la cabeza del ratón hacia abajo durante la inhalación para evitar que la solución drene hacia los pulmones.

Haga una breve pausa y luego repita la administración en la otra fosa nasal.

Repita el procedimiento para los ratones restantes.

El complejo penetra en la mucosa nasal, desde donde ingresa a los nervios olfativo y trigémino y viaja a través de ellos para llegar al cerebro.

Dentro del cerebro, el complejo se une a los receptores neuronales, sufre endocitosis y facilita la administración intracelular de ARNip.

El ARNip se convierte en parte del complejo RISC, que, al unirse al ARNm diana, induce el silenciamiento génico.

Para comenzar este procedimiento, evalúe el nivel de anestesia del reflejo bípedo de los ratones para mantener el plano quirúrgico. A continuación, coloque el dispositivo de posicionamiento a una distancia y altura adecuadas para permitir un acceso conveniente a todos los reactivos necesarios.

Luego aplique ungüento en los ojos del animal. Sujete a un ratón con cinturones de silla, asegurándose de que las extremidades delanteras del ratón proporcionen un apoyo natural mientras está en una posición relajada sin ninguna molestia. Repita los procedimientos para los ratones restantes. Coloque suavemente cada ratón en la silla designada colocando su respaldo paralelo al respaldo de la silla y a 90 grados del asiento de la silla.

Deje que el animal se acueste naturalmente en la posición de cabeza hacia abajo y hacia adelante sin empujar ni presionar. Una vez que todos los ratones estén atados, comience inmediatamente la inoculación intranasal. Para realizar la administración intranasal, cargue la micropipeta con 2 microlitros de solución compleja RVG9R-siRNA. Sostenga la pipeta en la mano dominante y apóyela con la otra mano para evitar movimientos incontrolados mientras administra ARNip.

Coloque aproximadamente una gota de 2 microlitros muy cerca de una fosa nasal para que el ratón pueda inhalarla directamente. Si no se forma fácilmente una pequeña gota, sustituya la punta de la pipeta por una nueva y repita la operación. Empuje suavemente la cabeza del mouse hacia abajo con el dedo índice durante 5 segundos mientras inhala y mantenga la posición.

Para evitar el drenaje del fármaco hacia los pulmones, es importante empujar ligeramente la cabeza del ratón hacia abajo con el dedo índice durante 5 segundos mientras el ratón inhala.

Inicie un cronómetro para cronometrar tres o cuatro minutos después de esto para cronometrar la inoculación en la segunda nariz del primer ratón. Este intervalo de tiempo es necesario para que el ratón complete la inhalación de la primera dosis y restablezca la respiración normal. En el intervalo de tres a cuatro minutos entre la inoculación de narinas alternas en el primer ratón, la inoculación intranasal completa de una narina en cada uno de los tres ratones restantes colocados en el dispositivo.

Cuando suene el cronómetro, inocule la segunda fosa nasal al primer ratón y repita el procedimiento para los otros ratones como se indicó anteriormente. Repita el procedimiento hasta que se administren los 20 a 30 microlitros para los cuatro ratones. Tomará entre 30 y 45 minutos completar todo el procedimiento de inoculación. Devuelva a los animales a sus jaulas designadas. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.