Name: Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Aprende a expandir células T γδ de sangre periférica humana mediante zoledronato e IL-2 para inmunoterapia autóloga contra el cáncer. Este método clínicamente aplicable permite obtener poblaciones celulares funcionales en 14 días.

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1. Aislamiento de PBMC <ol><li> Extracción de sangre (7,5-8,0 ml) en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica. El tubo contiene un anticoagulante con heparina sódica y un fluido de densidad de Ficoll-Hypaque, además de una barrera de gel de poliéster, que separa los dos líquidos. Tubo de centrífuga / muestra de sangre a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) en un rotor horizontal (se gira hacia fuera de la cabeza) durante 20 minutos a 1800 x g. Interruptor de centrífuga de los frenos. </li><li> Después de la centrifugación, la secuencia de capas se produce de la siguiente manera (visto desde arriba a abajo): un plasma) - b) las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y plaquetas - c) la densidad de la solución - d) de gel de poliéster - e) granulocitos - f) glóbulos rojos (Fig. 1). </li><li> Recoger una fracción de la capa de plasma, dejando 5 a 10 mm de plasma por encima de la interfase sin alterar la capa de células. El plasma puede ser utilizado para el cultivo (sección 2.5). </li><li> Cosecha de la fracción enriquecida (CMSP) en la interfase con una pipeta y transferir a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Lave la PBMC con 10 ml de tampón fosfato salino (PBS), invirtiendo el tubo cinco veces, y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Repita los pasos de lavado dos veces, y luego volver a suspender el pellet de células en 5 ml de PBS. Determinar el número de células. Por lo general, 1,3 x 10 6 células se recuperan de 1 ml de sangre total. </li><li> Determinar la frecuencia y el fenotipo de las células T γδ en PBMC por citometría de flujo (sección 3) (Fig. 2). </li></ol> 2. La expansión de las células T γδ <ol><li> Centrifugar las suspensiones de células en 15 ml tubos cónicos durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante. </li><li> Preparar medio de cultivo (CM) mediante la adición de la IL-2 (IL-2) y el zoledronato (Zometa) a concentraciones finales de 1000 UI / ml y M 5, respectivamente. ALyS203 (celular y Ciencia Instituto de Tecnología) o Optmizer (Invitrogen) apoyar la expansión de los medios de comunicación bien de las células T γδ (más información en las referencias 6 y 9). Zometa se suministra en forma líquida (4 mg/5-ml vial). Para preparar una solución de 5 M, se añaden 50 l de Zometa para 30 ml de medio de cultivo. </li><li> Resuspender el sedimento celular en medio de cultivo y se ajustan a 1x10 6 células / ml. </li><li> Pipeta de 1 ml de CM contiene 1x10 6 células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Para las grandes culturas, las células pueden ser sembradas a 0.5 x 10 6 células / cm 2, de acuerdo a las superficies de los pozos de la placa, plato o recipiente. </li><li> Añadir plasma autólogo (sección 1.3), agrupados suero humano AB, o FCS por lo que es aproximadamente el 10% del volumen de la cultura (100 l por cada pocillo de una placa de 24 pocillos). Coloque las placas en un humidificado 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 24-48 horas. </li><li> Mantener el cultivo a una densidad celular de 0,5 a 2 x 10 6 células / ml. Añadir un nuevo soporte de la IL-2 (1000 UI / ml) solamente (sin Zometa) cada 2-3 días, y la transferencia de células cultivadas en pozos nuevos o frascos como sea necesario, de acuerdo con el grado de proliferación celular (Fig. 3). Suministro de plasma o suero al medio de manera que la concentración sérica se puede mantener por lo menos 1%. </li><li> Las células de la cosecha en el día 12-14 y determinar la frecuencia, fenotipo, y las funciones de las células T γδ por citometría de flujo (ver más abajo). </li></ol> 3. El análisis fenotípico por citometría de flujo <ol><li> Transferencia de 200 muestras de l que contiene 2 x 10 5 células de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) tubos. </li><li> Añadir 2 ml de PBS frío y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. A continuación, volver a suspender las pastillas en 50 l de tampón FACS (PBS + 1% FCS + 0,1% de azida de sodio). Añadir 5 l de cada una de las muestras de anticuerpos (los anticuerpos monoclonales se listan en la Tabla 1). </li><li> Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón FACS para cada muestra, y luego vórtice. Centrifugue las muestras durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 300 l de tampón FACS y agitar. Analizar las muestras en un citómetro de flujo (Fig. 2). </li></ol> 4. IFN-γ producción de ensayo de 10 <ol><li> El día antes del ensayo, preparar las células estimulador mediante el cultivo de 3.5 x 10 5 células Daudi / ml en medio RPMI 1640 más el 10% de FCS (RPMI-10) durante la noche con Zometa (5 M) (en adelante designado Z-Daudi). </li><li> Recoger Z-Daudi y resuspender en medio RPMI-10 en 2x10 6 células / ml. Añadir 100 ml de Z-Daudi (2x10 5) a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. </li><li> Prepare las células T γδ en 2x10 6 células / ml en RPMI-10 contiene Brefeldina A a 20 mg / ml. Transferencia de 100 l de suspensión de células T γδ (2x10 5) a cada pocillo que contiene Z-Daudi células o de control de los pozos (100 l de RPMI-10 solamente, o RPMI-10 con 20 ng / ml de forbol 12-miristato 13-acetato[PMA] y 2 mg / ml de ionomicina). </li><li> Mezclar pipeteando arriba y abajo varias veces. Se incuba durante 4 horas en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar la placa durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C y volver a suspender las pastillas en 200 l de PBS frío. </li><li> Transferencia de las muestras a los tubos de FACS. Agregar 4 ml de PBS frío y centrifugar los tubos durante 5 minutos a 400 x g a 4 ° C. </li><li> Resuspender los pellets en 50 l de tampón FACS con FITC-conjugado anti-TCRVγ9 (5 l) y PE/Cy5-conjugated anti-CD3 (2,5 l). Incubar protegido de la luz durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 100 ml de reactivo IntraPrep 1 y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. Agregar 4 ml de PBS a cada tubo y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración y añadir 100 ml de reactivo 2 IntraPrep. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente sin agitación. </li><li> Añadir 5 l de PE-conjugadas anti-IFN-γ MAB para el tubo de ensayo. Incubar protegido de la luz durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Agregar 4 ml de PBS a cada tubo y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender el botón celular en 0,5 ml de tampón FACS. </li><li> Analizar las células por citometría de flujo. Puerta de CD3 + + TCRVγ9 células y examinar la expresión de IFN-γ (Fig. 4). </li></ol> 5. Los resultados representativos: Es importante determinar el porcentaje de células T γδ en PBMC en el inicio de la cultura. Como se muestra en la figura. 2 A, el porcentaje de linfocitos CD3 + TCRVγ9 + células T γδ en PBMC fue del 1,6% en el día 0. Las poblaciones dominantes fueron CD27 + CD45RA + CD27 o ingenuo CD45RA + - fenotipos memoria central. Cuando las células T γδ fueron estimulados de manera eficiente, se formaron grupos en los días 3-5 (Fig. 3 A y B). Cuando la formación de agrupaciones se demoró, el ​​crecimiento de otros tipos de células, como células CD4 + y CD8 + αβ células T o células NK podría dominar el crecimiento de las células T γδ (Fig. 3 C y D). Después de 14 días de cultivo, la frecuencia de las células T γδ aumentó a más del 93,8% de las células cultivadas en el éxito de las culturas de las células T γδ (Fig. 2 E). Los cultivos de células T γδ upregulated NKG2D y expresión de CD69 (Fig. 2 G y H). La exhibición de CD27 - CD45RA - fenotipo efectoras de memoria (Fig. 2 F). Las funciones de las células T γδ fueron evaluados con respecto a la producción de citocinas y citotoxicidad. El IFN-γ intracelular tinción demostrado que las células T γδ produjo IFN-γ en respuesta a PMA / ionomicina tratamiento o células Daudi que Z-IPP acumulado después de un tratamiento zoledronato (Fig. 4). Estos resultados indican que el zoledronato eficiente puede estimular y expandir las células T γδ funcional. <table border="1"><tbody><tr><td> tubo </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> IgG1 de ratón </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> IgG1 de ratón </td><td> IgG1 de ratón </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los anticuerpos monoclonales utilizados en la tinción multicolor de las células T γδ. Un ejemplo del análisis fenotípico de las células T γδ realizado en nuestro laboratorio se muestra en la figura. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Separación de PBMC. Sangre (7,5-8,0 ml) se introduce en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica y directamente se centrifuga durante 20 minutos a 1800 x g. Después de la centrifugación, las capas que resulta como se ve desde arriba a bottom: un Plasma) - b) PBMC y plaquetas - c) Densidad de la solución - d) de gel de poliéster - e) Granulocitos - f) Los glóbulos rojos. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fenotipo de superficie típico de las células T γδ. PBMC fueron estimulados con zoledronato e IL-2 durante 14 días. Las células se tiñeron con FITC anti-TCR Vγ9 y PE/Cy5-labeled anti-CD3 para controlar la expansión de las células T γδ (A y E). Las células T γδ fueron identificados por su expresión de TCRVγ9, y la expresión de CD27 y CD45RA (B y F), NKG2D (C y G), o CD69 (D y H) se examinó. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante γδ cultivos de células T. PBMC fueron estimulados con IL-2 (1000 UI / ml) y el zoledronato (5 M). Campos representativos se muestran (IX71 microscopio invertido [Olympus] x 200). Las agrupaciones y los agregados de células T γδ se puede observar en el día 3 (A) y el día 5 (B), cuando las células T γδ se ampliaron con éxito. Por el contrario, existen grupos o agregados se observaron cuando el crecimiento de células T γδ no era la adecuada (C y D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. IFN-γ producción. γδ células T se incubaron con RPMI-10 sólo (A) o PMA / ionomicina (B) o Z-Daudi (C) durante 4 horas. En primer lugar, la expresión superficial de TCRVγ9 estaba manchada y IFN-γ producción fue examinado por intracelular de IFN-γ tinción. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Cinética de la cultura de las células T γδ. (A) Número absoluto de células en cultivo, (B) el porcentaje de células T γδ, y (C) número absoluto de células T γδ en los puntos de tiempo indicado.

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<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método aquí presentado permite la expansión eficiente de las células T γδ a partir de PBMC. γδ células T activadas y ampliado por zoledronato y la IL-2 desarrollan completar las funciones efectoras, se refleja en la producción de citocinas y citotoxicidad. Se ha informado de que el sintético phosphoantigens pirofosfato bromhidrina (BrHPP) y 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP) también ampliar las células T γδ, sin embargo, no están disponibles comercialmente. En contraste, el zoledronato es que ya tienen licenci...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo nombre </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> Novartis Pharma K. K </td><td></td><td> zoledronato </td></tr><tr><td> Proleukin </td><td> Novartis Pharmaceuticals </td><td></td><td> IL-2 recombinante humana </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Celular preparación del tubo con heparina sódica </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 medianas </td><td> Celular y Ciencia Instituto de Tecnología </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> Optmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> A brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) </td><td> Sigma </td><td> P1585-1mg </td><td></td></tr><tr><td> ionomicina </td><td> Sigma </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD3-FITC o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 humano-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD8-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD14-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD19 humano-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD45 humano-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD56-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano TCRαβ-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano TCR Vγ9-FITC </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD27-PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano CD45RA-ECD </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD69 humano-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> anti-humano NKG2D-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-IFN-PE humal </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1 control de isotipo-PE </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1-ECD control de isotipo o PE/Cy5 </td><td> BECKMAN COULTER </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

expansión de la sangre periférica humana de células t γδ con zoledronato

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Humanos γδ células T pueden reconocer y responder a una amplia variedad de estrés inducido por antígenos, por lo tanto el desarrollo de una amplia actividad innata anti-tumoral y anti-infecciosos. 1 La mayoría de las células γδ T en sangre periférica tienen el receptor de células T Vγ9Vδ2. Estas células reconocen al antígeno en un complejo mayor de histocompatibilidad-de manera independiente y desarrollar una fuerte funciones efectoras citolítica y como Th1-1. Por lo tanto, las células γδ T son células efectoras candidato atractivo para la inmunoterapia del cáncer. Vγ9Vδ2 células T responden a phosphoantigens ejemplo, (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), que se sintetiza en las bacterias a través de la biosíntesis de isoprenoides, 2 y isopentenil pirofosfato (IPP), que se produce en las células eucariotas a través de la vía del mevalonato. 3 En condiciones fisiológicas, la generación de IPP en células no transformadas no es suficiente para la activación de células T γδ. La desregulación de la vía del mevalonato en las células tumorales conduce a la acumulación de la IPP y la activación de las células T γδ. 3 Porque aminobisfosfonatos (como pamidronato o zoledronato) inhiben la farnesil pirofosfato sintetasa (FPPS), la enzima actúa aguas abajo de la IPP en la vía del mevalonato, los niveles intracelulares de IPP y sensitibity a γδ T reconocimiento de las células pueden ser terapéuticamente aumentó aminobisfosfonatos. IPP acumulación es menos eficiente en las células nontransfomred que las células tumorales con una concentración farmacológicamente relevantes de aminobisfosfonatos, que nos permiten la inmunoterapia para el cáncer mediante la activación de las células T γδ con aminobisfosfonatos. 4 Curiosamente, IPP se acumula en los monocitos al PBMC se tratan con aminobisfosfonatos, debido a la eficiente absorción del fármaco por estas células. 5 monocitos que se acumulan IPP ser células presentadoras de antígeno y estimular Vγ9Vδ2 las células T en la sangre periférica. 6 Basado en estos mecanismos, hemos desarrollado una técnica para la expansión a gran escala de cultivos de células T γδ con zoledronato y la interleucina -2 (IL-2). 7 Otros métodos para la expansión de las células T γδ utilizar el sintético de pirofosfato phosphoantigens bromhidrina (BrHPP) 8 o 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP). 9 Todos estos métodos permiten ex la expansión in vivo, lo que resulta en un gran número de células T γδ para su uso en inmunoterapia adoptiva. Sin embargo, sólo el zoledronato es un reactivo aprobado por la FDA disponibles en el mercado. Zoledronato-ampliado las células T γδ pantalla CD27 - CD45RA - fenotipo efectoras de memoria y su función puede ser evaluado por el IFN-γ ensayo de producción de 7.

Un método para expandir las células T γδ a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se describe. PBMC derivados de las células T γδ se estimulan y se expandió con zoledronato y la interleucina 2 (IL-2). La expansión a gran escala de las células T γδ se puede aplicar a la inmunoterapia celular autólogo de cáncer.

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Las células T $\gamma\delta$ humanas pueden reconocer y responder a una amplia variedad de antígenos inducidos por el estrés, desarrollando así una respuesta antitumoral innata y amplia y...

Este video demuestra la expansión a gran escala de linfocitos T gamma delta de sangre periférica humana utilizando zoledronato. Primero, la sangre completa se somete a centrifugación en gradiente de densidad para aislar los monocitos de sangre periférica o PBMC. Los PBMC se estimulan con zoledronato para inducir que los monocitos se conviertan en células presentadoras de antígenos, y también con IL-2 para estimular los linfocitos T gamma delta.Las células se incuban hasta 14 días para proliferar linfocitos T gamma delta. El análisis del cultivo mediante citometría de flujo demuestra que la mayoría de las células recolectadas presentan un fenotipo CD3 positivo Vγ9 positivo. La principal ventaja de esta técnica frente al método existente es que el agente ya está autorizado para aplicaciones clínicas en Zometa.Por lo tanto, un reactivo confiable está fácilmente disponible para la preparación clínica de células T gamma delta, demostrando que el procedimiento será cultivo celular de Makoto Condo y Amichi Izumi. Los técnicos de mi laboratorio inician este procedimiento aislando células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total recolectada en un tubo BD Vacutainer CPT para preparación celular que contiene heparina sódica como anticoagulante, y un líquido de alta densidad fial, además de una barrera de gel de poliéster, que separa los dos líquidos. Centrifugue la muestra a temperatura ambiente en un rotor oscilante horizontal durante 20 minutos a 1800 veces G. Tras la interrupción después de la centrifugación, el contenido del tubo se separará en cinco capas.La capa superior amarilla consiste en plasma. Debajo de esta, una capa blanquecina contiene células mononucleares de la sangre periférica y plaquetas, que se sitúan encima de la solución de densidad amarilla más clara. Una capa de gel de poliéster de color blanco separa esta zona de los sitios granulares, que forman una capa grisácea y se sitúan encima de los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo.Utilizando una pipeta de dos mililitros, recolecte cuidadosamente una fracción de la capa de plasma, dejando entre cinco y diez milímetros de plasma por encima de la interfase, y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo a cuatro grados Celsius para su uso en cultivo. A continuación, utilice una pipeta de dos mililitros para recolectar la fracción enriquecida en PBMC de la interfase y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros.Para lavar los PBMC, agregue 10 mililitros de PBS e invierta el tubo cinco veces. Luego, centrifugue el tubo durante cinco minutos a 400 ×g. Repita los pasos de lavado dos veces. A continuación, después de re-suspender el botón celular en cinco mililitros de PBS, utilice un hemocitómetro para determinar el número de células.Típicamente, se recuperan 1,3 veces 10 a la seis células a partir de un mililitro de sangre total. Se separa una fracción de pbmc que contiene una vez 10 a la seis células y se mantiene en hielo para su análisis mediante citometría de flujo.Para expandir las células T gamma delta en la muestra de PBMC, centrifugar las suspensiones celulares en tubos cónicos de 15 mililitros durante cinco minutos a 400 ×g a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, desechar los sobrenadantes y resuspender las células en medio de cultivo celular, suplementado con 1000 UI por mililitro de IL-2 y 5 micromoles de zoledronato a una densidad de 1 × 10⁶ células por mililitro. El zoledronato inhibe la fosfato sintasa del faril pirofosfato en los monocitos, lo que conduce a la acumulación de pirofosfato de isopentenilo y a la transformación de los monocitos en células presentadoras de antígenos.A continuación, pipetee un mililitro de medio que contenga una vez 10 a la seis células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Las células deben estar a 0,5 veces 10 a la seis por centímetro cuadrado. Por lo tanto, para cultivos más grandes, ajuste la escala proporcionalmente a cada pocillo de una placa de 24 pocillos.Añada 100 microlitros del plasma autólogo recolectado previamente, suero humano AB agrupado o suero bovino fetal. Coloque las placas en una incubadora humectada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono cada dos o tres días. Reemplace el medio con medio fresco suplementado con suero que contenga 1000 UI por mililitro de IL-2 humano.Cuando las células alcancen una densidad de 0,5 a dos veces 10 a la seis células por mililitro, páselas al doble en nuevos pocillos o matraces. Observe las células durante varios días. Aquí se muestran las células en el día cero.Las células más pequeñas son linfocitos. Las células más grandes son monocitos. Aproximadamente 24 horas después, los monocitos se adhieren al fondo del pocillo.Después de dos días, algunos linfocitos se adhieren a los monocitos al tercer día, las células T gamma delta comienzan a formar agrupaciones. Al quinto día, pueden observarse agrupaciones grandes de células. En contraste, no se observarán agrupaciones ni agregados cuando el crecimiento de las células T gamma delta no sea adecuado. Cuando la formación de agrupaciones se retrasa.Como se muestra aquí, el crecimiento de otros tipos de células, como las células T alfa beta CD cuatro positivas o CD ocho positivas o las células NK, domina el crecimiento de las células T gamma delta. En el día 12 a 14, pipetee extensamente las células con una pipeta de 10 mililitros y recolecte las células en tubos cónicos de 50 mililitros. Ahora las células pueden analizarse mediante citometría de flujo para determinar la frecuencia, el fenotipo y las funciones de las células T gamma delta.Para realizar el análisis fenotípico de PBMC o células T gamma delta expandidas, comience transfiriendo muestras de 200 microlitros que contengan dos veces 10 a la quinta células a cada uno de los nueve tubos de citometría de flujo. Añada dos mililitros de PBS frío y centrifugue durante cinco minutos a 400 veces G, luego resuspenda los pellets en 50 microlitros. Añada cinco microlitros de cada uno de los anticuerpos requeridos a las muestras.Incube las muestras sobre hielo, en la oscuridad, durante 20 minutos. Tras la incubación, agregue dos mililitros de tampón fax a cada muestra y luego centrifugue en vórtex durante cinco minutos a 400 ×g a cuatro grados celsius. Después de la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante, re suspenda las células en 300 microlitros de tampón fax y mezcle en vórtex.Luego analice las muestras en un citómetro de flujo para evaluar la función de las células T gamma delta. Su capacidad para producir interferón gamma se analiza mediante tinción intracelular de interferón gamma. Re_suspenda las células T gamma delta a dos veces 10 a la seis células por mililitro en RPMI 10 que contiene felden A a 20 microgramos por mililitro.Felden A inhibe la secreción de interferón gamma, lo que resulta en la acumulación de interferón gamma en la célula. A continuación, transfiera 100 microlitros de la suspensión de células T gamma delta a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de RPMI 10 solamente, o RPMI 10 con 20 nanogramos por mililitro de cuatro. Ball 12 comió 13 acetato más dos microgramos por mililitro de ionomicina o células Z duddy.Mezcle aspirando y dispensando varias veces con la pipeta. Incube durante cuatro horas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Luego, centrifugue la placa durante cinco minutos a 400 ×g a cuatro grados Celsius tras la resuspensión, suspendiendo los pellets en 200 µL de PBS frío.Transfiera las muestras a tubos de fax. Luego, agregue cuatro mililitros de PBS frío y centrifugue los tubos durante cinco minutos a 400 ×g a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, re suspenda los pellets en 50 microlitros de tampón de fax con cinco microlitros.Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz, con 2,5 microlitros de anticuerpo monoclonal anti-CD3 conjugado con PE SCI cinco y anti-TCRV gamma nueve conjugado con FE. Tras la incubación, añadir 100 microlitros del reactivo intra prep uno e incubar durante 15 minutos. A temperatura ambiente, agregar cuatro mililitros de PBS a cada tubo y centrifugar durante cinco minutos a 400 × g a temperatura ambiente; tras la centrifugación, resuspender el sedimento en 100 microlitros del reactivo intra prep dos e incubar durante cinco minutos.A temperatura ambiente, agregue cinco microlitros de anticuerpo monoclonal anti-gamma interferón conjugado con PE al tubo de ensayo. Incube protegido de la luz durante 15 minutos. A temperatura ambiente, agregue cuatro mililitros de PBS a cada tubo y centrifugue durante cinco minutos a 400 × g. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante por aspiración y resuspenda el botón celular.En 0,5 mililitros de tampón fax. Analice las células mediante citometría de flujo, seleccionando las células positivas para CD tres y TCR v gamma nueve positivas, y examine la expresión de interferón gamma. El fenotipo superficial típico de las células T gamma delta se muestra como se indica aquí.Las células T gamma delta se identificaron por su expresión de CD tres y TCRV gamma nueve en el día cero. El porcentaje de células T gamma delta positivas para CD tres y positivas para TCRV gamma nueve en las PBMC fue del 1,6 %. Las poblaciones predominantes de células T gamma delta fueron fenotipos positivos para CD27 y CD45, RA positivos (naïve) o positivos para CD27 y CD45 RA negativos (memoria central). Las expresiones de CD27 y CD45 RA se utilizan para determinar su fenotipo naïve o de memoria.CD 27 positivo. CD 45. RA positivo es naive.CD27 positivo. CD45RA negativo es memoria central CD27 negativo. CD45.RA negativo es memoria efectora. CD27 negativo. CD45.El fenotipo positivo para RA está completamente diferenciado. El estado de activación de las células se analizó mediante NK G 2D o CD 69, como se muestra aquí. Las células T gamma delta expresan NK G 2D, pero no expresan CD 69.Después de 14 días de cultivo, la frecuencia de las células T gamma delta aumentó a más del 93,8 % de las células cultivadas. En cultivos exitosos de células T gamma delta, estas mostraron un fenotipo de memoria efectora CD27 negativo y CD45RA negativo. Las células T gamma delta cultivadas aumentaron la expresión de NKG2D y CD69.La tinción intracelular de interferón gamma demostró que las células T gamma delta produjeron interferón gamma en respuesta al tratamiento con PMA CIN o a las células Z dwy que acumularon IPP. Después del tratamiento con zoledronato, el 97 % y el 19,6 % de las células T gamma delta produjeron interferón gamma en respuesta a la estimulación con PMA CIN y con células Z ddy, respectivamente. Estos resultados indican que el zoledronato puede estimular y expandir eficazmente células T gamma delta funcionales.La cinética de la cultura de células T gamma delta expandidas mediante ácido zoledrónico e IL-2 mostró un aumento exponencial del número absoluto de células cultivadas hasta los días 12 a 14. El enriquecimiento de células T gamma delta se logró relativamente pronto. Casi el 80 % de las células cultivadas eran células T gamma delta al día siete. El número absoluto de células T gamma delta en los puntos de tiempo indicados demuestra que aproximadamente 2,2 × 10⁸ células T gamma delta pueden obtenerse a partir de 1 × 10⁶ PPMC que contienen 1,6 × 10⁴ células T gamma delta tras su desarrollo.Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer exploren aplicaciones clínicas en muchos tipos diferentes de cáncer. Este método de cultivo se ha utilizado en ensayos clínicos de fase uno, evaluando la seguridad y factibilidad de la terapia de transferencia de linfocitos T gamma-delta expandidos a partir de donantes en pacientes con cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Expansión ex vivo de células T tumor-reactiva por medio de la 1/Ionomycin briostatina y la formulación de la cadena gamma común de citoquinas

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

La diferenciación de las células precursoras en osteoclastos está regulada por citocinas y factores de crecimiento. En este trabajo se describe una nueva técnica de transferencia génica para la diferenciación de osteoclastos in vivo y protocolos de cultivo celular para diferenciar células precursoras en osteoclastos in vitro como método para estudiar los efectos de las citocinas en la osteoclastogénesis.

A Novel In vivo Técnica de transferencia de genes y In vitro ensayos basados ​​en células para el estudio de la pérdida ósea en los trastornos musculoesqueléticos

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Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

Aquí, presentamos un protocolo para inducir y puntuar enfermedades en un modelo xenogénico de enfermedad de injerto contra huésped (xenoGVHD). xenoGVHD proporciona un modelo in vivo para estudiar la inmunosupresión de células T humanas. Además, describimos cómo detectar células T humanas en tejidos con PCR digital como herramienta para cuantificar la inmunosupresión.

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Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

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Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

Se presenta un protocolo para la expansión del producto farmacológico de células T Gamma-Delta (γδ). Los linfocitos se aíslan por elutriación y se enriquecen con γδ con ácido zoledrónico e interleucina-2. Las células T alfa-beta se agotan utilizando un dispositivo de separación magnética de grado clínico. Las células γδ se cocultivan con células artificiales presentadoras de antígenos derivadas de K562 y se expanden.

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Los osteoclastos son células clave de reabsorción ósea en el cuerpo. Este protocolo describe un método fiable para la diferenciación in vitro de osteoclastos a partir de monocitos de sangre periférica humana. Este método se puede utilizar como una herramienta importante para comprender mejor la biología de los osteoclastos en la homeostasis y en las enfermedades.

Diferenciación de osteoclastos funcionales de monocitos CD14+ de sangre periférica humana

Aquí, establecimos osteoorganoides in vivo activados por andamios de gelatina cargados con proteína morfogenética ósea 2 para recolectar células madre/progenitoras hematopoyéticas terapéuticas para la reconstrucción de un sistema hematopoyético e inmunológico dañado. En general, este enfoque puede proporcionar una fuente celular prometedora para las terapias celulares.

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