Name: El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprende a aislar células madre hepáticas CD133+ de hígado murino mediante digestión tisular, separación magnética y citometría de flujo. Este método permite la expansión clonal y el análisis funcional de células madre hepáticas.

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Dr. Rountree reconoce el apoyo actual de la red del milagro de la Infancia, Instituto Nacional de Salud, K08DK080928 y R03DK088013, y la Sociedad Americana del Cáncer Premio Académico de Investigación, MGO-11651. Dr. Rountree reconoce que este procedimiento fue desarrollado inicialmente y refinado al mismo tiempo financiado por el Programa de Desarrollo Científico Pediátrico (NICHD concesión de una subvención K12-HD00850).

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li>
<li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li>
<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
<li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li>
<li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li>
<li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li>
<li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor%2Fstem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li>
<li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr. Rountree cuenta con el apoyo de investigación de Bayer Farmacia. Los Dres. Ding y Maleantes y la Sra. Dang y VanKirk señora no tiene revelaciones que informar.

A diferencia del sistema hematopoyético, en la que las células madre hematopoyéticas son responsables de mantener un sistema de diferenciación celular que replacesnormal fisiológicos turn-over de los leucocitos, los glóbulos rojos y las plaquetas, las células madre del hígado, o un adulto las células progenitoras del hígado, no participan en el hígado normal homeostasis. 5,6 Después de la lesión hepática aguda o hepatectomía parcial, los hepatocitos, el epitelio del hígado diferenciada, someterse a varias sesiones de la proliferación de sustituir la masa hepática perdida. 5,6 Sólo en una lesión crónica son células madre del hígado observado la proliferación de 1,5. Estos -11 adultos, las células madre órgano específico se propone diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes. 1,5-8 Curiosamente, la gran mayoría de los cáncer de hígado se desarrolla en el fondo de una lesión crónica, y por lo tanto las células madre del hígado son también la hipótesis de que se los precursores de un subgrupo de cáncer de hígado. 2-4,12-17 Uno de los retos más importantes para detener el trabajo de células en el hígado es el aislamiento de poblaciones raras de células para el análisis funcional. Por ejemplo, la gran mayoría de las células en el hígado son los hepatocitos, que son significativamente mayores que cholangiocytes y otras más pequeñas células no parenquimatosas. Al romper el hígado entero en compartimentos celulares (hepatocitos grandes - fracción del parénquima y células más pequeñas - no parenquimatosas fracción) y, además, la selección de células CD45 negativas (no células hematopoyéticas), somos capaces de enriquecer a la población a partir de células madre por más de 600 veces. 1,18-21 Cabe destacar, que no son en absoluto lo que indica que la población CD133 + es un 100% de la población pura de células madre, pero es evidente que representa una población heterogénea de células, con un linaje diferente y el potencial de repoblación. Una de las principales limitaciones del campo es la definición de las células madre y células progenitoras. Usamos el término &quot;célula madre&quot; de manera más amplia en este trabajo, pero en la definición estricta, CD133 + células no parenquimatosas representan una población de progenitores bi-linaje. Dado el estado de la madre y la investigación actuales progenitor en el hígado, este informe proporciona un punto de partida para los investigadores que estén interesados ​​en este campo. Como marcadores surgen nuevas, como EpCAM 22,23, o factores de transcripción, como Sox9, 24 de ellos se pueden incorporar. Por ejemplo, hemos encontrado un índice bastante alto de solapamiento entre las células EpCAM + y células CD133 +. En este informe, se detalla un proceso de aislamiento de células madre de hígado normal murino, así como la lesión hepática crónica modelos, que demuestran los tallos aumentó la proliferación de células del hígado. Este método tiene claras ventajas sobre técnicas de inmunohistoquímica estándar de hígado congelado o fijado en formol como los estudios funcionales utilizando células vivas se puede realizar después de su aislamiento. 1,3,4 El objetivo específico de este proceso consiste en aislar a una población relativamente pura de células madre del hígado que puede ser ampliado clonal in vitro. La principal limitación de este procedimiento es que la mayoría de las células aisladas no será viable después de la citometría de flujo (véase la sección Solución de problemas). Este es el resultado de las horas necesarias para preparar las células, y los numerosos procedimientos necesarios para perfeccionar la población antes de su aislamiento. Si el hígado se digiere en suspensión de células individuales para el análisis de FACS inmediata, la diferencia de tamaño entre los hepatocitos y otras células no parenquimatosas hará efectiva la creación de la puerta FACS imposible. Si el hígado no parenquimatosas células se utilizan, sin la eliminación de las células hematopoyéticas, se corre el riesgo de que un número significativo de células CD133 + puede ser de origen hematopoyético pueden contaminar la fracción. Además, mediante el procesamiento de las células a través del filtro Miltenyi, sólo las células individuales y grupos pequeños de células se extraen. Esto asegura que la muestra no va a tapar la aguja consumo de FACS. Alternativas para este procedimiento incluyen la modificación de cualquier marcador de superficie celular alternativos, tales como CD49f, EpCAM, o una combinación de marcadores, como CD133 + + EpCAM Un segundo informe publicado utiliza un gradiente de densidad para aislar las células madre del hígado de una fracción no parenquimatosas. Este procedimiento requiere una ultra-centrífuga (8000 xg), añade un tiempo considerable en el procedimiento, y en nuestra experiencia, redujo significativamente la pre-FACS rendimiento y la viabilidad celular después de la FACS. 8 Experimentos futuros incluyen una amplia gama de análisis de expresión génica, incluidos los genes del hígado del feto, tales como HNF3, HNF4α, y además αfp.In, Western blot e inmunocitoquímica de proteínas que se expresan pueden ser utilizadas para confirmar los resultados de RT-PCR de células en cultivo. Una cuestión a destacar es el trabajo reciente que identifican CD133 expresión en las células estrelladas hepáticas. 25 Ahora examinan habitualmente a nuestras muestras de los marcadores de las células estrelladas (véase la sección Solución de problemas), y no han identified contaminación significativa en nuestras fracciones. Esto puede estar relacionado con las diferentes técnicas de la digestión y el aislamiento de células del hígado. 2,3,26 Con base en el hecho de que la mayoría de las células no será viable inmediatamente después de su aislamiento FACS, se recomienda que las células se chapada, ya sea a granel o de células CD133 + células individuales, antes de su uso en animales. 5-7 días in vitro de manera significativa a mejorar los resultados de los análisis del tumor. Además, debido a los rigores de aislamiento de células individuales, esto sólo debe llevarse a cabo una vez que las colonias se puede ampliar a granel células CD133 + aisladas. Una descripción más detallada de las condiciones de cultivo diferentes y proteínas de andamiaje que pueden utilizarse para detener la cultura del hígado y las células progenitoras se ha caracterizado bien por Lola Reid. Este trabajo ofrece condiciones alternativas y modificaciones, que los investigadores pueden incorporar a su programa de investigación una vez que las técnicas básicas de aislamiento se dominan. 27,28 Dr. El trabajo de Reid también proporciona un análisis más detallado de la biología y la maduración de linaje entre las células madre hepáticas y progenitores comprometidos. En términos de análisis de tumores in vivo, que han tenido éxito utilizando células recién aisladas y células clonal ampliado CD133 + células in vitro, utilizando principalmente 1x10 6 células. Nos hemos centrado ontwo cepas genéticas de la lesión crónica del hígado, el MAT1a - / - y PTEN específica del hígado - / - ratones, y se han utilizado tanto en ratones nude y ratones de tipo salvaje como anfitriones para el crecimiento del tumor. En nuestra experiencia, CD133 + células madre del hígado sólo se forman tumores cuando están aisladas de importantes modelos de lesión hepática que se pre-malignas. Tenga en cuenta que los tumores formados de células CD133 + en general tienen tanto el carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma características, lo que sugiere que una célula madre o el origen de células progenitoras de los tumores. 2-4,29 El trabajo de seguimiento después de los tumores están documentadas incluye el análisis estándar patológico del tejido tumoral (tinción H &amp; E) y la tinción inmunohistoquímica. Además, los tumores pueden ser picada y digerido para el análisis de FACS o volver a la cultura. 2-4,30 En conclusión, hemos detallado un procedimiento para el aislamiento, la expansión, y la caracterización básica de las células madre CD133 + CD133 + hígado y las células madre del cáncer. Solución de problemas: CD45 contaminación: Para el paso 3, si hay contaminación de las células CD45 +, que puede ser evaluado mediante la adición de un Ab CD45-FITC antes del análisis FACS y el aislamiento, asegúrese de que el anticuerpo microesferas CD45 no ha caducado y que el filtrado se recogió sólo mientras el filtro fue en el soporte magnético. Cualquier filtrado colectado mientras que el filtro no está en el soporte magnético contendrá las células CD45 +. Bajo número de células: Para el hígado lesionado, el número total de CD133 + no parenquimatosas aisladas puede ser inferior a 10.000. Estas células son poco frecuentes en el hígado en reposo. Para un modelo de lesión crónica, como la dieta DDC 0,1%, el número se incrementará en gran medida a 100.000 células. Si el número total de células es muy por debajo de estos números, una cuestión a considerar es la tinción FACS Ab. Compruebe que el Ab CD133 no ha expirado, como la tinción de los pobres se traducirá en un rendimiento pobre. Además, se recomienda realizar un análisis de FACS de hígado de células no parenquimatosas para determinar la población relativa antes de intentar el aislamiento FACS. La viabilidad celular de baja después de FACS: Uno de los problemas de viabilidad puede estar relacionado con cómo las células se procesan y durante cuánto tiempo. Idealmente, el procedimiento de celda de aislamiento total, los pasos 1-4, debe llevarse a cabo sin ningún tipo de retrasos entre los pasos y se terminó en el mismo día. Cualquier demora significativa entre los pasos 1-4 reducirá en gran medida la viabilidad de las células. Una segunda cuestión relacionada con la viabilidad celular puede estar relacionado con la presión de funda para el aislamiento FACS. Se recomienda utilizar una presión de funda inferior. Por último, una vez que las células son aisladas, deben ser inmediatamente plateado, como cualquier sistema de almacenamiento significativo en el hielo después de la clasificación también se reducirá la viabilidad. CD133 + no parenquimatosas heterogeneidad: Informes recientes indican que las células estrelladas hepáticas también pueden tener CD133 expresión y tienen cierta plasticidad. 25 Por lo tanto, además de verificar la potencia bi-genes con albúmina y Krt19, de verificación adicionales pueden incluir genes asociados con las células estrelladas, como la proteína glial fibrilar ácida de las células pasivas, estrelladas y alfa-actina de músculo liso y desmina en las células estrelladas activadas. 3,4,26 Además, la población CD133 + representa una población de progenitores en general. La adición de un segundo marcador, como EpCAM, puede ayudar a perfeccionar aún más la población, y la heterogeneidad límite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Con rojo fenol </td></tr><tr><td> CD45 microbolas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de crecimiento de hepatocitos </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Factor de Crecimiento Epidérmico </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 gramo </td></tr><tr><td> Colagenasa D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronasa </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micras colador </td><td> Pescador </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 reacciones </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD columna </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina placas revestidas </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96 y </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA 0,05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 columnas de 5x10 5 células o menos </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Concentración 10 veces </td></tr></tbody></table>

el aislamiento de células madre cd133 + hígado para la expansión clonal

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Células madre del hígado, o células ovales, proliferan durante la lesión crónica del hígado, y se proponen de diferenciarse en hepatocitos y cholangiocytes. Además, las células madre del hígado son la hipótesis de que los precursores de un subgrupo de cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular. Uno de los principales desafíos para frenar el trabajo de células de cualquier órgano sólido como el hígado es el aislamiento de una población poco común de células para su análisis detallado. Por ejemplo, la gran mayoría de las células en el hígado son los hepatocitos (fracción de parénquima), que son significativamente mayores que las células no parenquimatosas. Enriqueciendo los compartimentos celulares específicos del hígado (es decir, del parénquima y las fracciones no parenquimatosas), y la selección de células CD45 negativas, que son capaces de enriquecer a la población a partir de células madre de más de 600 fold.The proceduresdetailed en este informe permiten una población relativamente raro de células de un órgano sólido que se ordenan de manera eficiente. Este proceso puede ser utilizado para las células madre del hígado isolateliver murino normal, así como la lesión hepática crónica modelos, que demuestran los tallos aumentó la proliferación de células del hígado. Este método tiene claras ventajas sobre técnicas de inmunohistoquímica estándar de hígado congelado o fijado en formol como los estudios funcionales utilizando células vivas se puede realizar después de la primera co-localización de los experimentos. Para llevar a cabo el procedimiento descrito en este informe, una relación de trabajo con una investigación basada en la citometría de flujo principal se recomienda que los detalles de aislamiento FACS son altamente dependientes de instrumentación especializada y un gran conocimiento práctico de la citometría de flujo básico procedimientos. El objetivo específico de este proceso consiste en aislar a una población de células madre del hígado que puede ser ampliado clonal in vitro.

A continuación se describe el aislamiento de CD133 que expresan las células madre del hígado y las células madre del cáncer de hígado en su totalidad murino, un proceso que requiere de digestión de los tejidos, el enriquecimiento celular y citometría de flujo aislamiento. Se incluyen métodos para el aislamiento avanzado de células individuales y la expansión clonal.

El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal

Las células madre hepáticas, o células ovales, proliferan durante la lesión hepática crónica y se propone que se diferencian tanto en hepatocitos como en colangiocitos. En ...

Este video demuestra un procedimiento para aislar células madre hepáticas y estudiar la expansión clonal mediante la expresión de la superficie celular CD133 tras una lesión hepática crónica. Primero, se extrae el hígado de un ratón con lesión hepática crónica y se digiere para obtener una suspensión de células individuales. Luego, se añade un tampón de lisis de glóbulos rojos para eliminar los eritrocitos, y la solución se aplica a una columna magnética que contiene anticuerpos CD45 para eliminar los leucocitos CD45.Las células agotadas de CD45 se clasifican luego para enriquecer las células madre hepáticas positivas para CD133. Finalmente, las células madre hepáticas positivas para CD133 aisladas se cultivan y expanden. El análisis in vitro de la expresión génica y proteica demuestra que las células madre positivas para CD133 aisladas son capaces de diferenciarse tanto en hepatocitos como en osteocitos.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la codistribución de marcadores mediante técnicas de inmunohistoquímica, es que se pueden aislar células individuales para su expansión clonal y análisis funcional. Para confirmar los fenotipos de células madre y células progenitoras, la demostración de la técnica estará a cargo de mí mismo y de He Dang, un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Prepare todos los tampones en medio 24 horas antes y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta su uso.Los medios, instrumentos, filtros y tubos deben estar estériles y manipularse con técnica estéril. Para reducir el riesgo de contaminación, limpie el área abdominal de un ratón sacrificado con etanol al 70%. Usando instrumentos estériles, abra la cavidad abdominal y exponga el hígado sobre un bloque.Retire la vesícula biliar del hígado explantado, luego transfiera todo el hígado a una campana de flujo laminar en un recipiente estéril cerrado dentro de la campana de flujo laminar; utilice una cuchilla estéril para picar el hígado mediante una combinación de múltiples cortes horizontales y verticales. Durante un minuto, divida el hígado picado en cuatro partes y coloque cada parte en un tubo de 15 mililitros con 10 mililitros de solución enzimática de digestión. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 45 minutos en un agitador ajustado a uno o dos ciclos por segundo.Después de la incubación, limpie los tubos con etanol al 70 %. Luego, bajo una cabina de flujo laminar, aspire la pulpa hepática digerida a través de un filtro de malla de 70 micrones y recoja el filtrado en un recipiente estéril para eliminar la fracción parenquimatosa que contiene los hepatocitos más grandes. Enjuague el filtro con alícuotas de dos mililitros de medio D-M-E-M-F 12 suplementado estéril.Utilice el extremo de goma del émbolo de una jeringa para presionar la pulpa digerida a través del filtro. Repita este proceso cinco veces para obtener un volumen total de aproximadamente 20 mililitros. Divida el filtrado en dos tubos de 15 mililitros iguales y luego centrifugue a 50 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, transfiera el SUP natin a un tubo etiquetado como snat número uno y deseche el palt parenquimatoso. A continuación, para recoger la fracción no parenquimatosa, que contiene las células madre y progenitoras, centrifugue el SUP natin número uno a 50 × g durante un minuto.Transfiera el sobrenadante a un tubo etiquetado como sobrenadante número dos y deseche nuevamente el precipitado. Luego, centrifugue el sobrenadante número dos a 50 ×g durante un minuto.Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un tubo etiquetado como sobrenadante número tres y deseche el sedimento. Finalmente, centrifugue el sobrenadante final número tres a 180 × g durante ocho minutos para obtener la fracción no parenquimatosa; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y continúe inmediatamente con el siguiente paso del protocolo, en el cual se lisarán los glóbulos rojos y el sedimento. El tampón para la lisis de glóbulos rojos y el tampón Milli-Tene utilizados en esta parte del procedimiento deben haberse preparado la noche anterior y almacenado a cuatro grados Celsius según las instrucciones del documento escrito adjunto.Trabajando en una cabina de flujo laminar con las células y las soluciones sobre hielo. Re-suspenda el pellet no parenquimatoso del paso anterior en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos diluido 1x y transfiéralo a un tubo de cinco mililitros. Tape el tubo y vortexee suavemente durante cinco segundos.Incubar durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Proteger de la luz después de que hayan transcurrido 15 minutos. Centrifugar el tubo a 200 ×g durante cinco minutos; tras la centrifugación, desechar el sobrenadante, que contiene glóbulos rojos lisados y resus.Suspenda el sedimento en un mililitro de tampón e frío y estéril con hielo. Centrifugue a 200 × g durante cinco minutos. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en un mililitro de tampón e frío y estéril con hielo.Tamponar con Milton e. A continuación, retire 10 microlitros de esta suspensión celular y agregue 10 microlitros de azul de tripano. Cuente las células no parenquimatosas utilizando un hemocitómetro para realizar el agotamiento de células hematopoyéticas CD45 a partir de la fracción no parenquimatosa.Comience en la cabina de flujo laminar ajustando la concentración de las células a entre 10 a la séptima y 10 a la octava. Células totales en 100 microlitros de tampón melty. Asegúrese de mantener las células y los tampones fríos durante todo el procedimiento.A continuación, aplique 20 microlitros de mil, cualquier anticuerpo de microesferas CD45 por 10 millones de células e incube a cuatro grados Celsius durante 15 minutos. Tras la incubación, agregue dos mililitros adicionales de mil, cualquier tampón y centrifugue a 200 × g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda hasta 10⁸ células en un mililitro.Coloque un tampón cualquiera en una cabina de flujo laminar, y una columna magnética LD cualquiera en un soporte magnético. Coloque un tubo estéril de cinco mililitros debajo del filtro para recoger el filtrado. A continuación, cargue dos mililitros.Derrita cualquier tampón para realizar un prelavado con filtro. Una vez completado el lavado, cargue las células en la columna. Cuando la suspensión celular esté dentro de la columna, agregue un mililitro de tampón e derretido para lavar la columna; repita este lavado otras dos veces.No utilice el émbolo proporcionado con una columna para aumentar la velocidad de filtración. Una vez realizados todos los lavados, centrifugue el filtrado recolectado de células no parenquimatosas agotadas de CD45 a 200 veces G durante cinco minutos. Deseche la columna con las células positivas para CD45 retenidas.A continuación, se realiza citometría de flujo para aislar células positivas para CD133: suspender las células en tampón Milt, cualquier tampón, 10⁷ células por alícuota de 100 microlitros; distribuir 100 microlitros en tres tubos. Al primer tubo, añadir dos microlitros de anticuerpo conjugado con PE anti-CD133; al segundo tubo, añadir anticuerpo conjugado con PE IgG como control.El tercer tubo de células servirá como control sin teñir, incubado a cuatro grados Celsius durante 15 minutos a oscuras; tras la incubación, resuspender en dos mililitros de tampón de tinción, centrifugar a 200 × g durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un mililitro de tampón Milton e. A continuación, en el citómetro de flujo, utilizar células sin teñir y células teñidas con IGPE para ajustar los parámetros de ordenación y optimizar la selección de la población de células positivas para CD133.Nuestro FICO ERYN o RPE generalmente se puede utilizar con cualquier citómetro de flujo que tenga un láser que emita a 488 nanómetros. Finalmente, aísle la población de células positivas para CD133 utilizando el análisis de flujo positivo para CD133 y recolecte las células en medio para células ovales estéril filtrado. Ahora las células pueden cultivarse y puede realizarse el aislamiento clonal, seguido de PCR en tiempo real para evaluar el estado potencial de CD133.Se aislaron células madre hepáticas positivas de ratones de tipo salvaje y ratones knockout para MAT uno A, como se describe en este video y se observa aquí. Las células positivas para CD 1 33 representan el 0,4 % de la fracción no parenquimatosa altamente enriquecida y empobrecida en CD 45, obtenida del hígado no lesionado de ratones de tipo salvaje. En el modelo genético knockout MAT uno A menos menos, que simula una lesión hepática crónica, la población positiva para CD 1 33 se expande diez veces o más en la misma fracción altamente enriquecida.Después de la clasificación, las células se cultivaron y los clones se expandieron. Se muestran imágenes de contraste de fase de cuatro colonias derivadas de células individuales positivas para CD133, ampliadas en placas de 96 pocillos recubiertas con laminina. Estas células tienen siete días posteriores al aislamiento y demuestran colonias pequeñas y compactas de células epiteliales en el día siete, cuando las colonias tienen aproximadamente 25 células.Se aisló ARN a partir de las células y se analizó la expresión génica del marcador del sitio colangiocitario CK19, como se puede observar en estos experimentos de RT-PCR. La expresión génica demuestra la presencia del marcador de hepatocito albúmina y del marcador del sitio colangiocitario CK19, confirmando el potencial de las células positivas para CD133 varias semanas después del aislamiento inicial individual de una sola célula positiva para CD133 y su expansión in vitro. Una vez 10 a la seis células del modelo mat1, A--, se inyectan por vía subcutánea en ratones desnudos inmunodeficientes. Las flechas indican tumores en crecimiento cuatro semanas después de la inyección de las células.Las células positivas para CD133 procedentes de lesión hepática crónica inducida por toxinas, como la provocada por CCL4 o una dieta con 0,1 % de DDC, no forman tumores. La formación de tumores in vivo se utiliza para identificar el potencial maligno o el fenotipo de células madre cancerosas dentro de la población de células madre. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en ocho horas si se realiza adecuadamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden agregar marcadores adicionales de hechos, como EPAM u otros marcadores de hechos. Se pueden realizar técnicas como el flujo de población lateral para responder preguntas adicionales, como refinar los marcadores de superficie de las poblaciones de células progenitoras hepáticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre y progenitoras hepáticas utilizando citometría de flujo.No olvide que trabajar con tejido animal puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y técnicas adecuadas de laboratorio al realizar este procedimiento.

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