Aislamiento y purificación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina recombinante

0 vistas3:59 min • August 7th, 2025

MOGtag es una glicoproteína de oligodendrocitos de mielina recombinante fusionada con etiquetas de solubilización y purificación para estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune.

Para aislar MOGtag, suspenda las células bacterianas que expresan MOGtag en un tampón de lisis e incube.

Las enzimas y detergentes en el tampón alteran los lípidos de la membrana y degradan la pared celular.

Sonicar para lisar aún más las células, liberando cuerpos de inclusión insolubles que contienen MOGtag.

Centrífuga para peletizar los cuerpos de inclusión. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en tampón e incube.

Agregue clorhidrato de guanidina, luego incube para solubilizar MOGtag.

Transfiera las proteínas solubles a una resina de níquel cargada, mezcle e incube agitando para permitir que MOGtag se una a los iones de níquel.

Centrífuga para peletizar la etiqueta MOG unida. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento en un tampón de elución e incube agitando.

El imidazol en el tampón de elución libera MOGtag de la resina.

Centrifugar nuevamente, recolectar el sobrenadante purificado que contiene MOGtag y almacenarlo para su posterior análisis.

Distribuya los cultivos uniformemente entre botellas de 250 mililitros compatibles con centrifugación de alta velocidad y mantenga las botellas en hielo a partir de este momento. Granular las células bacterianas a 22,000 * g durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Vuelva a suspender y combine todos los gránulos bacterianos en un total de 30 mililitros de tampón de lisis. Transfiera este volumen a un tubo de fondo redondo de 50 mililitros capaz de centrifugar a alta velocidad.

Coloque este tubo en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Durante el tiempo de incubación, agite el tubo dos veces para volver a suspender las células. Después de la incubación, transfiera el tubo al hielo y sonique la solución a 20 kilohercios y amplitud del 70%, pulsando durante tres segundos y apagando durante tres segundos durante 5 pulsos. Sonica la solución durante seis rondas totales de cinco pulsos, permitiendo que la solución se enfríe en hielo entre rondas.

A continuación, centrifugue la solución a 24.000 * g durante 15 minutos a 4 grados centígrados, luego vuelva a suspender el gránulo en 30 mililitros de tampón A e incube la solución a 4 grados centígrados durante tres horas. Luego, agregue 17,2 gramos de guanidina-HCl a la solución. Incube la muestra en hielo durante una hora para solubilizar la proteína de la etiqueta MOG. Para purificar la proteína de la etiqueta MOG, transfiera todo el volumen de proteína solubilizada al primer tubo que contiene resina de níquel. Después de mezclar, coloque el tubo horizontalmente sobre un balancín a 4 grados centígrados durante una hora.

Después de centrifugar el tubo a 4.500 * g durante ocho minutos a 4 grados centígrados, transfiera el sobrenadante al segundo tubo de resina de níquel e incube como antes. Mientras tanto, vuelva a suspender la resina de níquel en el primer tubo en 40 mililitros de tampón de elución y coloque el tubo horizontalmente sobre un balancín a 4 grados centígrados durante cinco minutos antes de centrifugar como antes. Transfiera el sobrenadante que contiene la proteína de etiqueta MOG eluida a una botella de 250 mililitros etiquetada como proteína de etiqueta MOG purificada. Mantenga esta botella a 4 grados centígrados.

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Última actualización: 29 agosto 2026