Transfección mediada por electroporación de ganglios de la raíz dorsal de ratón para promover la regeneración sensorial de axones

Tomemos un ratón anestesiado con ganglios de la raíz dorsal L4 y L5 expuestos que contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales.

Cargue una pipeta de microinyección con construcciones de ARN marcadas con fluoróforo que regulan la regeneración de axones y un colorante trazador.

Inyecte la mezcla en los DRG.

Usando electrodos de electroporación, aplique pulsos eléctricos a los DRG.

Esto interrumpe las membranas de los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, creando poros que permiten que las construcciones entren en el citoplasma, facilitando la transfección.

Sutura la incisión y deja que el ratón se recupere.

Después de unos días, vuelva a anestesiar y asegure el ratón.

Haga una incisión lateral a la línea media a la izquierda. Diseccionar los músculos para exponer el nervio ciático.

Aplastar el nervio para dañar los axones de las neuronas sensoriales. Marque el sitio con un nudo de sutura.

Sutura la incisión y deja que el ratón se recupere.

Las construcciones transfectadas se dirigen a los ARNm en los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales DRG, modulando transitoriamente la producción de proteínas para mejorar la regeneración sensorial de los axones después de la lesión.

Para la inyección de DRG, cargue los plásmidos de ADN u oligos de ARN en la pipeta capilar de vidrio. A continuación, inserte la punta de la pipeta de vidrio capilar con cuidado en el DRG. E inyecte gradualmente una solución de 1 microlitro de plásmidos de ADN u oligos de ARN utilizando el sistema de dispensación de microinyección intracelular.

Para la electroporación, pellizque suavemente el DRG objetivo con los electrodos y aplique pulsos eléctricos de 5 cuadrados con el sistema de electroporación. Posteriormente, cierre el músculo, luego las capas de piel con suturas de nailon. Dos o tres días después de la electroporación con GRD, anestesiar al ratón por vía intraperitoneal, pegar sus extremidades con cinta adhesiva en el tablero de corcho y hacer una incisión de 1 centímetro 0,5 centímetros hacia el lado izquierdo a lo largo de la línea media.

A continuación, corte los músculos, como el músculo glúteo mayor y el músculo piriforme longitudinalmente. Luego exponga el segmento del nervio ciático entre el foramen ciático mayor y la muesca ciática. Aplaste el nervio con fórceps de microcirugía durante 12 segundos y marque el sitio del aplastamiento con una sutura epineural de nailon. Luego, cierre las capas musculares y de piel con sutura de nailon.