Cuantificación de espinas dendríticas mediante imágenes de microscopía confocal

Tomemos como ejemplo las neuronas piramidales que se transducen e inmunomarcan para que sean de color verde fluorescente.

Adquiera imágenes de las neuronas utilizando un microscopio de escaneo láser confocal con configuraciones ajustadas para garantizar una calidad de imagen óptima.

Abra una imagen con un software especializado y use el filtro gaussiano para reducir el ruido de fondo.

Realice un rastreo semiautomático de dendritas estimando primero el diámetro de la dendrita. A continuación, seleccione el punto de partida, la ruta y el punto final del dendrite.

Para la segmentación automatizada de la columna vertebral, seleccione reconstruir el diámetro de la dendrita y establezca el umbral de volumen de la dendrita para representar el volumen real de la dendrita.

Especifique los valores para el diámetro más pequeño de la cabeza del lomo y la longitud máxima del lomo.

Ajuste el umbral de los puntos que representan las espinas, asegurando su localización en las cabezas reales de la columna vertebral.

Establezca parámetros para clasificar los lomos en función de la longitud, el diámetro de la cabeza y la forma.

Genere un modelo 3D de la dendrita con espinas y exporte los datos para su posterior análisis.

Bajo un microscopio confocal, seleccione al menos 10 neuronas sanas por afección con una morfología piramidal y una arborización dendrítica completa. Para cuantificar de 60 a 100 micrómetros por dendrita, adquiera imágenes con un objetivo de aceite NA 1.3 de 40x y un láser de 488 nanómetros con una potencia máxima típica a nivel de muestra de alrededor de 20 microvatios.

Establezca el tamaño de píxel en torno a 80 nanómetros para muestrear correctamente las espinas dendríticas. Para muestrear todo el volumen de neuronas, adquiera una pila Z con un espaciado z de 150 a 300 nanómetros, lo que produce cortes z de 20 a 30 z. Para llevar a cabo la cuantificación 3D de las espinas dendríticas, utilice los siguientes ajustes para el software de análisis.

Para el preprocesamiento, utilice el filtrado gaussiano eligiendo Procesamiento de imágenes, Suavizado, Filtro gaussiano. Establezca el ancho del filtro igual al tamaño de píxel en el plano XY. Para realizar un trazado semiautomático de dendritas, desde el módulo de trazador de filamentos en la pestaña Corte, utilice la herramienta Distancia para estimar el diámetro de la dendrita.

A continuación, en la pestaña Superar, haz clic en la herramienta Filamentos y elige Omitir creación automática para una mayor robustez. En la pestaña Dibujar que se presenta ahora, seleccione AutoPath como método, Dendrite como tipo e introduzca el diámetro estimado de la dendrita. Con el modo de selección del puntero, convierta el cursor en un cuadro, elija Mayús y haga clic con el botón derecho en el punto de inicio de la dendrítica. El software realizará los cálculos iniciales.

Ahora, mueva el puntero a lo largo del dendrita. Desde el punto de partida, se muestra una línea amarilla que representa la ruta de dendritas más probable. Presione Mayús y haga clic con el botón izquierdo en el punto final de la dendrita. Para realizar una segmentación automatizada de la columna vertebral, en la interfaz del módulo, haga clic en la pestaña Creación. En la lista desplegable de reconstrucción, elija Reconstruir diámetro de dendrita y active la casilla Mantener datos. A continuación, haga clic en Reconstruir.

Establezca el umbral para que el volumen segmentado corresponda al volumen real de la dendrita . Como algoritmo, seleccione la distancia más corta desde el mapa de distancia. Luego haga clic en el botón Siguiente. En la pestaña Segmentación, determine el diámetro más pequeño de la cabeza del lomo y la longitud máxima.

Luego, en la pestaña Superar, ingrese los parámetros. Los valores de alrededor de 200 a 300 nanómetros para el diámetro mínimo y 4 micrómetros para la longitud máxima son buenos puntos de partida. Sin marcar la casilla Permitir espinas, haga clic en el botón Siguiente.

A continuación, ajuste el umbral de puntos semilla para que los puntos azules que representan las espinas se localicen en las cabezas reales de la columna vertebral. Luego haga clic en Siguiente. El cálculo del núcleo ahora se realizará y puede llevar tiempo. Para clasificar las espinas, en la pestaña Herramientas de la interfaz del módulo, haga clic en Clasificar espinas.

Después de verificar que hay cuatro clases como se describe en el protocolo de texto, la interfaz del módulo generará cuatro nuevos objetos de filamento con los resultados de la clasificación. Finalmente, exporte los datos estadísticos, en la pestaña Estadísticas haciendo clic en Exportar todas las estadísticas al archivo.