$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Comience con un software de microscopio confocal y configure los parámetros de adquisición de imágenes.
Luego, tome una sección de cerebro de ratón montada en un portaobjetos de vidrio. Esta sección está teñida con anticuerpos dirigidos a los componentes de la barrera hematoencefálica.
La barrera hematoencefálica es una interfaz celular selectiva entre el torrente sanguíneo y el cerebro para mantener la homeostasis.
Aplique una gota de aceite de inmersión con el índice de refracción deseado en el cubreobjetos para optimizar la resolución y minimizar la refracción de la luz.
Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y utilice la lámpara de epifluorescencia para visualizar la muestra.
Con los filtros adecuados, localice los núcleos teñidos con DAPI e identifique el segmento capilar para la obtención de imágenes.
Inicie el escaneo en vivo y ajuste los parámetros de cada canal fluorescente para capturar imágenes de alta calidad.
Finalmente, defina los puntos de inicio y final para la adquisición de la pila Z para generar una imagen tridimensional de la barrera hematoencefálica.
En el menú Adquisición del software que controla el microscopio, configure los parámetros de adquisición de imágenes. En el menú desplegable de tamaño de imagen, seleccione un valor de 1,024 por 1,024 píxeles. Modifique el tamaño de píxel a un valor entre 200 y 300 nanómetros ajustando el valor del menú Zoom.
En el menú desplegable Velocidad de adquisición, seleccione un valor de 400 hercios. A continuación, en el menú Configuración del sistema, seleccione la profundidad de píxeles y cambie el valor a 12 bits. Luego, en el software del microscopio, dentro de la pestaña Adquisición, active la opción de adquisición secuencial de marcos. Establezca el grosor de la sección óptica en un valor entre 0,75 y 1 micrómetro para cada canal, modificando el valor en el menú Pinhole.
Agregue una gota de aceite de inmersión con un índice de refracción de 1.52 en la parte superior del cubreobjetos, con la sección del cerebro para que coincida con el índice de refracción del cubreobjetos de vidrio y el objetivo. Posteriormente, coloque la muestra en el microscopio y encienda la lámpara epifluorescente para visualizar la muestra con los binoculares del microscopio. A continuación, presione el botón para iniciar el modo de escaneo en vivo. Durante el escaneo, ajuste la ganancia y la intensidad del láser para cada canal para maximizar el rango dinámico de las imágenes y evitar la saturación de píxeles. A continuación, establezca las secciones inicial y final para realizar pilas Z ópticas que abarquen todo el volumen del capilar y utilice un tamaño de paso de 0,45 micrómetros.
Es importante destacar que todos los ajustes de adquisición deben mantenerse idénticos durante la sesión de imágenes.