Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 4:13 min. • August 7th, 2025
Comience con un ratón anestesiado y aplique un agente dilatador de la pupila.
Bajo un microscopio, abra el párpado y sobresalga ligeramente el ojo para exponer el lugar de la inyección.
Aplique una gota de solución viscoelástica oftálmica, luego coloque un cubreobjetos para visualizar la retina.
Con una aguja fina, cree un orificio detrás de la unión córnea-esclerótica, evitando dañar los vasos sanguíneos y el cristalino.
A través de este orificio preperforado, inserte una jeringa roma tangencialmente en el espacio subretiniano cerca del epitelio pigmentario de la retina o EPR, que sostiene las neuronas de la retina.
Inyecte el vector lentiviral que transporta genes diana en el espacio subretiniano.
Observe la formación de una ampolla subretiniana debido a la acumulación de líquido, lo que confirma la administración exitosa del vector.
Cierre suavemente el párpado para cubrir el lugar de la inyección y permitir que el ratón se recupere.
El lentivirus ingresa al EPR a través de la endocitosis, libera su material genético y lo convierte en el ADN correspondiente, que se integra con el genoma del huésped, lo que permite la expresión génica.
Primero, prepare una jeringa de microlitros con una aguja roma de calibre 33. Esterilícelo con gas de óxido de etileno. A continuación, prepare una dilución de los vectores virales en PBS en un tubo de microfuga a aproximadamente 1 millón de unidades de título por microlitro. Ahora, al cargar la jeringa, enjuáguela varias veces con la solución para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa. Prepara de 1,5 a 2 microlitros para inyectar.
Con la inyección del vector viral preparada, anestesiar a un ratón adulto con una inyección intraperitoneal de tiletamina, zolazepam y xilacina. Confirmar que el animal ha sido anestesiado por ausencia de reflejos. Una vez confirmada la anestesia, dilatar sus pupilas con una gota de fenilefrina al 0,5% y tropicamida al 0,5%. Ahora, bajo un microscopio quirúrgico, abra el párpado y sobresalga el ojo para exponer el ecuador. Mantenga el ojo en esta posición colocando los dedos fuera del borde orbital.
A continuación, aplique una solución viscoelástica oftálmica a la superficie de la córnea y coloque un pequeño portaobjetos redondo sobre la córnea. Por lo tanto, se puede ver la retina. Ahora, ligeramente posterior al limbo, e inferiormente en el ojo derecho, o superiormente en el ojo izquierdo, use una media aguja estéril de calibre 30 para hacer un pequeño agujero. Los orificios colocados temporalmente o por la nariz no son buenas opciones, ya que son difíciles de cubrir.
Mientras perfora, no golpee el vaso limbal ni la lente, y no inserte todo el bisel de la aguja.
Para las inyecciones subretinianas, inserte la aguja de inyección vectorial a través del orificio en un ángulo de 45 grados con respecto al plano del iris. Empuje la aguja posteriormente hacia el área peripapilar, siguiendo el camino demarcado para cruzar la cavidad vítrea. Acerque la aguja al espacio subretiniano hasta que sienta una leve resistencia, lo que indica que se ha alcanzado la capa de EPR.
No penetre en el tejido escleral con una presión excesiva porque la aguja debe colocarse en el espacio subretiniano potencial. Si la aguja perfora el tejido del cráneo con excesiva potencia, entra en el espacio orbitario extraocular sin resistencia.
Ahora, inyecte suavemente el vector viral en el espacio subretiniano. Mantenga la aguja muy quieta para evitar daños en los tejidos, lo cual es de vital importancia. Luego, retire la aguja con la misma suavidad. Ahora, el globo ocular se puede liberar. Las ampollas subretinianas indicativas de acumulación vectorial deben ser visibles. Finalmente, cierre suavemente el párpado para cubrir el lugar de la inyección. Se producirá el autosellado del orificio.