JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 2:39 min • June 17th, 2025
Tome un cubreobjetos con neuronas primarias modificadas genéticamente en una cámara de imágenes llena de un tampón de imágenes.
Estas células expresan un indicador redox basado en proteínas fluorescentes en la matriz mitocondrial.
Coloque la cámara bajo un microscopio de fluorescencia, identifique las células bajo luz visible y luego cambie a imágenes de fluorescencia.
Aplique dos longitudes de onda de excitación para estimular el indicador y medir la emisión de fluorescencia.
La relación de intensidad de fluorescencia en estas longitudes de onda refleja el estado de oxidación mitocondrial.
Introducir NMDA para activar los receptores celulares de NMDA, causando la afluencia de calcio intracelular.
El aumento desencadena la absorción de calcio mitocondrial, induciendo la producción de ROS y
la oxidación mitocondrial.
El ROS oxida el indicador, alterando su fluorescencia y aumentando la relación de señal.
Introduzca agentes oxidantes para oxidar completamente el indicador, maximizando la relación de señal.
Retire el tampón y, a continuación, introduzca agentes reductores para reducir el colorante por completo, minimizando la relación de señal.
Utilice las proporciones de señal máxima y mínima para calibrar y cuantificar la oxidación mitocondrial inducida por NMDA.
Para imágenes en vivo, establezca el intervalo de lapso de tiempo en 30 segundos y la duración en 25 minutos. Luego, monte las células, coloque la cámara en el microscopio y enfoque las células como se demostró anteriormente. Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nanómetros en la vista en vivo para enfocar y ubicar las células para obtener imágenes. Opcionalmente, para aumentar el número de celdas grabadas por ejecución, utilice la función multipunto para obtener imágenes de dos o tres campos de visión por cubreobjetos.
Inicie la adquisición de lapso de tiempo y grabe cinco imágenes como una grabación de referencia de dos minutos. Agregue 500 microlitros de solución NMDA tres veces a la cámara para lograr la concentración final de 30 micromolares y grabe 20 imágenes adicionales como una respuesta NMDA de 10 minutos. A continuación, agregue 500 microlitros de solución DA cuatro veces a la cámara y grabe seis imágenes más. Aspire el tampón de la cámara de imágenes y reemplácelo con 1 mililitro de solución de DTT. Después de grabar 10 imágenes más, finalice la grabación y guarde la serie de imágenes.