Name: Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a purificar ribosomas de levadura de alta actividad mediante cromatografía con columna de cisteína y tratamiento con puromicina. Este método elimina exonucleasas y proteasas contaminantes para análisis bioquímicos precisos.

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Queremos agradecer a todos los miembros del laboratorio Dinman, incluyendo Ashton Belew, Jack Karen, Musalga Sharmishtha, Sulima Sergey, Reddy Shivani, y Michael Rhodin por su ayuda y aportación en este proyecto. Este trabajo fue apoyado por becas de AM de la American Heart Association (AHA 0630163N) y JDD de los Institutos Nacionales de Salud (5R01 GM058859-12). JAL fue apoyado por una de Reinversión y Recuperación Americana de 2009, suplemento al título principal (3R01GM058859-11S1).

1. Preparación de una cisteína acusado Sulfolink resina <ol><li> Prepare Sulfolink resina (Pierce) a temperatura ambiente. </li><li> Lugar a un total de 10 ml de una mezcla del 50% de gel de acoplamiento Sulfolink suministrada por el fabricante en dos viales de 10 ml de plástico, con 5 ml distribuidos en cada vial. </li><li> En pocas palabras centrífuga viales a 850 xg y retirar con cuidado los sobrenadantes. </li><li> Lavar el gel tres veces en tampón de acoplamiento (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) por resuspensión de las cuentas de 5 ml, centrifugar brevemente a 850 xg y eliminar el sobrenadante con una pipeta. </li><li> Agregue cinco ml de una solución 50 mM de L-cisteína en tampón de acoplamiento a cada tubo y mezclar la pasta durante 1 hora a 25 ° C. </li><li> Eliminar el residuo de L-cisteína por lavado como se describe en el paso 1.4. </li><li> Resuspender el gel en 10 ml de tampón de unión [20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM Mg (OAc) 2, 60 mM NH 4 Cl, 2 mM TDT], y equilibrar la resina por el lavado en 10 ml de tampón de unión3 veces como se describe en el paso 1.4. Resina se decanta en un 10 ml de centrífuga columna, la tapa y se almacena a 4 º C. La capacidad de la resina de unión al ARN es de ~ 20 A 260 unidades por mililitro. </li></ol> 2. Purificación por cromatografía de ribosomas con una cisteína acusado Sulfolink resina Nota: Si se trabaja con una tensión donde la actividad de la proteasa ha demostrado ser un problema, los cócteles de la proteasa inhibición puede ser utilizado en todos los topes posteriores. <ol><li> Mantener todos los componentes en el hielo y preparar todas las soluciones con RNasa libre de agua y filtración estéril. </li><li> Se cultivan las células de levadura durante la noche a mitad de la fase de registro (OD 595 = 0,6 - 1,2) en los medios de comunicación adecuados. Pellet las células por centrifugación y se lavan las células de un gramo en tampón de unión y centrifugar a 3700 xg durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de tampón de unión para un volumen total aproximado de 2 ml, e interrumpir el uso de un volumen igual de 0,5 mm perlas de vidrio se enfría a 4 ° C ucantar una Biospec Mini-batidor de bolas (Bartlesville, OK). Las muestras se pueden dividir en varios tubos según sea necesario. </li><li> Eliminar las células intactas, orgánulos, y los restos celulares por centrifugación a 30.000 xg durante 30 minutos en una ultracentrífuga Beckman-Coulter Optima Max E (Fullerton, CA). </li><li> Inmediatamente antes del uso de perdigones de la resina durante un minuto a 1.000 xg para extraer la solución de almacenamiento. Dos ml de resina se utiliza para cada gramo de las células. </li><li> Quitar sobrenadantes de células lisado de la vuelta 30 000 xg (S30), teniendo cuidado para minimizar la contaminación ya sea de la fracción lipídica en la parte superior o los restos celulares en la parte inferior de los tubos, y el lugar directamente en la suspensión Sulfolink cargos. La capa de lípidos se puede evitar, ya sea por retiro o por empujar fuera de la pipeta después de que la punta se cruzó en el sobrenadante. </li><li> Incubar la mezcla S30/Sulfolink en el hielo sin mezclar durante 15 minutos. </li><li> Coloque las columnas en 15 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1.000 g duranter un minuto. </li><li> Coloque las fracciones de caudal contínuo de nuevo en las columnas, mezclar con la mano, y se incuba durante 15 minutos en hielo. </li><li> Coloque las columnas en 15 ml tubos cónicos y se centrifuga a 1.000 g durante un minuto. Deseche el caudal contínuo. </li><li> Columnas de la tapa y añadir 5 ml de tampón de unión. Mezcla de columnas con la mano hasta resuspendido, quite las tapas, y centrifugar la centrífuga columnas en 1000 xg durante un minuto. Repita este protocolo de lavado dos veces más. </li><li> Añadir 1,5 ml de tampón de elución (20 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM DTT, 0,5 mg / ml de heparina) para cada columna. Mezcla de lodos de la mano, e incubar en hielo durante 2 minutos </li><li> Columnas en lugar de nuevos tubos de 15 ml y centrifugar a 1000 xg durante 1 minuto. Recoger eluido. Repita el paso de elución una vez más, de modo que el volumen final, además de la muestra se ~ 3 ml. Resina utilizada se pueden lavar con tampón de elución y sin heparina seguida de equilibrio con buffe vinculanter, y se almacenan en volúmenes de 10 ml de tampón de unión a 4 ° C para su reutilización posterior. </li></ol> 3. Puromicina tratamiento Nota: Un método alternativo para eliminar la contaminación de especies tRNA es pasar de un nivel de glucosa rico en medios de glucosa reducido para promover la escorrentía ribosoma. Sin embargo, esto no cambia el estado metabólico de las células de levadura, lo que podría afectar la función del ribosoma y la concentración. Con el fin de despojar a los ribosomas de la endógeno peptidil-tRNA, un tratamiento con puromicina se lleva a cabo. <ol><li> Neutralizar a un pH de 7,5 una solución de 100 mM puromicina mediante la adición de KOH 1M gota a gota, a temperatura ambiente. </li><li> Añadir solución neutralizada puromicina a ~ concentración final de 1mM eluido. </li><li> Añadir 100 mM GTP hasta una concentración final de 1 mM. </li><li> Incubar durante 30 minutos a 30 ° C. </li></ol> 4. Purificación de los ribosomas por sedimentación a través de los cojines de glicerol <ol><li> Coloque un mlde tampón amortiguador (20 mM HEPES, pH 7,6, 10 mM Mg (OAc) 2, 500 mM KCl, 2 mM de DTT, 25% de glicerol) en un tubo de 4 ml de volumen ultracentrífuga policarbonato. </li><li> Suavemente la capa de puromicina tratados fracciones de elución en la parte superior de la almohadilla, y las muestras de centrifugar a 100.000 xg durante la noche a 4 ° C. </li><li> Retire los tubos de los rotores de centrifugación, y aspirar sobrenadante. </li><li> Lávese las pastillas que contienen ribosomas purificados dos veces con 1 ml de tampón de amortiguación. </li><li> Resuspender los ribosomas en 100 l de tampón amortiguador por la interrupción suave usando una varilla de vidrio. </li><li> Después de la interrupción, cubrir los tubos con parafilm y agitar a una velocidad moderada en un vórtice cuarto frío durante una hora. </li><li> Transferir el contenido de un tubo de microcentrífuga, centrifugar durante 5 minutos a velocidad máxima a 4 ° C, y eliminar los sobrenadantes a tubos nuevos. </li><li> Repita los pasos 4,1 a 4,7 con 2 ml de tampón de amortiguación y, salvo que l 100 de buffer de almacenamiento (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Mg(OAc) 2, 1 mM DTT, 25% de glicerol) se utiliza en los pasos 4.4 y 4.5 en lugar de buffer amortiguador. </li><li> Cuantificar los ribosomas purificados por espectrofotometría (1 A 260 = 20 pmoles de los ribosomas de levadura), y almacenar a -80 ° C. Los resultados típicos de 1 gramo de levadura son 300-400 pmoles de los ribosomas. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de las especies de ARN extraído de cada uno de los tres pasos principales del protocolo se muestra en la Figura 2. Mientras rRNAs son las principales especies presentes en lisados ​​celulares totales (T), estos también contienen un gran número de otras especies de ARN. Ribosomas purificados de la columna Sulfolink (SL) también contienen una gran cantidad de tRNAs debido a la alta afinidad del lecho de la columna para estas especies también. El tratamiento de esta fracción con los resultados de puromicina en la hidrólisis de los péptidos de la peptidil-ARNt, y promueve la disociación de estas especies de los ribosomas. La puromicina muestras tratadas (Pm) la falta de co-purifying especies de tRNA, y por lo tanto representan los ribosomas completamente puro. Como se informó anteriormente 8, estos ribosomas son altamente intactos y activos bioquímicamente, lo que los soportes ideales para detallado análisis funcional y estructural. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del método. Purificación cromatográfica de los ribosomas con la cisteína vinculada sulfolink resina se representa. <img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis representativo de los preparativos del ribosoma. Especies de ARN total se extrajeron a partir de lisados ​​celulares totales (T), Sulfolink ribosomas purificados (SL) y ribosomas Sulfolink purificado posteriormente fueron tratadas con puromicina y sedimentado a través de un colchón de glicerol (Pm). Carril M representa el tamaño de marcadores de ARN. Las bandas que representan rRNAs 25S y 18S, así como los ARNt y otras especies de ARN se indican. Todoslos carriles fueron cargados con 2 g de ARN.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Protocolos de purificación de ribosomas en esencia, de las células de lisis, cosecha una fracción citosólica de un giro a baja velocidad, y luego granulación ribosomas por centrifugación de alta velocidad 1. Mientras que un nuevos métodos se han utilizado algunos para la purificación de los ribosomas bacterianos, la misma no había sido cierto para los eucariotas 2-4. A pesar de las medidas adicionales han sido añadidos a lo largo de los años, por ejemplo, se lava la sal, y los cojines de glicerol (...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sulfolink acoplamiento de resina </td><td> Atravesar </td><td> 20402 </td></tr><tr><td> Mini-batidor de cuentas 16 </td><td> Biospec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> Optima Max E ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td></tr><tr><td> Leyenda RT </td><td> Sorvall </td><td></td></tr><tr><td> 0.5 Cuentas de vidrio mm </td><td> Biospec </td><td> 11079105 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 252859 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54459 </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td></tr><tr><td> Mg (OAc) 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5661 </td></tr><tr><td> KOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 221473 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7255 </td></tr><tr><td> GTP </td><td> Fermentas </td><td> R0461 </td></tr></tbody></table>

purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Ribosomas eucariotas son mucho más lábiles en comparación con sus contrapartes eubacterial y archael, lo que plantea un importante reto para los investigadores. Particularmente preocupante es el hecho de que la lisis de las células libera una gran cantidad de proteasas y nucleasas que pueden degradar los ribosomas. Por lo tanto, es importante separar los ribosomas de estas enzimas lo más rápido posible. Desafortunadamente, los métodos convencionales de ultracentrifugación diferencial ribosomas hojas expuestas a estas enzimas por períodos excesivamente largos de tiempo, afectando su integridad estructural y funcionalidad. Para solucionar este problema, utilizamos un método de cromatografía de cisteína con un cargo Sulfolink resina. Esta aplicación sencilla y rápida reduce significativamente co-purificación de las actividades proteolíticas y nucleolytic, produciendo altos rendimientos de los ribosomas intactos, levadura muy bioquímicamente activas. Sugerimos que este método debería ser aplicable también a los ribosomas de mamíferos. La simplicidad deel método, y la pureza mejorada y la actividad de los ribosomas cromatográficas representa un avance técnico importante para el estudio de los ribosomas eucarióticos.

La contaminación de las preparaciones de los ribosomas eucarióticos purificado por los métodos tradicionales de purificación de nucleasas y proteasas co-incide negativamente en posteriores análisis bioquímicos y estructurales. Un método de cromatografía de purificación rápida y sencilla se utiliza para resolver este problema con los ribosomas levadura como un sistema modelo.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

Los ribosomas eucariotas son mucho más lábiles en comparación con sus homólogos eubacterianos y arqueanos, lo que plantea un desafío significativo para los investigadores.

El objetivo general de este procedimiento es purificar ribosomas de levadura intactos y altamente activos. Esto se logra primero lisando las células y clarificando el lisado mediante centrifugación de alta velocidad. Para obtener la fracción S 30, se utiliza luego una columna de enlace SFO cargada con cisteína para purificar los ribosomas.A continuación, se realiza la eliminación de los ARNt contaminantes mediante un tratamiento con puromicina como paso final de purificación. Los ribosomas se someten a una ultracentrifugación a alta velocidad. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la purificación por ultracentrifugación es que el uso de la columna sulfa link separa rápidamente los ribosomas de las exonucleasas y proteasas contaminantes.Además, el paso del tratamiento con puromicina separa los ribosomas de especies de ARN contaminantes, como los ARNt. Estos pasos aseguran la producción de grandes rendimientos de ribosomas purificados altamente activos e intactos, para su uso en estudios bioquímicos y estructurales. El procedimiento será demostrado por Jonathan Leschen, un investigador asociado posdoctoral de mi laboratorio.Comience este protocolo pipeteando una suspensión al 50 % de gel de sulfa link para acoplamiento, tal como lo suministra el fabricante, en dos viales plásticos de 10 mililitros, distribuyendo cinco mililitros en cada vial. Después de centrifugar brevemente los viales a 850 × g, retire cuidadosamente los sobrenadantes. Lave el gel tres veces con tampón de acoplamiento mediante resuspensión, suspendiendo las perlas en cinco mililitros, y luego centrifugando brevemente a 850 × g. Retire el sobrenadante con una pipeta. Después de lavar la resina, añada cinco mililitros de una solución de 50 milimolar de L-cisteína en tampón de acoplamiento a cada tubo.Mezcle la suspensión durante una hora a 25 grados Celsius. Luego, elimine la L-cisteína residual lavando la resina tres veces con tampón de acoplamiento solo. A continuación, re suspenda el gel en 10 mililitros de tampón de unión y equilibre la resina lavándola tres veces.Por último, vierta la resina en una columna de centrifugación de 10 mililitros y tápela. La resina puede almacenarse a cuatro grados Celsius y tiene una capacidad de aproximadamente 20 a dos 60 unidades por mililitro durante la purificación cromatográfica de ribosomas. Utilizando una resina de sulfaenlace cargada con cisteína.Mantenga todos los componentes en hielo y prepare todas las soluciones utilizando agua libre de RNAsas y filtración estéril. Cultive células de levadura durante la noche hasta la fase logarítmica media en el medio adecuado. Después de pelotar las células por centrifugación, lave un gramo de células en tampón de unión y centrifugue nuevamente, luego re suspenda las células en un mililitro de tampón de unión hasta un volumen total aproximado de dos mililitros.Rompa las células utilizando un volumen igual de perlas de vidrio de 0,5 milímetros enfriadas a cuatro grados Celsius, así como un mini agitador de perlas. Elimine las células no rotas, los orgánulos y los restos celulares mediante centrifugación a 30.000 ×g durante 30 minutos en una ultracentrífuga. Mientras tanto, haga un pellet de la resina durante un minuto a 1000 ×g. Para eliminar la solución de almacenamiento inmediatamente antes del uso.Se utilizan dos mililitros de resina por cada gramo de células. Tras la ultracentrifugación de las muestras, retire los sobrenadantes del lisado celular del centrifugado a 30.000 veces G denominado S 30. Tenga cuidado de minimizar la contaminación proveniente tanto de la fracción lipídica en la parte superior como de los restos celulares en el fondo de los tubos.Transfiera los sobrenadantes directamente al tampón de enlace SFO cargado. Incube la mezcla de enlace S 30 SFO en hielo durante 15 minutos. Coloque las columnas en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1000 × g durante un minuto, transfiera las fracciones del flujo atravesado nuevamente a las columnas, tape las columnas e inviértalas para mezclar.Incube las muestras durante 15 minutos adicionales en hielo. Luego coloque las columnas en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1000 ×g durante un minuto; deseche el flujo inicial. Después de agregar cinco mililitros de tampón de unión, tape las columnas e inviértalas para mezclar hasta que se resuspendan.Retire las tapas y centrifugue las columnas a 1000 veces G durante un minuto. Repita este protocolo de lavado otras dos veces. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de elución a cada columna.Mezcle las suspensiones manualmente e incube en hielo durante dos minutos. Como paso final, coloque las columnas en nuevos tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 1000 ×g durante un minuto. Recopile el eluato y repita el paso de elución una vez más, de modo que los volúmenes finales combinados de la muestra sean aproximadamente tres mililitros. Con el fin de separar los ribosomas del peptidil endógeno, se realiza un tratamiento con T-R-N-A-A con puromicina.Primero, neutralice una solución de pur micina 100 milimolar a pH 7,5 agregando hidróxido de potasio 1 molar gota a gota. Agregue a temperatura ambiente. Añada la solución de pur micina neutralizada hasta una concentración final aproximada de un milimolar en el eluato.Luego, agregue GTP 100 milimolar hasta una concentración final de un milimolar. Incube la mezcla durante 30 minutos a 30 grados Celsius. Tras la incubación, coloque un mililitro de tampón de almohadilla en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato de volumen cuatro mililitros.Coloque suavemente las fracciones de elución tratadas con puromicina encima del cojín y centrifugue las muestras a 100.000 ×g durante la noche. Después de aspirar los sobrenadantes, lave los pellet que contienen los ribosomas purificados con un mililitro de tampón del cojín. Repita este lavado con un segundo mililitro de tampón del cojín.Luego, Reza suspende los ribosomas en 100 microlitros de tampón de amortiguación mediante una disrupción suave usando una varilla de vidrio. A continuación, cubra los tubos con parafina y agite a velocidad moderada en un vórtex en cámara fría. Después de una hora de agitación, transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga y centrifugue durante cinco minutos a velocidad máxima a cuatro grados Celsius.Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos. Aplique los sobrenadantes encima de dos mililitros de tampón de amortiguación en un tubo para ultracentrífuga, seguido de centrifugación a 100,000 × g durante la noche. Al día siguiente, retire los tubos del rotor de la centrífuga y aspire los sobrenadantes.Utilizando el método recién descrito, lave los pellet y re suspenda los ribosomas con tampón de almacenamiento. Finalmente, cuantifique espectrofotométricamente los ribosomas purificados antes de almacenarlos a menos 80 grados Celsius.Se muestra aquí un ejemplo de especies de ARN extraídas de cada uno de los tres pasos principales del protocolo, incluyendo los lisados celulares totales, los ribosomas purificados mediante sulf olink, y los ribosomas purificados mediante sufu link que posteriormente fueron tratados con pur micina y sedimentados a través de una almohadilla de glicerol. También se muestran marcadores de tamaño de ARN, mientras que nuestros ARN son las especies principales presentes en los lisados celulares totales. Estos también contienen un gran número de otras especies de ARN.Los ribosomas purificados a partir de la columna de enlace sulfa contienen una gran cantidad de ARNt debido a la alta afinidad del lecho de la columna por estas especies. El tratamiento de esta fracción con piro micina provoca la hidrólisis de péptidos a partir de ARNt peptidil, y promueve la disociación de estas especies de los ribosomas. Las muestras tratadas con micina pura carecen de especies de ARNt que se purifican conjuntamente y, por lo tanto, representan ribosomas completamente puros.Como se informó previamente, estos ribosomas son altamente intactos y bioquímicamente activos, lo que los convierte en sustratos ideales para análisis funcionales y estructurales detallados. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos para monitorear la unión de ligandos a los ribosomas y análisis estructurales, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuáles son las propiedades bioquímicas y biofísicas de los ribosomas eucariotas?

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Se describe un método rápido y eficaz para la purificación de las mitocondrias de la...

Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Fuente: Becker, B., et al. Un ensayo reportero simple basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para el tráfico de la cadena de la toxina A de la ricina (RTA) en levaduras. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demuestra la purificación de una proteína recombinante marcada con polihistidina mediante cromatografía de afinidad basada en níquel. Detalla pasos clave, incluyendo la lisis bacteriana por sonicación, la clarificación y filtración del lisato, y la unión...

 Una técnica de cromatografía de afinidad para la purificación de una proteína bacteriana recombinante

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Aquí presentamos un protocolo para expresar, solubilizar y purificar varios transportadores de borato eucariotas con homología a la familia de transportador SLC4 usando levadura. También describimos un análisis Cross-linking químico para evaluar las proteínas purificadas homomeric multimérica Asamblea. Estos protocolos pueden ser adaptados para otras proteínas de membrana desafiante.

Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la expresión, purificación y unión liposoma de heterodímeros SNX-BAR en levadura.

Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes

Presentamos un método rápido y rentable para producir el sistema TX-TL recombinante PURE libre de células utilizando equipos de laboratorio estándar.

Sistema OnePot PURE Cell-Free

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a purificar ribosomas de levadura de alta actividad mediante cromatografía con columna de cisteína y tratamiento con puromicina. Este método elimina exonucleasas y proteasas contaminantes para análisis bioquímicos precisos.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

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