Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 2:59 min. • August 7th, 2025
Llene una micropipeta con una mezcla de ADN que contenga vectores plásmidos que lleven el gen de interés y un tinte de seguimiento. Asegúrelo en un micromanipulador.
Coloque un bloque de agarosa bajo el microscopio y coloque un corte de cerebro embrionario de ratón incrustado en agarosa con interneuronas corticales sobre él.
Baje la micropipeta e inyecte la mezcla de ADN en la región progenitora de interneuronas. El tinte de seguimiento marca el lugar de la inyección.
Coloque otro bloque de agarosa en un electrodo de placa de Petri y una columna de agarosa en el electrodo de cubierta.
Transfiera la rebanada al bloque y alinee el electrodo de cubierta sobre el sitio de inyección.
Aplique breves pulsos eléctricos para permeabilizar temporalmente las membranas celulares, permitiendo que los plásmidos entren en el núcleo.
Incube la rebanada en un medio para mantener la viabilidad celular.
Dentro del núcleo, el plásmido desencadena la expresión génica, produce la proteína diana y modula las funciones progenitoras de las interneuronas.
Para la inyección, mezcle el ADN del vector de expresión y control a una concentración de 1 microgramo por microlitro para cada vector, y agregue una solución madre verde rápida a una dilución de 1 a 10. Llene una micropipeta de vidrio de 0,5 milímetros de diámetro interior y 1 milímetro de diámetro exterior con 10 microlitros de la mezcla de ADN y cargue la micropipeta en un inyector neumático de pico bomba. Coloque el bloque más grande de agarosa bajo un microscopio estereoscópico y coloque la rodaja que se inyectará sobre el trozo de agarosa.
Luego, inyecte volúmenes de 25 a 50 nanolitros en la región de eminencia ganglionar medial o caudal seleccionada de la rebanada. Inmediatamente después de la inyección, coloque el pequeño bloque de agarosa en el electrodo de la placa de Petri y use una microespátula de extremo plano para unir la columna de agarosa al electrodo de cubierta móvil.
Transfiera la rebanada inyectada con su membrana de soporte al bloque de agarosa y coloque el electrodo superior con la columna de agarosa en la parte superior de la región seleccionada de la rebanada. Luego galvantra la región con dos pulsos de 5 milisegundos de 125 voltios, con 500 milisegundos de diferencia. Después de la electroporación, vuelva a colocar la rebanada con su membrana de soporte en su placa de sujeción y devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos.