Espectroscopia Raman anti-Stokes coherente para visualizar neuronas mielinizadas en tejido cerebral de ratón

Tome una rebanada de cerebro de ratón fijada químicamente en una placa de pocillos múltiples.

El tejido contiene axones rodeados de vainas de mielina ricas en lípidos. Los cuerpos celulares contienen cuerpos de Nissl compuestos por retículo endoplásmico rugoso y ribosomas.

Incubar en una solución de permeabilización que contenga una tinción fluorescente de Nissl. La solución permeabiliza las membranas celulares, lo que permite que la tinción se una al ARN ribosómico dentro de los cuerpos de Nissl y marque los cuerpos celulares.

Coloque el tejido bajo un microscopio confocal con un sistema de imágenes coherente de espectroscopia Raman anti-Stokes, o CARS.

Bomba sincronizada directa y rayos láser Stokes sobre el tejido, sintonizados para excitar los enlaces moleculares en la vaina de mielina rica en lípidos.

Introduzca un rayo láser de sonda para interactuar con los enlaces excitados y producir una señal anti-Stokes específica para la mielina.

Un fotodetector captura la señal para generar una imagen específica de mielina.

Utilice imágenes confocales para capturar señales de las carrocerías Nissl etiquetadas.

Superponga las imágenes confocales y CARS para visualizar la arquitectura neuronal.

Después de preparar los tejidos como se describe en el manuscrito, tiñe las secciones flotantes para Nissl y los medios de anticuerpos para visualizar los cuerpos celulares. Luego, incube las secciones en un agitador de laboratorio estándar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Antes de llevar las muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos una hora. Luego, alinee el láser CARS superponiendo espacialmente la bomba y los rayos láser Stokes, y ajuste el retraso entre los dos rayos láser.

Kohler la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para la obtención de imágenes CARS directas. Luego, ajuste el periscopio externo para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos del cabezal de escaneo del microscopio. Para una mejor detección directa de CARS no escaneados, asegúrese de que el condensador esté kohlered.

Para imágenes confocales de inmunofluorescencia e imágenes CARS, equipe el láser CARS con detectores no escaneados directos y epi-CARS incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia. Ahora, coloque las secciones en una placa de cultivo con fondo de cubreobjetos y PBS para evitar que se seque el tejido. Además, use un peso de vidrio para mantener el pañuelo cerca del cubreobjetos.

Usando la interfaz gráfica de usuario. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes para imágenes confocales de fluorescencia CARS y Nissl. Coloque la muestra en la platina del microscopio. Enfoca la muestra y captura las imágenes.