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Neurociencia
0 vistas • 5:18 min • June 17th, 2025
Tomemos una larva de pez cebra transgénica paralizada montada en una cámara de perfusión.
La larva expresa indicadores de calcio localizados en la membrana en las células ciliadas del neuromast, un componente del sistema de línea lateral que detecta el movimiento del agua.
Las células ciliadas comprenden haces pilosos apicales y regiones presinápticas basales, que forman sinapsis con neuronas aferentes para transmitir señales.
Bajo un microscopio confocal, use un aumento bajo para colocar una pipeta de chorro de fluido cerca de la larva.
Aumente el aumento para localizar un neuromast, vuelva a colocar la pipeta cerca de él y cambie a
imágenes de fluorescencia.
Envía pulsos de fluido para desviar los mechones de cabello, abriendo canales de mecanotransducción para la afluencia de cationes apicales, incluidos los iones de calcio.
Los indicadores débilmente fluorescentes se unen al calcio, lo que provoca un aumento localizado de la fluorescencia.
La afluencia de cationes despolariza la célula, desencadenando la entrada de calcio a través de canales activados por voltaje en la presinapsis basal, donde se une a los indicadores y aumenta la fluorescencia localmente.
Visualice la dinámica del calcio apical y basal en tiempo real.
En este procedimiento, rellene 10 microlitros de tampón neuronal en una aguja de chorro de fluido rota correctamente utilizando una punta de carga de gel. Cargue la solución uniformemente hasta la punta sin burbujas. A continuación, inserte la aguja en el soporte de la pipeta conectado al micromanipulador motorizado.
Coloque la cámara de perfusión en un adaptador de cámara circular en la platina del microscopio. Mueva la etapa motorizada para que la larva esté en el centro del campo de visión. Posteriormente, gire el adaptador de cámara circular para que el eje AP de la larva esté aproximadamente alineado con la trayectoria de la aguja de chorro de fluido.
Usando luz transmitida y contraste de interferencia diferencial, enfoca la larva y céntrala debajo del objetivo 10x. Luego aumente el objetivo 10x. Usando el micromanipulador motorizado, lleve la aguja del chorro de fluido hacia el centro del campo de visión, de modo que sea iluminada por la luz transmitida y apenas toque el amortiguador neuronal.
Baja el objetivo 10x para enfocarte en la larva con el fin de confirmar su ubicación. Enfoca el objetivo en la aguja de chorro de fluido. Mueva la aguja de chorro de fluido con el micromanipulador en los ejes x e y hasta que esté en una posición paralela al lado dorsal de la larva.
Luego, concéntrese nuevamente en la larva. Baje la aguja en el eje z y colóquela a lo largo del lado dorsal del pez, a 1 milímetro del cuerpo. Mueva con cuidado el adaptador de cámara circular para asegurarse de que la aguja de chorro de fluido esté alineada a lo largo de la línea media A-P de la larva.
A continuación, cambie al objetivo de agua 60x. Asegúrese de que el objetivo esté inmerso en el tampón neuronal. Usa el enfoque fino para localizar un neuromast. Posteriormente, mueva la platina motorizada para colocar el neuromástil de interés en el centro del campo de visión.
Mantenga la punta de la aguja del chorro de líquido a lo largo del lado dorsal del pez. No toque la punta de la aguja del chorro de fluido con la larva o la superficie de la cámara. Coloque la aguja de chorro de fluido con el micromanipulador de modo que esté a 100 micrómetros del borde exterior del neuromástil.
Luego concéntrese en las puntas de los mechones de cabello apical. La parte inferior de la aguja de chorro de fluido debe estar enfocada en este plano. Configure la pinza de presión de alta velocidad del modo manual al externo para recibir información del software de imágenes. Ponga a cero la abrazadera de presión de alta velocidad presionando el botón cero y use la perilla de punto de ajuste para establecer la presión de reposo ligeramente positiva. Confirme la salida de reposo de la abrazadera de presión de alta velocidad con un manómetro PSI conectado a la salida de la platina de cabeza.
Para determinar la presión necesaria para estimular los mechones de cabello, aplique un estímulo de prueba con una salida de 0.125 y 0.25 voltios durante 200 a 500 milisegundos. Para cada estímulo de prueba, mida la distancia de desviación de las puntas de los mechones de cabello (los kinocilios). Elija una presión que mueva los haces a una distancia de aproximadamente 5 micrómetros. Asegúrese de que las puntas de la kinocilia permanezcan enfocadas todo el tiempo.
Para adquirir imágenes de un solo plano, seleccione un estímulo para entregar durante la adquisición de 80 fotogramas después del fotograma 30 a los tres segundos. Para medir las respuestas mecanosensibles al calcio, concéntrese en la base de los mechones de cabello apicales y comience la adquisición de imágenes. Para medir las respuestas presinápticas de calcio, concéntrese en la base de las células ciliadas y comience la adquisición de imágenes.