Detección y Genogrouping de norovirus en las heces de los niños por TaqMan en un solo paso RT-PCR

Detección de Neurovirus en ARN extraído mediante R-T-P-C-R en tiempo real en un solo paso con sondas TECHMAN específicas. Pero hoy vamos a hablar de los neurovirus. Esto es en Lima, Perú y es un grupo de la universidad y también de la Universidad Johns Hopkins.

Resulta que el norovirus es probablemente una de las causas más descuidadas de la diarrea. Nuestro grupo ha encontrado que el norovirus es el segundo coronavirus en términos de hospitalizaciones de niños por diarrea y también en términos de número de incidencias de diarrea basadas en la población. Entonces, ¿por qué NEUROVIRUS no se ha diagnosticado antes?

Bueno, la razón es que es un virus de ARN y no podemos cultivarlo, por lo que se necesitan métodos biológicos moleculares especiales para diagnosticarlo. Estos métodos que usamos son R-T-P-C-R, y esto va a demostrar cómo usar y diagnosticar cómo usar el R-T-P-C-R para diagnosticar neurovirus. En 1989, utilizamos un método ATE de G guine para la extracción de ARN viral de muestras de heces.

Este método es una alternativa al kit comercial de ARN viral de caamp. Ambos métodos se basan en las propiedades de unión de ácidos nucleicos de las partículas de sílice. Combinado con las propiedades antinucleasas de G Guad Dium Bio NA preparación de suspensión de sílice para la extracción de ARN.

Para preparar las partículas de sílice, tome 30 gramos de dióxido de silicona, agregue 250 milímetros de agua desmineralizada y suspenda el silicio agitando. Después de 24 horas de sedimentación, retirar 215 mililitros del supinato y porcionar por succión a 250 mililitros de agua desmineralizada y de nuevo, suspender el silicio agitando. Después de otras 24 horas, retire el supinato por succión y ajuste el pH de la suspensión de sílice a pH 2.0 utilizando ácido clorhídrico qu suspensión de sílice en botellas de vidrio y extracción en autoclave con g guin y sílice.

A continuación, veremos la extracción del ARN viral utilizando las partículas de sílice preparadas en un paso anterior. Almacene a menos 70 grados centígrados hasta su uso. Para hacer una suspensión fecal al 10%, tome aproximadamente 0,1 gramos de heces y complete con un mililitro de PBS antes de la extracción.

La carga inferior muestrea el vórtice durante cinco segundos y luego centrifuga a 4.000 RPM durante 10 minutos. En cada reacción, una muestra de heces positivas para neurovirus como control positivo y agua tratada con DEPC en un tubo de microcentrífuga. Mezcle lo siguiente, un mililitro de tampón L seis, 20 microlitros de las partículas de sílice preparadas y 200 microlitros de extracto fecal.

Agite brevemente el vórtice y deje las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar durante 15 segundos. A continuación, lavar el pellet dos veces con tampón L dos, luego dos lavados con etanol al 70% y un lavado con ácido.

Seque el pellet en un bloque calefactor seco a 56 grados centígrados durante cinco minutos. Hidrate el ARN en la pelletza de sílice añadiendo 50 microlitros de agua destilada libre de ARN. Añade un microlitro de ARN sin vórtice y déjalo a 56 grados centígrados durante 15 minutos.

Ciempiés durante tres minutos a toda velocidad y recoger una temperatura supina que contenga el ARN. Cuantifique las muestras utilizando la técnica sin gota y almacene el ARN extraído a menos 70 grados Celsius. Hasta su uso en la extracción comercial del ARN viral.

Ahora vamos a demostrar la extracción de ARN de las heces utilizando el ARN viral kay amp disponible comercialmente. El kit contiene el siguiente gel de sílice, tampón de columna MinPin, A-V-L-A-W, uno, un W2, A, VE y ARN portador de hojas. Brevemente. El procedimiento es el siguiente.

Mezcle una porción del tampón A VL con ARN portador y tubo de vórtice en la solución en tubos de 1,5 mililitros a 114 microlitros de suspensión de heces y mezclado por mensajes de texto de posguerra. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar las muestras por pulsos.

Agregue etanol a las muestras y mezcle por mensaje de texto de posguerra durante 15 segundos. A continuación, centrifugar brevemente, aplicar la solución a la columna de centrifugación en un tubo de recolección mínimo de dos. Tira de la fuga.

A continuación, coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recolección. Lave la columna con ARN unido utilizando un tampón A W uno sin centrífuga RAN portadora. Coloque la columna en un tubo de recolección limpio de dos mililitros y observe la columna con tampón.

Una centrífuga W2 a toda velocidad coloca una columna de clavijas en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros y centrifugación a toda velocidad. Y eleve el ARN usando un tampón de ARN viral almacenado por VE a menos 70 grados Celsius hasta que use la detección de neurovirus en el ARN extraído por PCR en tiempo real de un paso con sondas techman específicas para hacer una mezcla de ratón para el grupo geno uno y el grupo Dina dos, mantenga su mezcla de enzima RT en hielo durante el ensayo. La configuración del kit contiene el siguiente dominio del agua PCO, dos huevos, cebadores y sondas para Dina.

Cebadores del grupo uno y sonda para Dina Grupo dos. Y, por último, el reactivo de vórtice H de mezcla de enzimas RT antes de usar QU para PCR agua, la mezcla maestra dos cebadores X, coca-cola G, un verso hacia adelante y hacia atrás, y anillo de sonda, uno A y un B para UniGroup. Un músculo mezcla y ceba COG G, dos para VA verso y sonda.

Anillo dos para la mezcla maestra de Theo Group two. Y, por último, añadir una enzima artix a las dos mezclas musculares del grupo INO. Vórtice y alco 10 microlitros de la mezcla muscular adecuada a los pozos de reacción.

En otro armario, agregue cinco microlitros de ARN sin diluir, cinco microlitros, G uno y G dos de ARN de control positivo y cinco microlitros de control negativo a las ruedas de reacción correspondientes. Agotar la centrífuga durante 10 segundos a 6.000 g. En el paso uno, el software muestra la configuración avanzada.

Y en la pantalla de propiedades del experimento, el experimento se identifica como norovirus. El tipo de experimento es presencia o ausencia en la pantalla de destino. Introduzca el nombre del objetivo que desea detectar en la placa de reacción PCR.

Gina, la familia reportera del grupo uno y dos y Tamara en la pantalla de muestra y réplica. Introduzca el número de muestras y los controles positivos y negativos incluidos en la placa de reacción y, a continuación, seleccione las muestras o la dirección del objetivo que desea configurar en el método de ejecución. Primero, haga una transcripción inversa a 50 grados Celsius para la síntesis de ADN complementario.

A continuación, eleve la temperatura a nueve o cinco grados centígrados para activar una polimerasa de arranque en caliente. Comience el ciclo por duración a nueve a cinco grados centígrados, seguido de un paso combinado de rodillas y amplificación a 60 grados centígrados. Repita un ciclo de cuatro a cinco veces, regrese a la configuración de la placa.

Haga clic en Guardar una plantilla y guarde el experimento. Haga clic en iniciar ejecución. La pantalla de gráfico de amplificación le permite ver la amplificación de la muestra a medida que su instrumento recopila datos congelados durante una ejecución, así como el contraste del gráfico.

Fluorescencia de inmersión normalizada y número de ciclo. En los ciclos iniciales de PCR, hay pocos cambios en la señal fluorescente. Esto define la línea de base.

Un aumento en la fluorescencia con respecto a la línea de base indica la detección de un objetivo acumulado. Se debe establecer un umbral fluorescente fijo alrededor de la línea de base. El parámetro ciclo umbral CT se define como el número de ciclo fraccionario en el que la fluorescencia supera el umbral fijo.

La pantalla del gráfico de amplificación es útil para identificar y examinar la amplificación anormal, como el aumento de la fluorescencia en los pocillos de control negativos y la ausencia de fluorescencia detectable en un ciclo esperado. El método del kit es fiable, pero requiere una enorme cantidad de tiempo y recursos. Aquí hemos mostrado un método igualmente confiable que es rentable y se utiliza fácilmente en los reactivos del país, evitando la dependencia de materiales comprados en el extranjero, todo lo cual conducirá en última instancia a un diagnóstico más accesible y un tratamiento rápido de las causas virales más comunes de gastroenteritis en niños Utilizando el método económico interno para aislar ácidos nucleicos, que obtuvieron resultados similares a aquellos.

Obtenido con el kit comercial de Kerogen, junto con el TAC MAN, R-T-P-C-R, que fue desarrollado en nuestro laboratorio. Podemos detectar una amplia gama de infecciones por neurovirus. El ensayo ha demostrado ser útil para el diagnóstico de rutina, ya que elimina el procesamiento del producto posterior a la amplificación, acortando así el tiempo del ensayo.

Además del diagnóstico, el protocolo también se puede utilizar para aclarar la epidemiología de la infección por neurovirus, siendo útil para el control de salud pública de esta enfermedad.