Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía confocal y de superresolución combinada

Comience con fibras musculares murinas químicamente fijadas y permeabilizadas colocadas en los pocillos de una placa de pocillos múltiples.

Incubar en una solución de bloqueo para minimizar la unión de anticuerpos no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a una proteína presináptica expresada en la unión neuromuscular o NMJ.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los anticuerpos primarios y una neurotoxina conjugada con fluoróforos que se une a los receptores de acetilcolina postsinápticos.

Lavar con tampón para eliminar los reactivos no unidos.

Coloque las fibras en un portaobjetos con medios de montaje, coloque un cubreobjetos y asegúrelo con imanes cilíndricos para aplanar las fibras.

Comience a obtener imágenes con un microscopio confocal-STED.

Tras la iluminación láser, las proteínas marcadas emiten fluorescencia.

La microscopía confocal no resuelve estructuras NMJ más finas con claridad debido a su resolución limitada y propagación de fluorescencia.

Por el contrario, la microscopía STED utiliza un láser de agotamiento para suprimir la propagación de la fluorescencia, lo que permite una visualización clara de la NMJ.

Después de la eutanasia, comience a provocar los músculos tibiales anteriores en pequeños haces de fibras de aproximadamente 1 milímetro de ancho con dos pinzas dentadas finas. Luego, transfiera estos haces musculares a una placa de 24 pocillos que contenga Triton X-100 al 1% preparada en PBS y déjela agitar suavemente durante una hora a temperatura ambiente o cinco horas a 4 grados centígrados.

Después de lavar las muestras tres veces durante 5 minutos con PBS a temperatura ambiente, incube las muestras con una solución de bloqueo compuesta de BSA al 4% preparada en PBS con Triton X-100 al 1% durante cuatro horas a 4 grados centígrados bajo agitación suave. Luego, incube las muestras durante la noche con la misma solución de bloqueo que contiene anticuerpos monoclonales primarios contra el neurofilamento M o la glicoproteína 2 de la vesícula sináptica para marcar los terminales del axón presináptico o las zonas activas, respectivamente.

Al día siguiente, lave los haces musculares etiquetados tres veces durante 5 minutos con PBS bajo agitación suave. Luego incubarlos con anticuerpos secundarios apropiados colocándolos en un agitador durante dos horas a temperatura ambiente. Después de lavar los haces musculares nuevamente, colóquelos en un tobogán con medio de montaje. Luego coloque un cubreobjetos de vidrio de grado 1.5 en la parte superior, seguido de imanes cilíndricos en ambos lados del portaobjetos para aplicar presión y aplanar los músculos.

Para adquirir imágenes con el microscopio confocal, inicie el software del microscopio y elija Máquina como modo de configuración, y recopile pilas de imágenes de las uniones neuromusculares en cada grupo experimental según la configuración mencionada en el manuscrito de texto. Al final de la sesión, haga clic en Abrir en el visor 3D y elija una unión neuromuscular representativa de un grupo experimental para visualizar el etiquetado 3D.