De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Hola, soy Kara Ted, soy Leo. Ve a mí. Y yo soy Simon McQueen Mason.

La digestibilidad de la biomasa vegetal es un tema de gran interés en la actualidad. Esto se debe a que hay una gran cantidad de azúcares ligados a los polisacáridos de las paredes celulares de las plantas que componen esta biomasa, y si podemos obtener esos azúcares en forma utilizable, podemos fermentarlos para producir todo tipo de productos, como combustibles y productos químicos. Desafortunadamente, estos materiales son extremadamente difíciles de digerir y obtener una mejor comprensión de lo que controla esa digestibilidad es una cuestión de cierta urgencia.

Por lo tanto, para poder utilizar el material vegetal para la producción de grupos de renovación, debemos ser capaces de medir el potencial de fabricación en estas plantas. Así que aquí en la Universidad de York, estamos examinando grandes poblaciones de material vegetal para determinar su potencial de ficación. La ficación es el proceso de descomponer carbohidratos complejos en sus componentes monosacáridos para producir productos químicos valiosos a través de diferentes procesos industriales.

Para medir el potencial de ficación, reproducimos procesos industriales a nivel microescala donde sometemos la biomasa a un pretratamiento e hidrólisis enzimática para determinar los azúcares liberados. De esta manera se identifican variedades interesantes en los genotipos. El sistema de alto rendimiento funciona en un formato de placa IG de seis pocillos.

Las condiciones leves de hidrólisis se utilizan para exponer diferencias sutiles entre los genotipos, y también es lo suficientemente flexible como para soportar diferentes materiales de sustrato, así como para evaluar diferentes enzimas. El método que utilizamos consiste en formatear el material vegetal en forma de polvo, que luego se trata previamente con un ácido diluido o alcalino a 90 grados durante 20 minutos. A continuación, se realiza una digestión enzimática utilizando una mezcla comercial de celulasa a 50 grados durante ocho horas.

Por último, se utiliza el método MBTH para determinar la liberación de azúcares reductores. El material vegetal se cosecha en forma de tallos secos, que se cortan en segmentos de cuatro milímetros. Estos se colocan en viales de dos mililitros junto con tres bolas de metal de cinco milímetros.

Los viales se etiquetan individualmente con códigos de barras, que se escanean para garantizar la trazabilidad de las muestras. Las muestras se cargan en los robots de molienda y formateo de los robots. Las muestras se muelen automáticamente y se mezclan para permitir la dispensación de la biomasa en una placa de 96 pocillos.

Los viales se perforan, luego el vial se reposiciona en el brazo robótico para que quede dentro de un embudo que vibra para dispensar el polvo. La vibración del embudo está regulada por una balanza para alcanzar la cantidad objetivo de masa por pocillo dispensado. La biomasa se dispensa en 10 columnas de las placas, dejando dos columnas para los estándares.

Al hacer cuatro repeticiones por muestra, cargamos 20 muestras por placa. El hidrolizado de esta placa se triplicará en placas de PCR, dando como resultado tres placas ópticas. De esta forma, tenemos tres determinaciones de azúcares reductores por pocillo de biomasa.

Una vez formateadas, las placas se sellan con una estera de silicona para evitar la evaporación. Cuando están listos, se trasladan al robot de manipulación de líquidos. En la manipulación de líquidos, el pretratamiento robotizado, la hidrólisis enzimática y la determinación de los azúcares liberados se realizan automáticamente.

La mesa de dos metros tiene contenedores para los diferentes reactivos necesarios, así como espacio de almacenamiento para los utensilios de plástico. Existen incubadoras para el pretratamiento y la hidrólisis, así como termocicladores para la determinación del azúcar. El pretratamiento se realiza en la placa de pocillo profundo.

Añadiendo soluciones ácidas o alcalinas diluidas al polvo de biomasa. Las placas se transfieren al bloque calefactor y se incuban a 90 grados durante 20 minutos. Una vez finalizada esta incubación, se retira el pretratamiento enjuagando cinco veces con tampón de acetato de 500 microlitros.

Una vez que se enjuaga el pretratamiento, se agrega un cóctel de enzimas. Es una mezcla estándar. Contiene celulosa, una novozima 1,8 8 en una proporción de cuatro a uno como una concentración de siete FPU por pocillo.

Las placas se incuban durante ocho horas a 50 grados mientras se agitan y se transfieren 75 microlitros del hidrolizado resultante a una placa de PCR. En las columnas 11 y 12 de las placas de PCR se añaden los patrones de glucosa.

A continuación, se añaden 25 microlitros de un molar de hidróxido de sodio a todos los pocillos. Finalmente, se pipetean 50 microlitros de reactivo MBTH en la placa de PCR. La placa de pozo profundo se almacena después de la finalización de la transferencia del hidrolizado a la tercera placa de PCR.

Mientras que las placas de PCR se trasladan a los termocicladores para su incubación a 60 grados durante 15 minutos. El paso final del proceso es la transferencia de la mezcla de reacción a placas ópticas para el desarrollo del color. Después de la incubación, las placas de PCR se retiran del termociclador.

Se añaden cien microlitros de reactivo oxidante a la mezcla de reacción transferida. Para facilitar el desarrollo del color, el proceso de manejo de líquidos se ejecuta cuatro veces en 24 horas, donde el enjuague previo al tratamiento, una adición de enzima tarda aproximadamente dos horas. La hidrólisis enzimática tarda ocho horas y la determinación del azúcar tarda otras dos horas.

Mientras la primera placa se incuba durante ocho horas, la siguiente placa comienza el proceso. Con esta asignación de recursos del robot, se logra una producción de 80 muestras por día para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados. Las placas ópticas tienen una capacidad nominal de 620 nanómetros.

Los resultados que se obtienen se analizan para cuantificar los azúcares liberados en forma de nanomoles por miligramo por hora de reacción. Así que gracias por mirar, y espero que esto inspire su investigación sobre biocombustibles.