Name: De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprende un método de alto rendimiento para evaluar la sacarificación de biomasa lignocelulósica mediante plataforma automatizada. Este protocolo permite analizar 80 muestras diarias para seleccionar variedades óptimas en producción de biocombustibles.

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Los autores desean agradecer a un Viksø-Nielsen (Novozymes) por el don de las enzimas celulolíticas. Este trabajo fue financiado por el 7PM RENOVACIÓN y por los proyectos de BBSRC BB/G016178 y BB/G016194.

1. Preparación de las muestras Normalmente trabajo con tallos herbáceos o de cualquiera de las plantas leñosas. En el caso de las materias herbáceas que crecen las plantas a la madurez, y después de desarrollo de la semilla que obtenemos los tallos secos, una vez se haya completado la senescencia. Los tallos se cortan en segmentos de 4 mm y se colocan en viales de 2 ml con tres bolas de molienda. En el caso de materiales leñosos, las muestras se muelen a grueso aserrín de madera con un archivo de curso y se coloca en un molino de bolas para su posterior procesamiento. Las muestras se colocan en un estante en la molienda / formato de la estación (Figura 1). Esta estación forma secuencial muele, se mezcla, y un peso de cada muestra. El número de repeticiones necesarias para cada muestra se estableció mediante pruebas de los materiales del suelo en una serie de experimentos preliminares en donde se determina la variabilidad intrínseca de un tamaño de partícula determinado. Los viales de 2 ml se perforan en la parte inferior y los materiales son distribuidos por la vibración de la ampolla en el pozo seleccionado. El brazo de vibración es controlada por una retroalimentación del equilibrio que permite la dosificación precisa de la pólvora. El robot dispensa 4 mg / pocillo en un análisis estándar y 4 repeticiones son necesarias en la mayoría de los casos. Esto permite que 20 muestras de plantas / placa para ser analizados. 2. Pretratamiento Una vez que las muestras tienen el formato, las placas de 96 pozos son procesadas por un sistema automatizado de manejo de líquidos (Figura 2). Aquí un pretratamiento suave se realiza en los materiales vegetales mediante la adición de 350 l de soluciones ácidas o alcalinas y el calentamiento de la placa en un edificio adaptado. Para evitar la evaporación durante el análisis, el 96 y placas se sellan con un mate de silicona. La temperatura y el tiempo de la pre-tratamiento se puede modificar de acuerdo a los materiales objeto de estudio. La temperatura máxima, sin embargo, es de 100 ° C. Un procedimiento alternativo para la prueba más dura pretratamientos es dar tratamiento previo a los materiales fuera de línea y eliminar la pretreatmet del proceso. 3. Hidrólisis <ol><li> Después de que los materiales son tratados previamente, el robot elimina automáticamente la solución pre-tratamiento, y se lava, todos los pozos, 5 veces con 850 l de tampón acetato 25 mM. Los enjuagues se llevan a cabo mediante la adición de tampón de la solución pre-tratamiento, y posteriormente retirar el 50% del volumen total después de permitir que los sólidos en la muestra a un acuerdo. La altura de la aspiración es igual a la mitad de la masa líquida para evitar la aspiración de sólidos desde el fondo del pozo, hay una pérdida insignificante de los sólidos utilizando este enfoque. Después de estas soluciones el pH en el pozo es de 4,5 y el material está listo para la hidrólisis enzimática. </li><li> Una mezcla de enzimas que contienen una solución de celulasas y hemicelulasas se añade por el robot. En cada pozo, 850 l de mezcla de enzimas se dispensa y la placa se mueve en un 50 ° C incubadora de agitación. La hidrólisis se lleva a cabo estándar de 8 horas, pero esta vez se puede adaptar a la finalidad del experimento. La carga de la enzima estándar utilizado para los pastos es de 7 FPU / g de material. </li></ol> 4. La detección de azúcares reductores Determinación de azúcares reductores liberados después de la hidrólisis se realizó mediante una modificación de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrozona (MTBH) el método 3. MBTH fue seleccionado como el método más adecuado, porque era el más fácil de automatizar y el menos susceptible a la interferencia de estos compuestos como las proteínas. Hemos modificado este método altamente sensible para su uso en la plataforma robótica para que pueda cuantificar con precisión los azúcares en las concentraciones presentes en los hidrolizados de biomasa, con un volumen final de 250 l, que es adecuado para un nivel óptico de 96 pocillos. Todos los pasos se realizan automáticamente y tres determinaciones independientes de los azúcares reductores se llevaron a cabo para cada reacción de sacarificación. <ol><li> 30 l de hidrolizado fue tomada de la placa de pozo profundo y se mezcla con 45 l de 25 mM de tampón acetato de sodio en una falda PCR 96 pocillos. </li><li> 25 l de NaOH 1N y 50 l de una solución que contiene 0,43 mg / ml y 0,14 MBTH TDT mg / mL. </li><li> Después de mezclar, la placa de PCR se calentó a 60 ° C durante 20 minutos en un termociclador o un dispositivo similar que ofrece exactamente la misma cantidad de calor para los 96 pozos. </li><li> La reacción resultante se transfirió a una placa óptica. </li><li> Añadir 100 ml de reactivo oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfámico y el 0,1% HCl). Mezclar bien y dejar a desarrollar por lo menos durante 1 h. </li><li> Cada plato debe contener también las reacciones estándar de 50 nmol, 100 y 150 nmol glucosa nmol. Las placas se leen óptica a 620 nm. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Ejemplos de diferentes tipos de análisis se presentan en la figura 3 y 4. Todos los resultados se obtuvieron mediante el uso de la plataforma automatizada. Figura 3 representa el aumento de los azúcares reductores liberados por 8 h incubaciones de álamo suelo con cantidades crecientes de enzimas celulolíticas. La Figura 4 muestra los efectos del ácido alcalino y pretratamiento de las muestras de álamo. El pretratamiento con NaOH es más eficiente que el pretratamiento con H2SO4 diluido para facilitar la liberación de los azúcares en la hidrólisis. La cantidad de azúcares medidos después de la hidrólisis disminuye cuando el tratamiento previo se realiza con concentraciones superiores a 1M NaOH. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Robótico de la Estación para la molienda y el 96 y el formato de la biomasa <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estación de manejo de líquidos para el análisis de rendimiento de sacarificación de alta <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Efecto de las cargas de enzimas diferentes en el lanzamiento de la reducción equivalente de azúcar a partir de muestras de álamo <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Efecto de pretratamientos diferentes en la sacarificación de las muestras de álamo. Azúcares A. en libertad después de pretreament con diferentes porcentajes de H2SO4 a 90 ° C durante 30 minutos. B. Azúcares en libertad después de pretratamientos de NaOH a la misma temperatura y el tiempo que el pretratamiento con ácido .

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

Pueden utilizarse variaciones del protocolo estándar de sacarificación en la misma plataforma para determinar la actividad de enzimas celulolíticas (es decir, mediante la variación de las concentraciones de enzimas utilizadas en una placa, así como empleando papel como sustrato); comparación de la eficiencia de varias mezclas enzimáticas sobre un material específico; curso temporal de la sacarificación; etc.
Un protocolo estándar de sacarificación para comparar el potencial de sacarificación en diferentes materiales vegetales implica una hidrólisis de ocho horas (Figuras 3 y 4). La mayoría de los materiales vegetales analizados requieren cuatro réplicas. Bajo estas condiciones, la plataforma puede procesar 80 muestras/día. Este análisis se está utilizando para tamizar grandes poblaciones de cebada, maíz y brachypodium con el fin de establecer la variabilidad en el potencial de sacarificación y los genes involucrados en su determinación4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Molienda y pesaje robot </td><td> Labman Automatización </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml micro tubo con tapas </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.694 </td></tr><tr><td> 5 cuentas de acero inoxidable de </td><td> Qiagen Ltd </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1,2 ml ABgene cuadrados y las placas de almacenamiento </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Whatman tapa alfombra para 96 ​​placas cuadradas </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Robot hanling líquido </td><td> Tecan Group Ltd. </td><td> Libertad Evo 200 </td></tr><tr><td> De ácido sulfúrico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> De hidróxido de sodio </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> Acetato de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> El ácido acético </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96 y placas de PCR falda </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona hidratos de clorhidrato de </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129739-25G </td></tr><tr><td> DL-ditiotreitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning microplaca de 96 inferior y plana </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> Amonio y hierro (III) sulfato dodecahidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> Sulfámico ácido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242 772-500g </td></tr><tr><td> Ácido clorhídrico </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polisacáridos que forman la biomasa lignocelulósica planta se puede dividir para producir una amplia gama de azúcares que puedan ser utilizados posteriormente en el establecimiento de una biorrefinería. Estas materias primas que constituyen una nueva plataforma industrial, que sea sostenible y neutral de carbono, para reemplazar a la actual dependencia de combustibles fósiles. La obstinación de la deconstrucción observado en los materiales lignocelulósicos es producido por varias propiedades intrínsecas de las paredes celulares vegetales. Celulosa cristalina está integrada en los polisacáridos de la matriz como xilanos y arabinoxilanos, y toda la estructura está recubierta por el fenólicos polímero de la lignina, que es también difícil de digerir 1. Con el fin de mejorar la digestibilidad de las materias vegetales que tenemos que descubrir los principales obstáculos para la sacarificación de las paredes celulares y mutante de la pantalla y las poblaciones de mejoramiento para evaluar la variabilidad en la sacarificación 2. Estas tareas requieren un enfoque de alto rendimiento y aquí se presenta una plataforma de análisis que puede realizar un análisis de sacarificación en un formato de placa de 96 pocillos. Esta plataforma ha sido desarrollada para permitir la detección de la digestibilidad de la materia leñosa de las grandes poblaciones de especies de plantas variadas. Hemos reducido los volúmenes de reacción para el pretratamiento suave, la hidrólisis enzimática parcial y la determinación de azúcar, para permitir que un gran número para ser evaluados rápidamente en un sistema automatizado. Esta plataforma automatizada trabaja con cantidades de miligramos de biomasa, rendimiento de molienda por bolas en condiciones controladas para reducir el material vegetal a un tamaño de partícula estándar de una manera reproducible. Una vez que las muestras son de tierra, el robot automatizado formato dispensa cantidades específicas y del material registrado en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pozos profundos (Figura 1). Normalmente, dispensar el mismo material en 4 pozos de tener 4 repeticiones para el análisis. Una vez que las placas se llena con el material vegetal en el diseño deseado, que se mueven manualmente a una estación de manejo de líquidos (Figura 2). En esta estación las muestras son sometidas a un tratamiento previo leve, ya sea con ácido diluido o alcalino y se incubaron a temperaturas de hasta 90 ° C. La solución de pre-tratamiento se retira posteriormente y las muestras se lavan con tampón para volver a un pH adecuado para la hidrólisis. Las muestras se incubaron con una mezcla de enzimas durante un período variable de tiempo a 50 ° C. Una alícuota se toma a partir del hidrolizado y los azúcares reductores se determina automáticamente por el método colorimétrico MBTH.

Un método simple, rápido para determinar el potencial de la sacarificación de un gran número de muestras de biomasa vegetal se describe. La plataforma automatizada para este análisis consiste en la preparación de la biomasa vegetal para su análisis en placas de 96 pozos y la realización posterior de pretratamiento, hidrólisis y la cuantificación de los azúcares liberados.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

Los polisacáridos que componen la biomasa lignocelulósica de las plantas pueden degradarse para producir una variedad de azúcares que posteriormente pueden utilizarse para establecer...

Hola, soy Kara Ted, yo soy Leo. Adelante conmigo. Y yo soy Simon McQueen Mason.La digestibilidad de la biomasa vegetal es un tema de gran interés en la actualidad. Esto se debe a que existe una gran cantidad de azúcares atrapados en los polisacáridos de las paredes celulares vegetales que componen dicha biomasa, y si logramos liberar esos azúcares en una forma utilizable, podemos fermentarlos para producir todo tipo de productos, como combustibles y productos químicos. Desafortunadamente, estos materiales son extremadamente difíciles de digerir, y comprender mejor qué controla su digestibilidad es un asunto de cierta urgencia.Por lo tanto, para poder utilizar material vegetal en la producción de grupos renovables, necesitamos ser capaces de medir el potencial de fificación en estas plantas. Aquí, en la Universidad de York, estamos analizando grandes poblaciones de material vegetal para determinar su potencial de fificación. La fificación es el proceso de descomponer carbohidratos complejos en sus componentes de monosacáridos para producir productos químicos valiosos mediante diferentes procesos industriales.Para medir el potencial de fermentación, reproducimos procesos industriales a escala microscópica, en los que sometemos la biomasa a un pretratamiento e hidrólisis enzimática para determinar los azúcares liberados. Esto permite identificar variedades interesantes en genotipos. El sistema de alto rendimiento funciona en un formato de placa de seis pocillos IG.Se utilizan condiciones suaves de hidrólisis para exponer diferencias sutiles entre genotipos, y también es lo suficientemente flexible como para admitir diferentes materiales sustrato y evaluar distintas enzimas. El método que utilizamos implica la preparación del material vegetal en forma de polvo, que luego se pretrata con un ácido o álcali diluido a 90 grados durante 20 minutos. A continuación, se realiza una digestión enzimática utilizando una mezcla comercial de celulasa a 50 grados durante ocho horas.Finalmente, se utiliza un método MBTH para determinar la liberación de azúcares reductores. El material vegetal se cosecha como tallos secos, que se cortan en segmentos de cuatro milímetros. Estos se colocan en viales de dos mililitros junto con tres bolas metálicas de cinco milímetros.Los viales están etiquetados individualmente con códigos de barras, que se escanean para garantizar la trazabilidad de las muestras. Las muestras se cargan en los robots de molienda y acondicionamiento dentro de los robots. Las muestras se muelen y mezclan automáticamente para permitir la dispensación de la biomasa en una placa de 96 pocillos.Los viales son perforados, luego se reposiciona el vial en el brazo robótico de manera que quede colocado dentro de un embudo que vibra para dispensar el polvo. La vibración del embudo se regula mediante una balanza para alcanzar la cantidad objetivo por masa por pocillo que se dispensa. La biomasa se dispensa en 10 columnas de las placas, dejando dos columnas para los estándares.Al realizar cuatro repeticiones por muestra, cargamos 20 muestras por placa. El hidrolizado de esta placa se triplicará en placas de PCR, resultando en tres placas ópticas. De esta manera, tenemos tres determinaciones de azúcares reductores por pocillo de biomasa.Una vez preparadas, las placas se sellan con una lámina de silicona para evitar la evaporación. Cuando están listas, se trasladan al robot de manipulación de líquidos. En el robot de manipulación de líquidos, el pretratamiento, la hidrólisis enzimática y la determinación de los azúcares liberados se realizan automáticamente.La mesa de dos metros tiene contenedores para los diferentes reactivos necesarios, así como espacio de almacenamiento para el material plástico. Hay incubadoras para la pretratamiento e hidrólisis, así como termocicladores para la determinación de azúcares. El pretratamiento se realiza en la placa de pocillos profundos.Mediante la adición de soluciones diluidas de ácido o alcalinas al polvo de biomasa. Las placas se transfieren al bloque calefactor y se incuban a 90 grados durante 20 minutos. Una vez finalizada esta incubación, el pretratamiento se elimina lavando cinco veces con 500 microlitros de tampón acetato.Una vez que se ha eliminado el pretratamiento mediante lavado, se añade un cóctel enzimático. Es una mezcla estándar que contiene celulasa y una novozima 1, 8 8 en una proporción de cuatro a uno, con una concentración de siete FPU por pocillo.Las placas se incuban durante ocho horas a 50 grados bajo agitación. Se transfiere 75 microlitros del hidrolizado resultante a una placa de PCR. En las columnas 11 y 12 de las placas de PCR, se añaden los patrones de glucosa.A continuación, se agregan 25 microlitros de hidróxido de sodio uno molar a todos los pocillos. Finalmente, se pipetean 50 microlitros del reactivo MBTH en la placa de PCR. La placa de pocillos profundos se almacena tras completar la transferencia del hidrolizado a la tercera placa de PCR.Mientras tanto, las placas de PCR se trasladan a los termocicladores para la incubación a 60 grados durante 15 minutos. El paso final del proceso es la transferencia de la mezcla de reacción a placas ópticas para el desarrollo del color. Tras la incubación, se retiran las placas de PCR del termociclador.Se añaden cien microlitros de reactivo oxidante a la mezcla de reacción transferida. Para facilitar el desarrollo del color, el proceso de manipulación de líquidos se realiza cuatro veces en 24 horas, donde el enjuague previo al tratamiento y la adición de enzima toman aproximadamente dos horas. La hidrólisis enzimática dura ocho horas, y la determinación del azúcar requiere otras dos horas.Mientras la primera placa se incuba durante ocho horas, la siguiente placa comienza el proceso. Con esta asignación de recursos robóticos, se logra un rendimiento de tres tandas de 80 muestras por día para determinar la cantidad de azúcares reductores liberados. Las placas ópticas se leen a 620 nanómetros.Los resultados que se obtienen se analizan para cuantificar los azúcares liberados como nanomoles por miligramo por hora de reacción. Gracias por ver este video y espero que esto inspire su investigación en biocombustibles.

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Investigación

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Biología

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