Name: La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Aprende a estudiar la adhesión bacteriana bajo tensión de cizallamiento usando cámaras de flujo y células endoteliales. Este método permite cuantificar la colonización de Neisseria meningitidis en condiciones fisiológicas similares a la sangre.

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Los autores desean agradecer a Emilie Mairey y Donnadieu Emmanuel para la instalación inicial del procedimiento.

1. Célula huésped humana y un cultivo bacteriano <ol><li> HUVECs la cultura entre el paso 1 y 9 a 37 ° en una incubadora humidificada con un 5% (v / v) de CO 2. El paso de las células cuando se acercan a 80% de confluencia con tripsina / EDTA para proporcionar el mantenimiento de las culturas 75 frascos de cultivo de 2 cm y cultivos experimentales en cámaras de flujo desechables (μ-Slides VI). </li><li> Retirar medio de los frascos que pases, se lavan las células con 10 ml de PBS, retirar y reemplazar con 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que las células de separar en un cultivo celular incubadora durante 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Recoger las células con 10 ml de medio de cultivo celular en un tubo de 15 ml de colección. Que sedimenten las células con una centrifugación de 5 minutos (a 200 g), a temperatura ambiente. Suspender las células en 4 ml de Endo-SFM complementado con un 10% (v / v) de SFB y contar con ellos en una cámara de Malassez, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Introducir 30 l de una 1x10 6 células HUVEC por ml de suspensión en el canal (3x10 4 en total) y permitir que las células se adhieran durante 3 horas a 37 º en un incubador humidificado con una atmósfera de 5% (v / v) de CO 2. Añadir un volumen adicional de 120 l de Endo-SFM para llenar los pozos. Las células deben formar una monocapa subconfluentes (Figura 2). </li><li> Crecer N. meningitidis que expresan GFP (en este caso la cepa 8013 GFP expresa bajo el control de un promotor de IPTG-inducible), en placas de agar GCB suplementos que contienen Kellogg y 5 mg / ml de cloranfenicol a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% (v / v) de CO 2 durante 16 horas. </li></ol> 2. Adhesión inicial de las bacterias individuales a las células huésped <ol><li> Ajustar la concentración de bacterias cultivadas en placas de agar GCB a un OD 600 de 0,05 con pre-calentado Endo-SFM contiene un 10% (v / v) de SFB y se incuba durante 120 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% (v / v) de CO 2, bajo agitación suave (130 rpm). Inducir la expresión de GFP mediante la adición de 1 mM IPTG al medio de cultivo para el período de incubación. </li><li> Coloque el desechables μ-Slide en el escenario de un microscopio invertido equipado con una plataforma de calefacción para mantener la temperatura de la muestra a 37 ° C. </li><li> Vierta precalentado Endo-SFM suplementado con 2% (v / v) FBS en un vaso de vidrio estéril y llene una jeringa estéril de 50 ml con este medio. Coloque la "entrada" tubo a la jeringa y llenar con la introducción de mediano plazo. </li><li> Conecte la "entrada" tubo a la μ-Slide, con cuidado, con el fin de evitar la introducción de aire en la cámara. Luego, colocar la "salida" del tubo al otro extremo y con mucho cuidado rellenar el canal con un medio de distancia de aproximadamente 1 cm de la cámara de "salida". </li><li> Medir el OD600 bacteriana y ajustarse a las 0.15 en Endo-SFM contiene un 2% (v / v) de SFB. Con el fin de observar las bacterias individuales, los agregados deben ser interrumpidos por agitación vigorosa de la muestra bacteriana. </li><li> Colocar 100 l de Endo-SFM suplementado con 2% (v / v) FBS medio en el depósito y añadir 100 ml de la solución bacteriana tomado de la parte superior de la solución de vortex para evitar cualquier toma de muestras de agregados de bacterias restantes. </li><li> Con cuidado introducir el volumen de 200 l en la μ-Slide girando la llave de paso para inyectar las bacterias en la cámara. </li><li> Introducir Endo-SFM contiene un 2% (v / v) de SFB, mantiene a 37 ° C con la plataforma de calefacción, en la cámara utilizando una bomba de jeringa con una tensión de corte compatible con la adhesión de 0.044 dinas / cm 2 durante 15 minutos. </li></ol> Véase, por vídeo o un gráfico 3 ejemplo. Después de este paso, ya sea ir a las secciones 3, 4 o 6. 3. La cuantificación de la adhesión inicial de las bacterias individuales a las células huésped <ol><li> Después de la adhesión inicial de 15 minutos, obtener imágenes de los diez campos al azar, mientras que el líquido esté todavía en circulación. </li><li> Analizar las imágenes obtenidas mediante el software ImageJ 8, con el fin de acceder a la media del número de bacterias adherant por campo. Esto se hace de la siguiente manera: en primer lugar, cada imagen es un umbral a través del "umbral" de la ventana se encuentra en el menú "Imagen" para poner de relieve la adhesión individuales bacterias fluorescentes, y reducir al mínimo el fondo de las celdas. Entonces, cada bacteria individual sea contado, utilizando el plug-in "contador de células" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Los datos de cada imagen se presentan en una hoja de cálculo Excel y se promedian para cuantificar el número medio de bacterias adheridas por campo. </li></ol> 4. La medición de la resistencia al flujo de las bacterias individuales adheridas a las células huésped <ol><li> Programa de la jeringa de la bomba puesta en marcha para generar la tensión de corte que van desde 3 hasta 100 dinas / cm 2 durante 5 minutos. </li><li> Al final de los 5 minutos, adquirir diez campos elegidos al azar como se describe en el paso 3.1, pero con el flujo se detuvo prior a la adquisición. </li><li> Analizar las imágenes obtenidas como se describe en el paso 3.2 y cuantificar el número medio de bacterias que permanecen en cada campo. </li></ol> 5. Medir el crecimiento de una bacteria aislada a un adherente microcolonia <ol><li> Introducir Endo-SFM contiene un 10% (v / v) de SFB, mantiene a 37 ° C con la plataforma de calefacción, en la cámara utilizando una bomba de jeringa con la tensión de corte elegido por varias horas. Graba imágenes de microscopía de vídeo en tiempo real en un marco cada 5 minutos. </li><li> Después de la microscopía de vídeo, detener el esfuerzo cortante al desactivar la bomba de jeringa, adquirir imágenes adicionales y 2-3 y luego se detiene la secuencia de adquisición de imágenes en el software. Un ejemplo de la proliferación bacteriana se puede ver en el vídeo 2. </li></ol> 6. La medición de la resistencia al flujo de adherentes microcolonias bacterianas <ol><li> Después de la formación de microcolonias grandes en la superficie celular (step5.2) 2-3 adquirir imágenes de las dos células (por contraste de fase) y bacterias (por las buenas prácticas agrarias de fluorescencia) antes de la aplicación de flujo. Para el resto del experimento, el protocolo de adquisición del monitor sólo la fluorescencia. </li><li> La aplicación de esfuerzo cortante alto por 5 minutos (300 a 100 dinas / cm 2) y grabar imágenes en un marco cada 5 segundos. </li><li> Detener el esfuerzo cortante al desactivar la bomba de jeringa, adquirir imágenes adicionales y 2-3 y luego se detiene la secuencia de adquisición de imágenes en el software. </li><li> A continuación, retire la "salida" tubo de primera y con cuidado, para evitar el vaciado del canal y luego añadir pre-calentado medio fresco para llenar los pozos antes de retirar la "entrada" la tubería. </li><li> Para valorar el efecto del esfuerzo cortante en la resistencia bacteriana, un ensayo de recubrimiento puede llevarse a cabo de la siguiente manera: recoger el medio restante y se lava la μ-Slide dos veces con 120 l de PBS, que elimina el medio restante de la canal (ambas coladas se ) también recogió. </li><li> Separar las células infectadas con la adición de 50 l de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° y mezclar esta muestra individual con la suspensión recogidos en el paso anterior. </li><li> Realizar diluciones seriadas en PBS y la placa de una fracción de 10 l en placas de agar GCB, por triplicado, con el fin de determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) al día siguiente, después de la incubación de las placas a 37 ° C en una incubadora con 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Videos 3 y 4 comparan la cepa de tipo salvaje con el mutante pilV. 7. Desprendimiento de microcolonias bacterianas <ol><li> Infectar a las células en la cámara de flujo repitiendo los pasos 2.1 a 2.8 y permitir que la infección siga por 30 minutos. </li><li> Eliminar las bacterias desatado por el aumento del flujo a 10 dinas / cm 2 para un período de 2 minutos y dejar que continúe la infección durante 2 horas. </li><li> Reducir el flujo a 0,15 dinas / cm 2. </li><li> Cada hora, se recoge una gota de medio de salir de la cámara de flujo. </li><li> Realizar diluciones seriadas de las muestras y la placa que en placas de agar GCB. </li><li> Determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) al día siguiente, después de la incubación de las placas a 37 ° C en una incubadora con 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Las diferentes etapas de una monocapa celular que puede ser observado y medido en la presencia de flujo en el procedimiento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: monocapa de células endoteliales en la cámara de flujo en el inicio de un experimento (ausencia de tensión de corte). Alrededor del 50 por las células endoteliales se organizan en una sola capa sub-confluentes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: Representación gráfica de la adhesión inicial de bacterias en la superficie celular. Los valores de tres campos están indicados para dar una idea de la variación del campo a campo que se espera (0044 dinas / cm 2). Video 1. Visualización de la adhesión inicial de bacterias en la monocapa celular en función del tiempo (0044 dinas / cm 2). GFP-expresando bacterias están siguiendo la dirección del medio que fluye. La película se acelera 60 veces, la duración real del video es de 10 minutos. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 2. Después de las bacterias adhesión inicial se les permitió a proliferar en la superficie celular por un período de 7 horas (acelerada 1000 veces). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Video 3. Después de la proliferación en la superficie celular de la mecánicaresistencia al de microcolonias fue probado por el aumento del nivel de estrés de corte a 10 dinas / cm 2 durante 5 minutos, pero microcolonias de tipo salvaje son resistentes acelerado de 60 veces. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> Microcolonias de vídeo 4. Formados por el mutante pilV se ven afectados por aumentar el flujo (10 dinas / cm 2). Este mutante no puede inducir a la remodelación de la membrana plasmática en microcolonias y por lo tanto más altamente sensibles al aumento del estrés de corte (video se acelera 60 veces) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
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<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
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<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La importancia del esfuerzo de corte y en general de los aspectos mecánicos en la biología es cada vez más reconocida. Por ejemplo, las propiedades altamente adaptados adhesiva de la familia de las selectinas de las proteínas en el proceso de adhesión de linfocitos y rodar sobre la pared vascular ha sido reconocida por la introducción de esfuerzo cortante en el proceso. El procedimiento descrito anteriormente se aplicó a las bacterias Gram-negativas Neisseria meningitidis, pero debe ser aplicable a una amplia gama de agentes patógenos. La importancia del esfuerzo de corte se ha demostrado también por otros agentes patógenos y otros sitios de infección. La adhesión bacteriana condicionada por el esfuerzo cortante ha sido descrito por el estudio de la adhesina FimH encuentra en uropatógena Escherichia coli (UPEC) 9. Similar a las selectinas, la interacción entre FimH y su receptor de la célula huésped se demostró que era reforzada por corte inducido por fuerzas mecánicas 9 y la adhesina de E. coli enterotoxigénica de CFAE ha informado también a la mediación de la adhesión a células epiteliales intestinales a través de un corte que dependen de mecanismo 10. Nos informó, a través del protocolo de cámara de flujo laminar ensayo descrito en este capítulo que Streptococcus agalactiae pili eran esenciales para el cumplimiento de este patógeno a las células epiteliales en condiciones de flujo 11. Estos estudios confirman que nuestro ensayo cámara de flujo es una herramienta útil para la investigación de la célula huésped-patógeno interacciones en condiciones de esfuerzo cortante.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 kit de flujo </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Plastipak jeringa de 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubos Tygon R3603 3,2 x 4,8 mm </td><td> Fisher-Científico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Llave de 3 vías, 2 luer hembra a macho luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Jeringa de la bomba </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscopio invertido, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD o ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

la introducción de la tensión de cizallamiento en el estudio de la adhesión bacteriana

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante las infecciones bacterianas de una secuencia de interacciones se producen entre el patógeno y su huésped. La adhesión bacteriana a la superficie de la célula huésped es a menudo el paso inicial y determinante de la patogénesis. Aunque experimentalmente adherencia es en su mayoría estudiaron en condiciones estáticas de adhesión en realidad se lleva a cabo en presencia de flujo de líquido. Los primeros encuentros entre la bacteria y su huésped a menudo se producen a nivel de mucosas, boca, pulmones, intestinos, ojos, etc, donde el moco fluye a lo largo de la superficie de las células epiteliales. Después de la infección, los patógenos en ocasiones acceder a la circulación de la sangre que causan enfermedades graves como sepsis septicemia y meningitis. Un rasgo característico de estas infecciones es la capacidad de estos patógenos para interactuar con las células endoteliales en presencia de la sangre circulante. La presencia de flujo de líquido, moco o sangre, por ejemplo, determina la adhesión, ya que genera una fuerza mecánica sobre el patógeno. Para caracterizar el efecto del flujo de un líquido por lo general se refiere a la noción de esfuerzo cortante, que es la fuerza tangencial ejercida por unidad de superficie por un fluido en movimiento cerca de una pared fija, expresada en dinas / cm 2. Intensidades de esfuerzo cortante varían mucho según el tipo de embarcaciones diferentes, el tamaño, el órgano, ubicación, etc (000 a 100 dinas / cm 2). La circulación en los capilares puede alcanzar valores de corte muy bajo estrés e incluso detener temporalmente durante los períodos que oscilan entre unos pocos segundos hasta varios minutos 1. En el otro extremo del espectro de la tensión de corte en las arteriolas pueden alcanzar los 100 dinas / cm 2 2. El impacto de la tensión de corte en diferentes procesos biológicos se ha demostrado claramente, como por ejemplo durante la interacción de los leucocitos con el endotelio 3. Para tener en cuenta este parámetro mecánico en el proceso de adhesión bacteriana que se aprovechó de un procedimiento experimental basado en el uso de un flujo de 4 cámaras desechables. Las células hospedadoras se cultivan en la cámara de flujo y bacterias fluorescentes se introducen en el flujo controlado por una bomba de jeringa. Inicialmente se centró nuestras investigaciones sobre la bacteria patógena Neisseria meningitidis, una bacteria Gram-negativo responsable de la septicemia y la meningitis. El procedimiento descrito aquí nos ha permitido estudiar el impacto del esfuerzo cortante en la capacidad de las bacterias a: adherirse a las células 1, que proliferan en la superficie celular y 5 para separar a colonizar nuevos sitios 6 (Figura 1). Información técnica complementaria se puede consultar la referencia 7. Los valores de esfuerzo de corte presentados aquí fueron elegidos en base a nuestra experiencia previa y una para representar los valores encontrados en la literatura. El protocolo debe ser aplicable a una amplia gama de agentes patógenos con ajustes específicos en función de los objetivos del estudio.

Durante el proceso de infección, un paso clave es la adhesión de los patógenos con las células huésped. En la mayoría de los casos este paso la adhesión se produce en presencia de la tensión mecánica generada por el flujo de líquidos. Se describe una técnica que presenta el esfuerzo cortante como un parámetro importante en el estudio de la adhesión bacteriana.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Durante las infecciones bacterianas, ocurre una secuencia de interacciones entre el patógeno y su huésped. La adhesión bacteriana a la superficie de la célula huésped es a menudo la ...

Este video demuestra un procedimiento para estudiar los efectos del esfuerzo cortante sobre la adhesión bacteriana. Durante una infección grave con un patógeno bacteriano como nice sirium mens, el patógeno llega al torrente sanguíneo, donde se une y coloniza células del huésped mientras está sometido a estrés mecánico por el flujo sanguíneo. Tras la proliferación, algunas bacterias se desprenden y colonizan nuevos sitios, y el ciclo comienza nuevamente. Para estudiar los factores que afectan la adhesión bacteriana a las células del huésped, se introducen células endoteliales en cámaras de flujo desechables y se cultivan para permitir que las células alcancen confluencia.Se añaden bacterias fluorescentes y se controla experimentalmente el estrés por cizalladura. Mediante una bomba de jeringa, se sigue microscópicamente la adhesión de las bacterias a las células hospedadoras y su proliferación. Los videos resultantes se analizan para determinar el efecto del estrés por cizalladura en el proceso de colonización del endotelio.Este procedimiento puede ser muy útil para estudiar la patogénesis de la meningitis causada por *N. meningitidis*, pero también puede utilizarse para otras bacterias que experimentan estrés por cizallamiento durante el proceso de patogénesis. Esta técnica puede resultar un poco complicada de realizar, especialmente al introducir burbujas en el sistema, lo cual puede ser un problema. Hoy, quien demostrará el procedimiento será Mega, una estudiante de doctorado que trabaja en mi laboratorio.Los experimentos descritos en este video se realizan utilizando células cultivadas en una placa microscópica IDI de seis pocillos 0.4, que consiste en una placa plástica estéril desechable que contiene seis canales de 17 milímetros de largo, 3,8 milímetros de ancho y 0,4 milímetros de profundidad. Cada canal tiene dos puertos de acceso con conectores tipo luer, uno en cada extremo, para introducir las células UVE. Pipetee 30 microlitros de una suspensión celular de 1 × 10⁶ en cada uno de los canales de la placa. Deje que las células se adhieran durante tres horas a 37 °C en un incubador humedecido con una atmósfera de 5 % CO₂.Después de la incubación, agregue 120 microlitros adicionales de SFM endo. Las células deben formar una monocapa subconfluente después de aproximadamente 20 horas para llenar los pocillos. Mientras tanto, siembre en rayas *Neisseria meningitidis* que expresa GFP en APLs; esta bacteria es un patógeno humano.Por lo tanto, cualquier manipulación de este microorganismo debe realizarse en una instalación de seguridad de nivel dos, con personal capacitado que utilice bata y guantes; se recomienda la vacunación del personal contra el grupo sérico utilizado. A continuación, la cepa 8 0 1 3 que expresa GFP se cultiva bajo el control de un promotor inducible por IPDG.Las bacterias en placas de GC BPL con suplementos de Kellogg y cinco microgramos por mililitro de cloranfenicol se incuban durante 16 horas en un incubador a 37 grados Celsius con 5 % de CO₂. Una vez establecidas las cultivos de células mamíferas, se añaden bacterias a las células huésped en el canal. Como preparación para el ensayo de flujo, utilizando un asa de inoculación, recolecte las bacterias de la placa de Petri y transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cultivo de células endoteliales suplementado y precalentado.Medio Endo SFM. Ajuste la densidad óptica a una DO 600 de 0,05 diluyendo la muestra en el mismo medio hasta un volumen final de cinco mililitros. Para inducir la expresión de GFP, agregue IPTG hasta una concentración final de un milimolar e incube el cultivo durante 120 minutos.En un incubador humidificado a 37 grados Celsius con 5% de CO₂ y agitación suave. Coloque la microplaca con células endoteliales cultivadas preparadas previamente sobre la platina de un microscopio invertido equipado con una plataforma calefactable para mantener la temperatura de la muestra a 37 grados Celsius. Vierta endo SFM precalentado suplementado con 2% de FBS en un vaso de precipitados estéril y llene la jeringa de 50 mililitros tirando del émbolo.El tubo de entrada se conecta a una llave de paso de tres vías. A continuación, fije el tubo de entrada a la jeringa y presione el émbolo para llenar el tubo con medio. Conecte cuidadosamente el otro extremo del tubo de entrada al portaobjetos microscópico utilizando los conectores en ángulo recto proporcionados.Evite introducir aire en la cámara. Coloque la jeringa en la bomba, luego coloque una jeringa de un mililitro cortada en el orificio disponible del grifo de paso como depósito. A continuación, sujete el tubo de salida al otro extremo del canal y llene cuidadosamente el canal con medio empujando el émbolo de la jeringa hasta una distancia aproximada de un centímetro de la salida de la cámara.Mida la DO a 600 nm y ajuste a 0,15 en SFM endógeno que contenga 2% de FBS, agitando vigorosamente la muestra para romper los agregados bacterianos. A continuación, utilizando una pipeta Pasteur plástica desechable, transfiera 100 microlitros de SFM endógeno suplementado con medio que contenga 2% de FBS al depósito. Luego aspire 100 microlitros de la solución bacteriana desde la parte superior de la solución en vórtice y añádalos al depósito.Gire cuidadosamente la llave de paso e inyecte las bacterias en la cámara de la microplaca para permitir que la adhesión transcurra en presencia de un nivel controlado de tensión de cizallamiento. Introduzca SFM endo que contiene 2% de FBS en la cámara utilizando la bomba de jeringa a 3,5 mililitros por hora durante 15 minutos. Este video está acelerado 60 veces.La duración real es de 10 minutos. Después de este paso, se puede evaluar la adhesión y desprendimiento de bacterias a células hospedadoras bajo diversas condiciones, tal como se describirá en las próximas secciones del video. Para cuantificar la adhesión inicial de bacterias individuales a células hospedadoras, comience a adquirir imágenes tras 15 minutos de flujo mientras el líquido aún circula; adquiera imágenes de 10 campos aleatorios para determinar el número medio de bacterias adheridas por campo observado.Comience abriendo el software ImageJ y abra la imagen que se va a analizar. Haga clic primero en el menú imagen y seleccione Ajustar brillo contraste.Optimice la visualización de bacterias fluorescentes individuales adheridas sobre el fondo ajustando los niveles de intensidad al mover el cursor. Luego, en el complemento, analice el menú contador de células. Abra la herramienta de contador de células, inicialice la imagen, elija el objeto, el tipo y haga clic en cada bacteria individual.El número total de bacterias aparece en la ventana. Finalmente, exporte los datos de cada imagen a Excel y calcule el promedio para cuantificar el número medio de bacterias adheridas por campo y medir la resistencia al flujo de bacterias adheridas individuales. Después de los 15 minutos iniciales del programa de flujo, la bomba de jeringa se configura para generar un esfuerzo cortante que varía de tres a 100 dinas por centímetro cuadrado durante cinco minutos.Al finalizar los cinco minutos, detenga el flujo y adquiera y analice 10 campos aleatorios como antes para determinar el número medio de bacterias restantes por campo. Después de los 15 minutos iniciales de flujo, ajuste la bomba de jeringa al esfuerzo cortante seleccionado. Deje que fluya durante varias horas, registrando imágenes a una velocidad de un cuadro cada cinco minutos.Idealmente, se pueden seguir varias posiciones si el microscopio está equipado con una plataforma motorizada XY. Tras la microscopía de vídeo, detenga el esfuerzo cortante apagando la bomba de jeringa. Adquiera dos o tres imágenes adicionales inmediatamente y luego detenga la secuencia de adquisición de imágenes en el software.Un ejemplo de proliferación bacteriana puede observarse aquí. Finalmente, para analizar las imágenes, utilice el menú de ajuste de umbral de ImageJ para convertir las imágenes en binarias. Luego, en el menú de análisis, bajo configuración de medida, seleccione la medición de área.Luego, utilice la herramienta de análisis de partículas para determinar automáticamente el tamaño de las colonias. Grandes microcolonias se forman en la superficie celular después de cinco a siete horas, con o sin flujo mantenido en este punto. Para medir la resistencia de las microcolonias al flujo, primero obtenga dos o tres imágenes de ambas células mediante contraste de fase y de las bacterias mediante fluorescencia GFP.Aplique un alto estrés cortante durante cinco minutos y tome imágenes de fluorescencia a razón de un cuadro cada cinco segundos. Detenga el estrés cortante apagando la bomba de jeringa. Adquiera de dos a tres imágenes adicionales y luego detenga la secuencia de adquisición de imágenes en el software antes de recoger el medio para un ensayo de siembra.Primero, retire el tubo de salida teniendo cuidado de evitar vaciar el canal. Añada medio fresco precalentado para llenar los pocillos. Luego, retire el tubo de entrada y recoja el medio restante con una pipeta micrométrica y transfiera a un tubo de microcentrífuga. Para eliminar cualquier medio residual del canal, enjuague la microplaca dos veces añadiendo 120 microlitros de PBS al canal.Inclinando la placa dos veces y descartando el medio. Para recolectar las células infectadas, agregue 50 microlitros de tripsina-EDTA a la placa microscópica e incube durante cinco minutos a 37 grados para desprenderlas del canal, y mezcle esta muestra desprendida con una suspensión recolectada en el paso anterior. Después de realizar diluciones seriadas en placas de PBS, aplique fracciones de 10 microlitros en placas de agar GCB e incube en triplicado a 37 grados Celsius con 5 % de CO₂ durante la noche.Al día siguiente, determine el número de unidades formadoras de colonias para evaluar la separación bacteriana de microcolonias. Infecte las células en la cámara de flujo como antes, con flujo bajo de 3,5 mililitros por hora; después de 30 minutos, elimine las bacterias no unidas aumentando el flujo a cinco mililitros por minuto durante un período de dos minutos, y luego regrese al flujo bajo de 3,5 mililitros por hora y permita que la infección continúe durante dos horas. A continuación, cada hora, recoja una gota del medio que sale de la cámara de flujo en un tubo de microcentrífuga durante cuatro horas.Una vez que se hayan recolectado todas las muestras, determine el número de unidades formadoras de colonias como antes. Esta es una representación gráfica de la adhesión inicial de bacterias sobre la superficie celular. Cada línea en el gráfico representa el número acumulado de bacterias unidas en un campo determinado en función del tiempo.Se indican los valores de tres campos para dar una idea de la variación entre campos que se espera tras la proliferación en la superficie celular. La resistencia mecánica de las microcolonias se probó aumentando el nivel de tensión cortante hasta 10 dinas por centímetro cuadrado; sin embargo, mientras que las microcolonias de tipo salvaje son resistentes, las microcolonias formadas por el mutante pill v se ven alteradas por el aumento del flujo. Este mutante no induce la remodelación de la membrana plasmática bajo las microcolonias y, por lo tanto, es más sensible al aumento de la tensión cortante tras su desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que otros investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran el impacto del estrés cortante sobre la interacción de diversos patógenos con diferentes tipos celulares. No olvide que trabajar con patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso y que siempre deben tomarse precauciones adecuadas, como medidas de nivel dos o tres, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Ditkowski, B., et al. Un modelo in vitro de un sistema de perfusión de placas paralelas para estudiar la adherencia bacteriana a tejidos de injerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra el método de utilizar una cámara de flujo de placas paralelas para perfundir bacterias marcadas con fluorescencia sobre tejidos de injertos vasculares, permitiendo un análisis controlado de la adhesión bacteriana y la patogénesis temprana bajo condiciones de flujo cortante.

Modelo in vitro de flujo paralelo de placas para estudiar la adhesión bacteriana en una biopsia tisular

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

adherencias de la superficie celular son fundamentales en mechanotransduction, ya que transmiten la tensión mecánica e inician las vías de señalización implicadas en la homeostasis del tejido y el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo para la disección de las vías bioquímicas que se activan en respuesta a la tensión, utilizando microperlas magnéticas recubiertas con ligando y aplicación de la fuerza a los receptores de adhesión.

El análisis de la superficie celular Adhesión Remodeling en respuesta a la tensión mecánica usando perlas magnéticas

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Aquí, describimos el uso de un biorreactor de microfluidos un mayor rendimiento juntado con un microscopio de fluorescencia para el análisis de los efectos de la tensión de esquileo de aeruginosa de los Pseudomonas biofilms expresando proteínas fluorescentes verdes, como instrumento establecido, la determinación de la cobertura de biofilm, tasa de crecimiento y características morfológicas.

Análisis de la célula de tensión de esquileo en vivo en Pseudomonas aeruginosa mediante un sistema de microfluidos superior rendimiento automatizado

Este método es útil para cuantificar la dinámica temprana de la adhesión celular y la propagación de células dependientes del anclaje en la fibronectina. Además, este ensayo se puede utilizar para investigar los efectos de la homeostasis redox alterada en la propagación celular y/ o vías de señalización intracelular relacionadas con la adhesión celular.

Examen de la dinámica de la adhesión celular y la propagación de células epiteliales en la fibronectina durante el estrés oxidativo

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Aprende a estudiar la adhesión bacteriana bajo tensión de cizallamiento usando cámaras de flujo y células endoteliales. Este método permite cuantificar la colonización de Neisseria meningitidis en condiciones fisiológicas similares a la sangre.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

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