La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

Este video muestra un procedimiento para estudiar los efectos del estrés puro en la adhesión bacteriana. Durante una infección grave por un patógeno bacteriano como el sirium mens, el patógeno llega al torrente sanguíneo allí, se adhiere y coloniza las células del huésped, mientras que bajo el estrés mecánico de la sangre que fluye después de la proliferación, algunas bacterias se desprenden y colonizan nuevos sitios y el ciclo comienza de nuevo para estudiar los factores que afectan la adhesión bacteriana a las células del huésped. Las células endoteliales se introducen en cámaras de flujo desechables y se cultivan para permitir que las células alcancen la confluencia.

Se añaden bacterias fluorescentes y se controla experimentalmente el estrés puro. Mediante una bomba de jeringa, se sigue microscópicamente la adhesión de las bacterias a las células huésped y su proliferación. Los videos resultantes se analizan para determinar el efecto del esfuerzo cortante en el proceso de colonización del endotelio.

Este procedimiento puede ser muy útil para estudiar la patogenia de la meningitis, pero también se puede utilizar para otras bacterias que están sometidas a un esfuerzo cortante durante todo el proceso de patogenia. Esta técnica puede ser un poco complicada de hacer, en particular cuando se trata de introducir burbujas en el sistema, lo que puede ser un problema. Así que hoy demostrando el procedimiento estará mega, un estudiante de doctorado trabajando en mi laboratorio.

Los experimentos descritos en este video se realizan utilizando células cultivadas en un micro portaobjetos IDI seis 0.4 que consiste en un portaobjetos de plástico estéril desechable que contiene seis canales de 17 milímetros de largo y 3.8 milímetros de ancho que tienen 0.4 milímetros de profundidad. Cada canal dispone de dos puertos de acceso con adaptadores de señuelo, uno en cada extremo para introducir las celdas uve, pipetear 30 microlitros de un uno por 10 a la suspensión de seis celdas en cada uno de los canales. En el portaobjetos, deje que las células se adhieran durante tres horas a 37 grados y una incubadora humidificada con una atmósfera de 5%CO2.

Después de la incubación, agregue 120 microlitros adicionales de endo SFM. Para llenar los pocillos, las celdas deben formar una monocapa subconfluente después de unas 20 horas. Mientras tanto, la bacteria es un patógeno humano.

Por lo tanto, cualquier manipulación de este microorganismo debe realizarse en una instalación de seguridad de nivel dos con personal capacitado que use bata y guantes, se recomienda la vacunación del personal contra el grupo serológico utilizado. Aquí está la cepa 8 0 1 3. La expresión de GFP se cultiva bajo el control de una veta promotora inducible por IPDG.

Las bacterias en los BPL de GC que contienen suplementos de Kellogg y cinco microgramos por mililitro de cloranfenicol en una incubadora de CO2 al 5% de 37 grados Celsius durante 16 horas. Una vez que se establecen los cultivos de células de mamíferos, las bacterias se agregan a las células huésped en el canal. En preparación para el ensayo de flujo, utilizando un asa de inoculación, recoja las bacterias de la placa de Petri y transfiérelas a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga un cultivo de células endoteliales precalentado y suplementado.

Endo medio SFM. Ajuste la densidad óptica a un diámetro exterior de 600 de 0,05 diluyendo la muestra en el mismo medio hasta un volumen final de cinco mililitros. Para inducir la expresión de GFP, se añade IPTG hasta una concentración final de un milimolar y se incuba el cultivo durante 120 minutos.

En una incubadora humidificada a 37 grados centígrados al 5% de CO2 con agitación suave. Coloque el microportaobjetos con células endoteliales cultivadas previamente en la platina de un microscopio invertido equipado con una plataforma calentada para mantener la temperatura de la muestra a 37 grados centígrados. Vierta endo SFM precalentado suplementado con 2%FBS en un altavoz de vidrio estéril y llene la jeringa de 50 mililitros tirando del émbolo.

El tubo de entrada está conectado a una llave de paso de tres vías. A continuación, conecte el tubo de entrada a la jeringa y presione el émbolo para llenar el tubo con medio. Conecte con cuidado el otro extremo del tubo de entrada al microportaobjetos utilizando los conectores en ángulo recto suministrados.

Evite introducir aire en la cámara. Coloque la jeringa en la bomba, luego coloque una jeringa cortada de un mililitro en la ranura disponible en la llave de paso como depósito. A continuación, fije el tubo de salida al otro extremo del canal y llene con cuidado el canal con medio empujando el émbolo de la jeringa a una distancia aproximada de un centímetro de la salida de la cámara.

Mida el OD bacteriano 600 y ajústelo a 0.15 y endo SFM que contenga 2% de FBS como antes, vórtice vigorosamente la muestra para interrumpir los agregados bacterianos. A continuación, utilizando una pipeta de plástico desechable para pastos, transfiera 100 microlitros de endos fm, suplementado con medio FBS al 2%FBS en el depósito. A continuación, aspire 100 microlitros de la solución bacteriana de la parte superior de la solución de vórtice y añádala al depósito.

Gire con cuidado la llave de paso, inyecte las bacterias en la cámara del micro portaobjetos para permitir que la adhesión proceda en presencia de un nivel de estrés de participación controlado. Introduzca endo SFM que contenga 2%FBS en la cámara utilizando la bomba de jeringa a 3,5 mililitros por hora durante 15 minutos. Este video se acelera 60 veces.

La duración real es de 10 minutos. Después de este paso, se puede evaluar la adhesión y el desprendimiento de las bacterias a las células huésped en diversas condiciones, así como describirlo en las próximas secciones del video. Para cuantificar la adhesión inicial de las bacterias individuales a las células huésped, comience a adquirir imágenes después de 15 minutos de flujo mientras el líquido aún está circulando, adquiera imágenes de 10 campos aleatorios para determinar el número promedio de bacterias adherentes por campo fotografiado.

Comience abriendo el software del día de la imagen y abra la imagen que se va a analizar. Comience haciendo clic en el menú de la imagen y seleccionando. Ajusta el brillo, el contraste.

Optimice la visualización de las bacterias fluorescentes individuales adheridas sobre el fondo ajustando los niveles de intensidad moviendo el cursor. Luego, en el complemento, analice el menú del contador de celdas. Abra la herramienta de contador de células, inicialice la imagen, elija el objeto, escriba y haga clic en cada bacteria individual.

El número total de bacterias aparece en la ventana. Por último, exporte los datos de cada imagen para sobresalir y promediar para cuantificar el número medio de bacterias adherentes por campo para medir la resistencia de las bacterias adherentes individuales al flujo. Después de los 15 minutos iniciales del programa de flujo, la bomba de jeringa se configura para generar un esfuerzo de cizallamiento que oscila entre tres y 100 centavos por centímetro cuadrado durante cinco minutos.

Al final de los cinco minutos, detenga el flujo y adquiera y analice 10 campos aleatorios como antes para determinar el número medio de bacterias restantes por campo. Después de los 15 minutos iniciales de flujo, ajuste la bomba de jeringa a la tensión de cizallamiento seleccionada. Deje que fluya durante varias horas, grabando imágenes a un ritmo de un fotograma cada cinco minutos.

Idealmente, se pueden seguir varias posiciones si el microscopio está equipado con una plataforma XY motorizada. Después de la microscopía de video, detenga el estrés absoluto apagando la bomba de jeringa. Adquiera dos o tres imágenes adicionales inmediatamente y luego detenga la secuencia de adquisición de imágenes en el software.

Aquí se puede ver un ejemplo de proliferación bacteriana. Finalmente, para analizar imágenes, use el menú de umbral de ajuste de imagen de image J para convertir las imágenes en binarias. A continuación, en el menú Analizar, en Establecer medición, seleccione la medición del área.

A continuación, utilice la herramienta analizar partículas para determinar automáticamente el tamaño de las colonias. Se forman grandes microcolonias en la superficie celular después de cinco a siete horas, ya sea que se mantenga o no el flujo en este punto. Para medir primero la resistencia de las microcolonias al flujo, adquiera dos o tres imágenes de ambas células por contraste de fase y de bacterias por fluorescencia GFP.

Aplique una tensión de cizallamiento alta durante cinco minutos y tome imágenes de fluorescencia en un fotograma cada cinco segundos. Detenga el esfuerzo cortante apagando la bomba de jeringa. Adquiera dos o tres imágenes adicionales y luego detenga la secuencia de adquisición de imágenes en el software a continuación para recolectar el medio para un ensayo de recubrimiento.

Primero, retire el tubo de salida teniendo cuidado de evitar vaciar el canal. Agregue medio fresco precaliente para llenar los pocillos. A continuación, retire el tubo de entrada y recoja el medio restante con una micropipeta y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga Para eliminar cualquier medio restante del canal, enjuague el microportaobjetos dos veces añadiendo 120 microlitros de PBS al canal.

Inclinar la corredera dos veces y desechar el medio. Para recoger las células infectadas, añadir 50 microlitros de tripsina EDTA al micro portaobjetos e incubar durante cinco minutos a 37 grados para separarlas del canal y mezclar esta muestra desprendida con una suspensión recogida en el paso anterior. Después de realizar la dilución en serie en placa de PBS, fracciones de 10 microlitros en placas agrícolas de GCB y triplicado incubado a 37 grados Celsius 5% CO2 durante la noche.

Al día siguiente determine el número de unidades formadoras de colonias para evaluar el desprendimiento bacteriano de las microcolonias. Infecte las células en la cámara de flujo como antes a un flujo bajo de 3,5 mililitros por hora después de 30 minutos, elimine las bacterias no unidas aumentando el flujo a cinco mililitros por minuto durante un período de dos minutos y luego regrese a un flujo bajo de 3,5 mililitros por hora y permita que la infección continúe durante dos horas. Luego, cada hora, recoja una gota de medio que salga de la cámara de flujo en un tubo de microcentrífuga durante cuatro horas.

Una vez que se hayan recolectado todas las muestras, determine el número de unidades formadoras de colonias como antes. Se trata de una representación gráfica de la adhesión inicial de las bacterias en la superficie celular. Cada línea del gráfico representa el número acumulado de bacterias unidas en un campo determinado en función del tiempo.

Los valores de tres campos se indican para dar una idea de la variación de campo a campo que se espera después de la proliferación en la superficie celular. La resistencia mecánica de las microcolonias se probó aumentando el nivel de esfuerzo cortante a 10 centavos por centímetro cuadrado, pero mientras que las microcolonias tipo son resistentes, las microcolonias formadas por el mutante de la píldora v se ven interrumpidas por el aumento del flujo. Este mutante no logra inducir la remodelación de la membrana plasmática bajo micro colonias y, por lo tanto, es más sensible al aumento del esfuerzo cortante después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que otros investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran el impacto del estrés cortante en la interacción de varios patógenos con diferentes tipos de células. No olvide que trabajar con patógenos humanos puede ser extremadamente peligroso y, según las precauciones, como el nivel dos o tres, siempre se deben tomar medidas al realizar este procedimiento.