RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus

El objetivo general de este procedimiento es transformar con éxito ADN foráneo y reducir la función génica en nematodos Priyanka pacificus. Para la transgénesis, comience por preparar el ADN genómico adecuado con extremos cohesivos compatibles.

Para la interferencia de ARN, sintetice el gen de interés utilizando un kit de transcripción de ARN bicatenario. Luego, inyecte microscópicamente los PRIs de DIANCA pacificus con ADN o ARN bicatenario. Seleccione la población F1 para el fenotipo del marcador elegido en la transgénesis y para el fenotipo de silenciamiento en la interferencia de ARN.

Continúe monitoreando los resultados de F2 de dos gusanos transgénicos para obtener resultados que muestren expresiones génicas específicas utilizando el reportero GFP mediante microscopía de fluorescencia. Hola, soy Ray Hong, de la Universidad Estatal de California en Northridge, y esta demostración describirá los pasos para la manipulación genética en nematodos específicos de Pristi. En organismos modelo emergentes, realizar ARNi y trusis de origen puede responder preguntas clave en biología del desarrollo y comportamiento, caracterizando las funciones y expresiones génicas.

Las personas nuevas en este método se beneficiarán de observar cómo colocar el gusano sobre la almohadilla de inyección y cómo inyectarlo en el plano focal correcto, donde son visibles los go nats. A diferencia de los gans, los goads son específicos para SCA, ya que se cruzan entre sí dorsalmente y migran eventualmente mientras el nematodo se desarrolla desde la etapa J tardía cuatro hasta adultos. Además, se debe añadir ADN genómico digerido con enzimas de restricción compatibles a sus transgenes y al marcador de coinyección para preparar la mezcla de inyección.

Jessica Single poin lab en mi laboratorio demostrará la microinyección en el caso específico de PRIs para transgénesis. Se requieren constructos de ADN 3D para la inyección del marcador dominante de coinyección. Los constructos de ADN del transgén reportero objetivo y del genoma se digieren con enzimas de restricción compatibles. Los constructos de ADN se recogen utilizando un protocolo de precipitación con etanol.Llamar.

La mezcla de inyección se prepara con las concentraciones indicadas en la tabla. Verifique la configuración del manómetro del tanque de nitrógeno. A continuación, cargue de uno a dos microlitros de la mezcla de inyección en la aguja.

Coloque la aguja en el manipulador de microinyección. Rompa la punta de la aguja tocando ligeramente un borde de un tubo capilar estirado fino colocado sobre un portaobjetos y colóquelo en una posición inactiva. Ahora vierta aceite de parafina para cubrir la placa con cuatro gusanos jóvenes adultos.

Seleccione un gusano individual y transfiéralo a una almohadilla de inyección. Bajo el microscopio, coloque el gonad del gusano en la dirección de la aguja con la vulva alejada de la aguja. Ahora baje la aguja hasta la posición del campo microscópico.

Lleve el gonad superior y la aguja al mismo plano focal. Pique suavemente el gusano e inyecte la mezcla. Observe cómo los huevos se separan hacia la punta distal, lo que indica una inyección exitosa.

Reposicione la aguja para inyectar la gónada inferior y repita la inyección. Dado que esta gónada se encuentra debajo del intestino, no se observará la dispersión de los huevos, por lo que es más difícil evaluar el éxito de la inyección. Sin embargo, tras la inyección, el gusano debe permanecer intacto sin aguijones protruyentes.

Coloque nuevamente la aguja en la posición de reposo. Añada una gota de tampón M nueve para rescatar el gusano utilizando algunas bacterias OP 50 en un asa. Toque el gusano con las OP 50 para que se adhiera.

Ahora transfiera el gusano a una placa con gotas de 50 microlitros de OP50. Almacene los gusanos inyectados a 20 grados Celsius durante aproximadamente cuatro días para que depositen huevos y crezcan hasta la generación F1. Ahora examine los gusanos en busca del fenotipo seleccionado.

Seleccione individuos F1 con el fenotipo observado y transfiéralos a una nueva placa con semillas; almacénelos a 25 grados Celsius. Finalmente, para las líneas transgénicas, transfiera individuos F2 individuales a placas separadas. Almacene las generaciones subsecuentes a 20 grados Celsius.

La manipulación de la función génica a nivel de organismo mediante ARNi y transgénesis son aspectos clave del modelo Ppac pacificus para la biología evolutiva del desarrollo; en comparación con un gusano tipo silvestre a la izquierda, la línea transgénica estable F cuatro PPR L tres produce un fenotipo dominante de enrollamiento que muestra expresión de GFP en neuronas cefálicas. Por el contrario, este experimento de ARNi genera mutantes PRL uno que exhiben una inhibición completa de la locomoción enroscada, normalmente observada en el mutante de ganancia de función PRL uno enrollador TU 92. Una vez dominada, cada inyección puede completarse en cinco minutos. Es importante recordar que todos los F dos provenientes de líneas transgénicas F uno independientes deben seleccionarse individualmente para establecer líneas F dos promisorias independientes.

Esto se debe a que encontramos que la expresión de GFP era altamente variable entre las líneas F2 y que la transmisión del fenotipo rodador no se correlaciona con el nivel de expresión de G.