Name: RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende técnicas de ARN interferencia y transgénesis por microinyección en el nematodo Pristionchus pacificus. Estos métodos permiten estudiar funciones génicas en biología del desarrollo y neurociencia.

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Los autores están muy agradecidos a RJ Sommer y Wang X para obtener ayuda con microinyección, así como de las perspicaces observaciones de los revisores anónimos. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención SC2GM089602.

1. Transgénesis: la preparación de ADN <ol><li> Dominante co-inyección marcador: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] El pRL3 plásmido es un dominante co-inyección marcador para identificar visualmente los eventos exitosos de transformación. Este plásmido codifica para un alelo mutante dominante (tu92) del gen de la PPA-prl-1 estrechamente relacionado con el SQT-1 gen del colágeno en el C. elegans y transforma la locomoción sinusoidal de tipo salvaje en las agujas del reloj movimientos de torsión a lo largo del cuerpo del gusano del eje 1,5. El animal se transforma muy similar a la del marcador de selección populares rol dominante-6 (su1006) que se utiliza en C. elegans en los últimos 20 años. </li><li> Objetivo reportero transgén: PPA-EGL-4p:: GFP Un gen de interés se pueden vincular transcripción o traslación a una secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias 9. En este estudio, la PPA-EGL-4promoter:: GFP (EGL-4, proteína quinasa dependiente de cGMP) was utilizado para determinar si un fragmento de 2 kb corriente arriba del inicio de la traducción puede conferir la expresión de GFP en P. pacificus PS312. Este vector GFP contiene una región de codificación de las buenas prácticas agrarias con la modificación intrones y el polivalente PPA-RPL-23 3 'UTR Terminator 5 amablemente proporcionados por Xiaoyue Wang y Ralf J. Sommer (Instituto Max-Planck, Tuebingen, Alemania, UE). </li><li> ADN genómico: PS312 La adición de tipo salvaje P. pacificus ADN genómico PS312 es necesario para obtener la herencia del transgén estable, sobre todo a partir de transgénicos animales F 1 a su progenie F 2 5. No se sabe con certeza si el ADN genómico de las formas complejas matrices de cromosomas extra con los dos transgenes (el marcador de la co-inyección de PRL-3 y el Pap-4p-EGL:: reportero gfp) similares a los observados en el establo de F 2 en las líneas transgénicas C. elegans 3. Sin embargo, el requisito de tener el ADN genómico y transgenes a compartir identicavoladizos l coherente sugiere la formación de complejos arreglos extra-cromosómicos de las células huésped puede reconocer en la transmisión adecuada del ADN (ADNg preparado con Sigma G1N10 kit). </li><li> Digestión del ADN Las enzimas de restricción se utilizan para alinear la PPA-EGL-4p:: GFP vector de ADN y producir voladizos pegajosa compatible con el marcador pRL3 co-inyección y ADNg PS312. Homogeneizar golpeando, no agitación. Incubar durante una hora a 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> PstI (10 U / l) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 L </td></tr><tr><td> Ppa-EGL-4p:: GFP </td><td> 4 mg </td></tr><tr><td> Buffer 10x </td> 10 l </tr><tr><td> SalI (10 U / l) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> ADNg PS312 </td><td> 10 mg </td></tr><tr><td> Buffer 10x </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> Pst I y Sal I (10 U / l) </td><td> L 8 </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Mezcla de enzimas de restricción implícita. <ol start="5"><li> ADN precipitación y la preparación <ol><li> Añadir acetato de sodio 01:10 (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) y 2,5 veces el volumen de etanol al 100% para el producto digerido, añadir 20 ng / l de glucógeno para ver pellet más fácil. </li><li> Centrifugar a14.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Se decanta el sobrenadante inclinando lentamente el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel, asegurándose de que la pastilla es segura en la parte inferior del tubo y libre de etanol. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 75%. </li><li> Inmediatamente girar a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante por lentamente inclinando el tubo de centrífuga al revés y luego golpeándolo en un pañuelo de papel asegurando que la pastilla que seguro en la parte inferior del tubo y libre de etanol. </li><li> Seco en pelets en centrífuga de vacío a 14.000 rpm durante 5 minutos a 25-30 ° C, hasta que se seque y completamente libre de etanol. </li><li> Añadir 30 l de TE o estéril dH 2 O y dejar toda la noche a 4 ° C antes de mezclar brevemente con un vórtice. </li><li> La Tabla 2 describe cómo crear la mezcla de inyección de cada ADN purificado para inyección. </li><li> Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla en elinyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para eliminar partículas de desechos que pueden obstruir la aguja de la inyección. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Material genético </td><td> Concentración </td></tr><tr><td> Ppa-EGL-4p:: GFP (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / l (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / l </td></tr><tr><td> ADNg PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 ng / l </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Mezcla de Pap-prl-1 de la inyección 2. La interferencia de ARN: In vitro la síntesis de ARN de doble cadena <ol><li> El uso de PCR para amplificar el gen de interés. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI) y 5'-RHL092 tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 '(sitio PstI) se utilizaron para amplificar un fragmento de 464 pb genómica (la posición de 3 a 466) a partir del vector pRL3 que contiene el PPA-prl-1 (tu92) alelo. </li><li> Digerir el producto de PCR con BamHI y PstI. </li><li> Ligar el fragmento BamHI / PstI digerido pL4440 RNAi alimentación vector 2. </li><li> Transformar el vector insertado en células competentes y hacerlos crecer en LB ampicilina placas de los medios de comunicación (50 mg / ml). </li><li> Seleccione el vector ha entrado con éxito por PCR utilizando los primers T7. </li><li> Utilice la T7 flanqueado producto de PCR que contiene el gen PRL-1 para hacer ARN de doble cadena dsRNA) usando el bloque-IT RNAi síntesis kit (Invitrogen). </li><li> La concentración de dsRNA es mejor si&gt; 200 ng / l, hasta 1 mg / l para la inyección. </li><li> Almacenar a -20 ° C. Después de descongelar la mezcla de la inyección, girar por el tubo a 14.000 rpm durante 5 minutos para deshacerse de las partículas de los desechos que puedan obstruir los injection de la aguja. </li></ol> 3. Microinyección: Protocolo para la inyección de los transgenes y / o dsRNA <ol><li> Agujas de inyección <ol><li> Ajuste la aguja Narishige extractor (modelo #: PC-10) la temperatura: <ol><li> Girar el botón de abajo para "Calentador N º 2". </li><li> A su vez la "Adj N º 2 del calentador." panel de mando hasta que se lee 55.0-60.0 ° C durante punta de la aguja cónica de diferentes longitudes. </li></ol></li><li> Gire el botón de abajo de nuevo a "Paso 1" (Saca la aguja en un solo paso). </li><li> Carga de agujas en la cámara y asegúrese de que esté seguro. </li><li> Pulse el botón "Inicio" (botón rojo) y permitir que la aguja se retiró con todos los pesos (esto debe hacer dos agujas iguales en direcciones opuestas). </li><li> Retire la aguja de la cámara y guardar en una placa de cultivo de plástico asegurado en su lugar de Play-Doh para evitar que el polvo se acumule en las agujas. </li></ol></li><li> Almohadillas de montaje <ol><li> En un tubo centrífugo de 1,5 ml, hacer una soluci 2% de agar Noblen mediante la adición de 0,02 g de agar Noble a 1 ml de H 2 O. El agar se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un año. </li><li> Mezclar bien y se funden en un bloque de agar de calor establecido en&gt; 88 ° C. </li><li> Usando una micropipeta de 1 ml, colocar una gota de líquido Agar Noble 2% a la media de la lámina de vidrio (Fisher, 12-544-F). </li><li> Aplanar mediante la colocación de otra placa de vidrio en la parte superior de la gota. </li><li> "Paso Drop" hasta que haya una capa de cinco diapositivas de cristal. </li><li> Retire cada lámina de vidrio con deslizar el portaobjetos de vidrio de unos a otros. </li><li> Seco aplanar pad agar en placas de vidrio en un horno de vacío a 70 ° C durante 4 horas a un día (o noche a temperatura ambiente). </li><li> Hacer pastillas de inyección múltiple y almacenar para uso futuro. </li></ol></li><li> Microinyección en las gónadas hermafroditas </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un dibujo esquemático de la P. pacificus anatnomía. Las células nucleadas claro son las células germinales femeninas (ovocitos) y la parte en gris es el intestino. Sólo una gónada anterior distal se muestra, pero el anuncio dos gónadas distal se cruzan entre sí dorsalmente cerca de medio cuerpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imágenes de la microinyección. (A) La punta de la aguja de inyección está en el foco con la línea de la extrema derecha de la pieza tira capilar. Tocando ligeramente la punta de la aguja para que el borde, la punta de la aguja se rompe al tiempo que conserva una punta aguda. (B) Las inserciones de la aguja en la parte superior justo por encima de las gónadas de la curvatura del intestino para la primera inyección. (C) La aguja se inserta en la parte inferior de gónadas justo debajo de la curvatura del intestino para la segunda inyección. <ol start="3"><li><ol><li> Asegúrese de que el contraste y ajuste de corte DIC es ideal para ver las gónadas hermafroditas. </li><li> Carga 1.0-2.0 l de mezcla de la inyección en la tiracapilar aguja. </li><li> Colocar la aguja en el manipulador de la microinyección, los indicadores de presión del tanque de nitrógeno se debe establecer en las condiciones ideales (10-20 psi para 0,5-1 seg). </li><li> Romper la punta de la aguja al tocar ligeramente el borde de un tubo fino capilar sacó coloca en un portaobjetos (figura 2A). <ol><li> Aguja de diapositivas automático: la parte más delgada de un capilar sacó coloca en un portaobjetos de cristal en una gota de aceite </li></ol></li><li> Una vez que la aguja se rompe se puede colocar en una posición de reposo, mientras que usted escoja su gusano a la plataforma (P. pacificus tiene una ventana de 5 minutos para la inyección antes de que se seca y mueren). </li><li> El uso de un plato lleno de gusanos adultos J4-young, vierta el aceite de parafina suficiente (pesado) para sólo cubrir todos los gusanos en el OP50 césped bacteriano. </li><li> Elige un gusano y lo coloca en la plataforma de inyección. </li><li> Colocar la placa de vidrio con el gusano en el microscopio, la posición gónadas del gusano en la dirección de la aguja y la vulva lejos de la necesidadle (Figura 2B, 2C). </li><li> Baje la aguja a la posición de la vista del microscopio. </li><li> Posición de la gónada parte superior y la aguja en el mismo plano focal (Figura 2B). </li><li> Poke el gusano con cuidado y de la bomba en la mezcla de la inyección; ovocitos que separa hacia el extremo distal indican una inyección de éxito (para optimizar el transgén o entrega dsRNA, usted debe ver a la inyección de una ola de expansión en la gónada, que continúa hasta que se encuentra cerca de la parte distal punta). </li><li> Vuelva a colocar la aguja para inyectar a la gónada inferior y repetir la inyección, sin embargo desde esta gónada se encuentra en el intestino la difusión de los ovocitos no se verá por lo que es más difícil de lograr (Fig. 2C). </li><li> Gusano de aspecto normal indica una inyección de éxito después de la inyección, no debe haber ningún daño gónadas (que sobresale de la vulva o se extraen dentro de la cavidad del cuerpo). </li><li> Vuelva a colocar la aguja en posición de reposo. </li><li> Se preparan para rescatar a los gusanos. </li><li> Añadir uncaída (0,5 l) de tampón de M9 en la almohadilla donde se encuentra el gusano inyecta. </li><li> El uso de algunos OP50 bacterias en su selección, toque el gusano con el OP50, y debe pegarse. Nosotros no usamos pipetear con la boca. </li><li> Colocar el gusano en el plato de cabeza de serie con 50 puntos de l OP50, 2-4 gusanos pueden ser rescatados en las placas de tal. </li></ol></li><li> Después de la inyección de almacenamiento y cribado para la transgénesis <ol><li> Tienda inyecta gusanos (P 0) a 20 ° C durante ~ 4 días para poner sus huevos y crecen F 1. </li><li> Gusanos de pantalla en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de la transgénesis, búsqueda de animales rodar expresar la PPA-prl-1 marcador dominante). </li><li> Solo pico independientes F 1 's animales con el fenotipo observado a las nuevas placas sin semillas y guárdela a 25 ° C, esta temperatura favorece la formación de líneas estables de la F 1' s. </li><li> F solo dos de las líneas independientes de F 1. Individuales F 2 2 líneas por transformar un F animal. </li><li> Tienda de las generaciones posteriores a 25 ° C. </li><li> La tasa de transmisión de los rodillos por lo general se mantiene constante después de la generación F 4, así que es necesario en este momento para determinar el nivel de expresión de los transgenes de destino (PPA-EGL-4p:: GFP) para cada línea individual. La expresión de GFP puede no correlacionarse con el grado de penetrancia del fenotipo dominante de rodillos. </li></ol></li><li> Después de la inyección de almacenamiento y detección de fenotipos RNAi <ol><li> Tienda inyecta gusanos (P 0) a 20 ° C durante ~ 4 días para descansar y crecer F 1. </li><li> Pantalla de F 1 gusanos en el cuarto día de fenotipo seleccionado (Para la detección de fenotipo RNAi desmontables, la búsqueda de fenotipos penetrantes que pueden estar asociados con la pérdida de la actividad del gen objetivo, en nuestro caso la pérdida de la PPA-prl-1 fenotipo). </li><li> En nuestra experiencia, el fenotipo caída sin rodillos se pierde en&gt; 97% de la F 2. </li></ol></li></ol> 4. Los resultados representativos: 1. Resultado de la transgénesis <table border="1"><tbody><tr><td> Sesión </td><td> Inyecta P 0 </td><td> F 1 Rodillos </td><td> F 2% transgénicos </td><td> % De transmisión promedio después de F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Línea 1) 0% (Línea 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Línea 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Línea 4) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Línea 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Un rodillo de hombres que no pasó; NA: No aplica . Tabla 3 Resultados de la PS312 inyectados con Pap-EGL-4p:: GFP (Sal I digerido), pRL3 (rodillo) (Pst I digerido), y ADNg PS312 (PstI y SalI digerido). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> La figura 3 (A) de tipo salvaje (B, C) ​​La estabilidad F 4 pRL3; Pap-EGL-4P:.: GFP línea transgénica muestra la cabeza de la neurona la expresión de GFP. 2. Resultado de la interferencia de ARN <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. ARN inyectado prl-1 mutantesmostrar caída completa de "rodar" la locomoción. (A) prl-1 rodillo de ganancia de función de mutantes tu92. (B) "derribado" prl-1 mutante muestra una postura normal de tipo salvaje y la locomoción. (C) inyectado prl-1 (inferior) también tiene más cuerpo que el prl-1 mutante (arriba). (D) El cuerpo de inyección ya prl-1 (inferior) es más largo que el PS312 de tipo salvaje (arriba). El fenotipo de cuerpo por más tiempo también se observó en el rol-5 (SQT-1) caída de RNAi C. elegans N2 (datos no mostrados). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollo </td><td> no-roll </td></tr><tr><td> A prl-1 dsRNA (200 ng / l) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B-1 prl dsRNA (1000 ng / l) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> control </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. de la ALP-prl-1 inyecciones dsRNA. (A) [dsRNA] = 200 ng / l (B) [dsRNA] = 1000 ng / l. P = 0,0019 y 0,041 por la prueba exacta de Fisher de dos colas, de 200 y 1.000 inyecciones ng / l, respectivamente.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las poblaciones de P. pacificus se encuentran en estrecha relación con varias especies de escarabajo en todo el mundo y es un modelo intermedio entre los nematodos de vida libre y nematodos parásitos. La fuerza de la P. pacificus como un organismo modelo emergente radica en la integración de sus mapas genéticos y físicos que promuevan la asignación de posición de los mutantes aislados imparcial pantallas adelante genéticos (es decir, no sólo por los genes candidatos previamente caract...

<table border="1"><tbody><tr><th> Producto: </th><th> Catálogo #: </th><th> Proveedor: </th></tr><tr><td> DMI3000 inyección microscopio </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Microinyector manipulador (transmisión directa) </td><td> Narashige BC-3 de rótula </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Extractor de agujas </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> Microinyector ™ Todo-Digital Multi-La presión del sistema </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Investigación </td></tr><tr><td> GeneElute ™ mamíferos ADN genómico Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Jet kit de clonación </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET plásmido kit Miniprep </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> ADN Clean &amp; Concentrador ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Investigación </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® kit de transcripción </td><td> K3500-01 y K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Agar Difco ™ Noble </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Scientifi </td></tr><tr><td> Microscopio cubierta de vidrio (1,5 - 0,16 a 0.19mm de espesor, tamaño: 50 x 45 mm) </td><td> 12-554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Capilares de vidrio (filamento) </td><td> 615000 </td><td> Los sistemas AM </td></tr><tr><td> Aceite de parafina (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo necromenic pristionchus pacificus</em

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

A pesar de que es cada vez más asequibles para los organismos modelo emergente para obtener genomas secuenciados completamente, más a fondo la función de genes y análisis de expresión de ARN de interferencia y la transgénesis estable siguen siendo limitados en muchas especies debido a la anatomía particular y la biología molecular celular del organismo. Por ejemplo, en las afueras de la corona Caenorhabditis grupo que incluye Caenorhabditis elegans 3, de forma estable de transmisión en las líneas transgénicas no Caenorhabditis especies no han sido reportados en este phylum engañosa (Nematoda), con la excepción de Strongyloides stercoralis 4 y 5 Pristionchus pacificus. Para facilitar la ampliación del papel de P. pacificus en el estudio del desarrollo, la evolución y el comportamiento de 6-7, se describe aquí los métodos actuales para el uso de microinyección para la fabricación de animales transgénicos y knock por RNAi. Al igual que las gónadas de los <em&gt; C. elegans y la mayoría de otros nematodos, las gónadas de P. pacificus es sincitial y capaz de incorporar el ADN y ARN en los ovocitos cuando se entrega por microinyección directa. A diferencia de C. elegans Sin embargo, la herencia del transgén estable y la expresión somática en P. pacificus requiere la adición de ADN genómico digerido con endonucleasas auto complementario a los extremos de los transgenes blanco y marcadores coinyección 5. La adición de ADN genómico de transporte es similar a la necesidad de expresión del transgen en Strongyloides stercoralis 4 y en las células germinales de C. elegans. Sin embargo, no está claro si el requisito específico de ADN de los animales genómica propia se debe a P. pacificus soma es muy eficiente en el silenciamiento no complejos multi-copia genes o conjuntos de extracromosómico en P. pacificus requieren secuencias genómicas para el montaje adecuado cinetocoro durante la mitosis. La migración ventral de la (de dos brazosdidelphic) en las gónadas hermafroditas complica aún más la capacidad de inyectar ambas gónadas en los gusanos individual 8. También demostrar el uso de microinyección para derribar un mutante dominante (rodillo, tu92) mediante la inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en las gónadas para obtener información no rodar progenie F 1. A diferencia de C. elegans, pero como la mayoría de otros nematodos, P. pacificus PS312 no es receptiva a RNAi sistémico a través de la alimentación y el remojo y por lo tanto dsRNA debe ser administrado por microinyección en las gónadas sincitial. En este estudio, esperamos que para describir el proceso de microinyección necesarias para transformar un promotor PPA-EGL-4:: reportero GFP fusión y caída de un rodillo dominante prl-1 (tu92) mutante en un protocolo informativo visual.

En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Aunque resulta cada vez más asequible que los organismos modelo emergentes obtengan genomas secuenciados por completo, es necesario realizar estudios más profundos sobre la expresión y la función génica...

El objetivo general de este procedimiento es transformar con éxito ADN foráneo y reducir la función génica en nematodos Priyanka pacificus. Para la transgénesis, comience por preparar el ADN genómico adecuado con extremos cohesivos compatibles.Para la interferencia de ARN, sintetice el gen de interés utilizando un kit de transcripción de ARN bicatenario. Luego, inyecte microscópicamente los PRIs de DIANCA pacificus con ADN o ARN bicatenario. Seleccione la población F1 para el fenotipo del marcador elegido en la transgénesis y para el fenotipo de silenciamiento en la interferencia de ARN.Continúe monitoreando los resultados de F2 de dos gusanos transgénicos para obtener resultados que muestren expresiones génicas específicas utilizando el reportero GFP mediante microscopía de fluorescencia. Hola, soy Ray Hong, de la Universidad Estatal de California en Northridge, y esta demostración describirá los pasos para la manipulación genética en nematodos específicos de Pristi. En organismos modelo emergentes, realizar ARNi y trusis de origen puede responder preguntas clave en biología del desarrollo y comportamiento, caracterizando las funciones y expresiones génicas.Las personas nuevas en este método se beneficiarán de observar cómo colocar el gusano sobre la almohadilla de inyección y cómo inyectarlo en el plano focal correcto, donde son visibles los go nats. A diferencia de los gans, los goads son específicos para SCA, ya que se cruzan entre sí dorsalmente y migran eventualmente mientras el nematodo se desarrolla desde la etapa J tardía cuatro hasta adultos. Además, se debe añadir ADN genómico digerido con enzimas de restricción compatibles a sus transgenes y al marcador de coinyección para preparar la mezcla de inyección.Jessica Single poin lab en mi laboratorio demostrará la microinyección en el caso específico de PRIs para transgénesis. Se requieren constructos de ADN 3D para la inyección del marcador dominante de coinyección. Los constructos de ADN del transgén reportero objetivo y del genoma se digieren con enzimas de restricción compatibles. Los constructos de ADN se recogen utilizando un protocolo de precipitación con etanol.Llamar.La mezcla de inyección se prepara con las concentraciones indicadas en la tabla. Verifique la configuración del manómetro del tanque de nitrógeno. A continuación, cargue de uno a dos microlitros de la mezcla de inyección en la aguja.Coloque la aguja en el manipulador de microinyección. Rompa la punta de la aguja tocando ligeramente un borde de un tubo capilar estirado fino colocado sobre un portaobjetos y colóquelo en una posición inactiva. Ahora vierta aceite de parafina para cubrir la placa con cuatro gusanos jóvenes adultos.Seleccione un gusano individual y transfiéralo a una almohadilla de inyección. Bajo el microscopio, coloque el gonad del gusano en la dirección de la aguja con la vulva alejada de la aguja. Ahora baje la aguja hasta la posición del campo microscópico.Lleve el gonad superior y la aguja al mismo plano focal. Pique suavemente el gusano e inyecte la mezcla. Observe cómo los huevos se separan hacia la punta distal, lo que indica una inyección exitosa.Reposicione la aguja para inyectar la gónada inferior y repita la inyección. Dado que esta gónada se encuentra debajo del intestino, no se observará la dispersión de los huevos, por lo que es más difícil evaluar el éxito de la inyección. Sin embargo, tras la inyección, el gusano debe permanecer intacto sin aguijones protruyentes.Coloque nuevamente la aguja en la posición de reposo. Añada una gota de tampón M nueve para rescatar el gusano utilizando algunas bacterias OP 50 en un asa. Toque el gusano con las OP 50 para que se adhiera.Ahora transfiera el gusano a una placa con gotas de 50 microlitros de OP50. Almacene los gusanos inyectados a 20 grados Celsius durante aproximadamente cuatro días para que depositen huevos y crezcan hasta la generación F1. Ahora examine los gusanos en busca del fenotipo seleccionado.Seleccione individuos F1 con el fenotipo observado y transfiéralos a una nueva placa con semillas; almacénelos a 25 grados Celsius. Finalmente, para las líneas transgénicas, transfiera individuos F2 individuales a placas separadas. Almacene las generaciones subsecuentes a 20 grados Celsius.La manipulación de la función génica a nivel de organismo mediante ARNi y transgénesis son aspectos clave del modelo Ppac pacificus para la biología evolutiva del desarrollo; en comparación con un gusano tipo silvestre a la izquierda, la línea transgénica estable F cuatro PPR L tres produce un fenotipo dominante de enrollamiento que muestra expresión de GFP en neuronas cefálicas. Por el contrario, este experimento de ARNi genera mutantes PRL uno que exhiben una inhibición completa de la locomoción enroscada, normalmente observada en el mutante de ganancia de función PRL uno enrollador TU 92. Una vez dominada, cada inyección puede completarse en cinco minutos. Es importante recordar que todos los F dos provenientes de líneas transgénicas F uno independientes deben seleccionarse individualmente para establecer líneas F dos promisorias independientes.Esto se debe a que encontramos que la expresión de GFP era altamente variable entre las líneas F2 y que la transmisión del fenotipo rodador no se correlaciona con el nivel de expresión de G.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe la microinyección, un método común para crear cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos el uso de la microinyección para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes con bases CRISPR.

Microinyección de gónadas: un método de administración de compuestos directamente en la línea germinal de C. elegans

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Aquí, presentamos un método detallado de remojo de interferencia de ARN en Bursaphelenchus xylophilus para facilitar el estudio de las funciones de los genes.

Aplicación de la interferencia de ARN en el nematodo de la madera de pino, Bursaphelenchus xylophilus

Los nematodos entomopatógenos viven en simbiosis con las bacterias y juntos infectan con éxito a los insectos al socavar su sistema inmunológico innato. Para promover la investigación sobre la base genética de la infección por nematodos, se describen métodos para mantener y manipular genéticamente los nematodos entomopatógenos.

Cultivo y manipulación genética de nematodos entomopatógenos

Este artículo demuestra la ingeniería genómica mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno (EPN: insectoparasito) y un modelo genético emergente. La tecnología descrita es útil para crear mutantes, permitiendo la elucidación de funciones génicas en la biología de los nematodos relevantes para la simbiosis mutualista y parasitaria.

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

Aprende técnicas de ARN interferencia y transgénesis por microinyección en el nematodo Pristionchus pacificus. Estos métodos permiten estudiar funciones génicas en biología del desarrollo y neurociencia.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus

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