Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

El objetivo general de este procedimiento es mapear ópticamente simultáneamente el potencial transmembrana y el transitorio de calcio intracelular en corazones de ratón perfundidos con LOR aislados intactos. Esto se logra extirpando primero el corazón de ratón intacto, luego canulando la aorta y comenzando la perfusión de LOR. El siguiente paso es inmovilizar el corazón cargando una contracción de excitación en el acoplador y luego sujetando el corazón a la cámara de perfusión.

Los pasos finales son cargar los tintes ópticos y hacer preparativos para reducir los artefactos de movimiento durante el experimento. Las imágenes ópticas se obtienen recogiendo la luz emitida desde el corazón con mis cámaras cam Ultima LC Moss. Hola, mi nombre es di.

Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente, como el microelectrodo, es que el mapeo óptico permite una mayor resolución espacial en toda la superficie del corazón. Hola, soy Matt Sulkin.

Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. Este método, si se realiza correctamente, puede ayudar a responder muchas preguntas en electrofisiología cardíaca, como la base de la arritmogénesis. Comience configurando una bomba peristáltica para que circule las soluciones a 40 mililitros por minuto.

A continuación, ajuste una segunda bomba peristáltica a 80 mililitros por minuto. Esta bomba devuelve el Perfuse eight al depósito de retención y oxigenación. Encienda las bombas y lave el sistema con un litro de etanol al 70% durante 30 minutos con recirculación.

Siga este lavado con dos litros de agua desionizada sin recirculación. Una vez evacuada el agua, se hacen circular dos litros de solución Tyro y se pasa por un filtro de cinco micras. Caliente la perfusión de ocho a 37 grados centígrados con una camisa de agua y un circulador de gas oxigenado de burbujas en la solución.

Ajuste la tasa de burbujeo de gas para mantener el pH en 7.35 más o menos 0.05. Controle tanto el pH como la temperatura durante el experimento. El aparato de mapeo óptico dual consta de dos cámaras C moss de alta velocidad que pueden capturar una imagen de 100 por 100 píxeles a 3000 cuadros por segundo.

Conecte un filtro de paso de banda a la cámara de imágenes de calcio y conecte un filtro de paso largo a la cámara de imágenes de voltaje en un soporte de cámara doble. Coloque un espejo diic y una lente para que la lente enfoque en el espejo la luz de emisión que proviene del corazón. Además, coloque dos cámaras en el soporte y colóquelas de manera que queden perpendiculares entre sí.

A continuación, configure la luz de excitación. La luz es generada por una lámpara halógena y dirigida a través de una guía de luz flexible. Pase la luz a través de un filtro de calor, un obturador para limitar la exposición y un filtro de paso de banda de excitación.

Finalmente, prepare los electrodos de plata y cloruro de plata instalándolos en la cámara. Después de verificar y ajustar los niveles en los amplificadores y filtros, la configuración está lista para un corazón. Use un cóctel de ketamina y xilacina con 100 unidades de heparina para anestesiar a un ratón antes de continuar.

Asegúrese de que el animal no tenga ningún reflejo de dolor con un pellizco en los dedos de los pies. Después de hacer una incisión en la mitad del esternón, extraiga rápidamente el corazón y los tejidos circundantes. Luego, usando un microscopio de disección rápidamente, identifique la aorta y haga un corte limpio a través de la aorta ascendente por debajo de la arteria subclavia derecha.

Ahora conecte una sección corta de aorta a una cánula de calibre 21 hecha a medida usando cuatro suturas de seda trenzada negra después de la canulación, retro perfu en gran medida y súper fusione el corazón. Con la solución Tyro, ajuste el caudal para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros. Mercurio medido por un transductor de presión.

Ahora diseccione y extraiga el pulmón, el timo y el tejido graso circundantes. Ahora inserte un tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de las venas pulmonares. Sutura el tubo al tejido conectivo cercano.

Este paso tan importante evita la congestión y la acidificación de Perfuse eight atrapado en el ventrículo izquierdo, especialmente después de la supresión de las contracciones ventriculares. Para evitar los movimientos cardíacos inducidos por Perfundse, fije el corazón en la parte inferior de la cámara de perfusión recubierta de protector de umbral en su ápice. Además, estire y sujete los apéndices auriculares derecho e izquierdo para aumentar la superficie de las aurículas en la configuración vertical.

Esto maximizará el área de superficie de grabación. Para llevar a cabo las estimulaciones de estimulación, conecte un electrodo hecho a medida a la superficie del corazón. Para reducir los artefactos de movimiento, fije una pequeña cubierta de vidrio sobre el corazón en la superficie de la solución.

Hazlo colocando el vaso entre varios alfileres. Como preparación final, enfoque la luz de excitación en el corazón y coloque las cámaras para obtener una imagen óptica, luego comience con la carga del tinte mientras carga los troqueles. Monitoree continuamente los registros de ECG para asegurar la función eléctrica normal del corazón.

Comience calentando las estatinas BLE a temperatura ambiente. A continuación, mezcle medio mililitro de estatinas BLEs en los ocho profusos del depósito de retención, y diluya el 10º mililitro restante de estatinas BLEs en un mililitro de solución Tyros. Durante los próximos 20 minutos, inyecte lentamente las estatinas BLE en tiras a través de un puerto de drogas cerca de la cánula.

La estatina BLEs reducirá gradualmente el artefacto de movimiento. A continuación, diluya 30 microlitros de tinte sensible al voltaje en una solución de tiro, mililitros e inyecte lentamente esta mezcla durante cinco a siete minutos en el mismo puerto de medicamento. Luego vuelve a hacer la misma mezcla.

Esta vez, añadiendo 30 microlitros adicionales de indicador de calcio. Aplique lentamente esta mezcla durante cinco a 10 minutos a través del mismo puerto. Después de inyectar el indicador de calcio, espere de cinco a 10 minutos adicionales para que la estatina BLEs suprima completamente el movimiento y para que los tintes ingresen a las células antes de continuar con el experimento.

Se hizo esta preparación del corazón. De acuerdo con el protocolo, las señales de ECG se registraron durante la estimulación ventricular de la estimulación S one One One. Los potenciales de acción y las señales transitorias de calcio se registraron en las aurículas de la izquierda y los ventrículos de la derecha.

La flecha muestra dónde se produjo la dispersión de la señal de los ventrículos agrupando las grabaciones de la cámara en unidades de tres píxeles por tres píxeles, se puede mostrar una matriz de transitorios de calcio y potenciales de acción a partir de los datos de la matriz. Se puede construir una figura que muestra la conducción del potencial de acción. Los datos de tres puntos consecutivos en el eje transversal y longitudinal muestran el cambio de amplitud con la propagación del potencial de acción a través de una superficie ventricular.

Del mismo modo, se puede construir una figura que muestra el potencial de acción y las duraciones transitorias del calcio. Esto muestra una condición de control a la izquierda a la derecha. Se administró una inyección de isoproterenol en el corazón, lo que claramente acorta la duración tanto de los transitorios de calcio como de los potenciales de acción.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos o tres horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el protocolo de estimulación, para responder a preguntas adicionales, como las relacionadas con el período refractario del nódulo AV.