Name: Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende el mapeo óptico de potenciales de acción y calcio en corazones de ratón aislados con perfusión Langendorff. Esta técnica de alta resolución espacial permite estudiar la electrofisiología cardíaca y los mecanismos de arritmias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH concede R01 HL085369.

1. La preparación avanzada de soluciones de reserva <ol><li> Se preparan dos soluciones estándar de solución de Tyrode (16x) de antemano en agua desionizada y almacenarlas a 4 º C: <ol class="lalpha"><li> Archivo I (119.872 g / L NaCl, 3,056 g / L de CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Lawn científica, Feria, NJ)); </li><li> Archivo II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)). </li></ol></li><li> Preparar soluciones madre de los tintes fluorescentes. Para evitar la congelación y descongelación repetida, que almacenan el 30 alícuotas de ambos colorantes a -20 ° C, lo cual es suficiente para un experimento: <ol class="lalpha"><li> Sensibles al voltaje tinte RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) solución de reserva, 1,25 mg / ml en dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO); </li><li> Indicador de calcio Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) de la solución madre, 1 mg / ml de solución de DMSO. </li></ol></li><li> Prepare la excitación-contracción blebbistatin desacoplador solución madre (Bioscience Tocris, St. Louis, MO, 2 mg / ml de solución en DMSO) con antelación y almacenar el blebbistatin disuelto a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparar las soluciones de perfusión y la configuración experimental 7 <ol start="4"><li> Recién preparar la solución de Tyrode de 2L (128.2mM NaCl, CaCl2 1,3 mm (2H 2 O), 4.7mm KCl, 1.05mM MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 11,1 mm de D-glucosa en agua desionizada, pH = 7,35 ± 0,05). Si la solución madre se está utilizando para hacer 2 litros de solución de Tyrode (suficiente para un experimento) tomar 1750 ml de agua desionizada y mezclar con 125 ml de archivo I, 125 ml de archivo II, y 4 g de glucosa. </li><li> Encienda las dos bombas de los sistemas de perfusión. Conjunto de la bomba peristáltica (Peri-Star, WPI, Sarasota, EE.UU.) que se utiliza para la perfusión retrógrada a 40 mL / min. Establecer la otra bomba peristáltica (Cole-Parmer Masterflex bomba Peristalic L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) que se utiliza para superfusión y regresar a la perfusión de nuevo al depósito de la celebración de 80 mL / min. </li><li> Lave el sistema de perfusión con el 70% de etanol durante 30 minutos y luego con agua desionizada 2L. </li><li> Una vez que toda el agua desionizada es evacuado de la cámara, hacer circular la solución de Tyrode y pasarlo por un filtro de 5 micras (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Caliente la perfusión a 37 ° C con una camisa de agua y recirculación (ThermoNESLAB EX7, Newtown, EE.UU.) y oxigenar la perfusión por burbujeo de O 2 / CO 2 (95% / 5%) de gas en la solución. Monitorear el pH de la solución con un pH-metro (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) y ajustar la velocidad de O 2 / CO 2 burbujas para mantener el pH a 7,35 ± 0,05. Continuar el seguimiento y la temperatura del pH durante el experimento. </li><li> El aparato de doble mapeo óptico se compone de dos cámaras Ultima Micam-L CMOS (SciMedia, Costa Mesa, CA) que tienen alta resolución espacial (100x100 píxeles, 230 ± 20 m por píxel) y la resolución temporal (1000-3000 frames / seg). Fijar un filtro pasa-banda (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, Nueva Jersey) frente a la cámara de imágenes de calcio designado, mientras que, un filtro de paso largo (&gt; 700 nm, Thorlabs, Newton, Nueva Jersey), debe ser colocado en delante de la cámara de tensión imágenes designado. Las cámaras están dispuestos perpendicularmente entre sí por un titular, que contiene un espejo dicroico (635 nm de corte, Omega óptico, de Brattleboro, VT). Inmediatamente debajo del soporte de la cámara dual existe un objetivo (Nikon Nikkor 55 mm 1:1,4 235.052), que se centra la emisión de luz que viene del corazón en el espejo dicroico. La distancia de trabajo es de aproximadamente 3 cm. La luz de excitación es generada por una lámpara halógena (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) y se transmite a través de un filtro de calor, velocidad y filtro pasa banda (520 ± 45 nm). Una guía de luz flexible dirige la luz de paso de banda filtrada en la preparación, y una velocidad de obturación se utiliza para asegurar que la preparación se expone a la luz hasta la adquisición de imágenes para evitar photobleaching de los tintes. </li><li> Prepare Ag / AgCl 2 electrodos de estimulación y detección de antemano y los instala en la cámara antes de poner el corazón. Asegúrese de que los amplificadores y los filtros se ajustan a los niveles apropiados. </li></ol> 3. La cosecha del corazón de ratón, canular, y establecer la perfusión Langendorff <ol start="10"><li> Anestesiar el ratón con ketamina / xilacina (ketamina, 80mg/kg de peso corporal, la xilazina, 10 mg / kg de peso corporal) y heparina (100 unidades) por inyección intraperitoneal. Asegurar un nivel adecuado de anestesia por la falta de reflejo de dolor. </li><li> Después de una incisión en la mitad del esternón, eliminar rápidamente el corazón y lavarlo en oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), a temperatura constante (37 ± 1 ° C) de Tyrode solución. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, A identificar rápidamente la aorta y hacer un corte limpio a través de la aorta ascendente por debajo de la arteria subclavia derecha. Una breve sección de la aorta se conecta a un encargo de calibre 21 con una punta de la cánula quemado. 4-0 de negro trenzado sutura de seda (Corporación de Especialidades Quirúrgicas, Reading, PA) se utiliza para fijar el corazón en la cánula. Después de la canulación, el corazón es retrógrada y perfundidos superfused con Tyrode. La velocidad de perfusión retrógrada se ajusta en el rango de 5.2 mL / min para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 mmHg (transductor de presión, World Precision Instruments Inc. (WPI), Sarasota, EE.UU.; puente Amplificador TBM4M, WPI, Sarasota, EE.UU.). </li><li> Después de que el corazón se cánula, los pulmones, el timo y el tejido graso se diseca y se retira. </li><li> El corazón aislado se fija (Herramientas Artes Ciencias) en el vértice de la parte inferior de la cámara de perfusión (recubierto Sylgard) para evitar que la corriente inducida por el movimiento. Los apéndices auriculares derecho e izquierdo también se extendía y se fija (Herramientas Artes Ciencia, Inc, Foster City, CA) a la parte inferior de la cámara, lo que proporciona un área máxima de medición óptica de las aurículas. ¡Muy importante! Un tubo de silicona que se introduce en el ventrículo izquierdo a través de las venas pulmonares y se fija con sutura de seda de tejido conectivo cerca. Esto evita la congestión y la acidificación de la solución de la perfusión atrapados en el ventrículo izquierdo, lo cual es especialmente importante después de la supresión de las contracciones ventriculares con un desacoplador de excitación-contracción (véase la Parte 4 el paso 19). </li><li> Un electrodo de encargo se coloca en la superficie del corazón para llevar a cabo la estimulación de estimulación, que se genera por el Maestro-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalén, Israel) o PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australia). </li><li> Una cubierta de cristal pequeño se fija en la superficie de la solución sobre el corazón para reducir los artefactos de movimiento de la solución de vibración. </li><li> Enfocar la luz de excitación en el corazón. Además, ajustar la distancia entre el aparato de doble cámara y el corazón para que la resolución máxima se obtendrá. </li><li> Apague todas las luces en la sala y comenzar con las grabaciones eléctricas PowerLab 26T. </li></ol> 4. La tensión de carga y tintes sensibles al calcio y desacoplador de excitación-contracción <ol start="19"><li> De calentamiento de 0,6 ml blebbistatin. Mezclar 0,5 ml de la blebbistatin con la perfusión en el depósito de retención. Diluir el resto de 0,1 ml de blebbistatin en 1 ml de solución de Tyrode y lentamente se inyecta (en un periodo de 20 minutos) a través de un puerto de drogas cerca de la cánula. Observe como blebbistatin reduce gradualmente el artefacto de movimiento. </li><li> Diluir 30 l de solución de la tensión de valores sensibles tinte RH237 en una solución de 1 ml de Tyrode e inyecte lentamente durante 5-7 minutos en el puerto de inyección misma blebbistatin. </li><li> 30 l de calcio indicador de Rhod-2 1:01 AM es mezclado con Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, solución al 20% en DMSO) y luego se diluyen en 1 ml de solución de Tyrode y poco a poco se aplica sobre 5-10 minutos a través del puerto de inyección misma . </li><li> Esperar 5-10 minutos para blebbistatin y tintes para llegar a la membrana celular y el citosol. Continuar con el protocolo cuando el movimiento se suprime por completo. </li><li> Un seguimiento continuo de ECG durante todo el procedimiento para asegurar el normal funcionamiento eléctrico del corazón. </li><li> Comenzará grabaciones fluorescentes señal con el SciMedia de software a medida (SciMedia, Costa Mesa, CA). </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Arreglo experimental para la perfusión, registros eléctricos y mapeo óptico. EM = emisiones; Lp = paso largo <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Preparación experimental y ejemplos de la señal registrada durante la estimulación ventricular. Izquierda: Las señales de ECG se obtienen de Ag / AgCl 2 electrodos de disco (Arriba) y un ejemplo de protocolo de estimulación S1S1 se muestra (abajo). Centro: ratón Langendorff preparación del corazón. A la derecha: Representante de los potenciales de acción óptica y señales de calcio transitorios de la aurícula (parte superior) y los ventrículos (parte inferior) se muestran. La flecha amarilla (Top) apunta a la dispersión de la señal fluorescente procedente de los ventrículos, que se ve en las grabaciones auricular. LV = ventrículo izquierdo; RV = ventrículo derecho, LA = aurícula izquierda, RA = aurícula derecha <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante grabaciones ópticas de V m y al gato de los ventrículos del corazón del tipo de ratón salvaje. A. La preparación experimental con una serie de puntos espaciados uniformemente marcados con puntos negro cuyas grabaciones ópticas se puede ver en (C). Ejemplo B. rastreo de V m y al gato de una ubicación central en la matriz (véase el recuadro in (C)). C. V m (azul) y CAT (rojo) de la matriz de puntos espaciados uniformemente. Las señales fueron agrupadas 3x3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Mapa de activación y conducción. A. Un ejemplo de mapa de activación de un corazón tipo de ratón salvaje con transversal (T) y longitudinal (L) direcciones indicadas por las flechas blancas. B. V señales m (Arriba) y dV / dt (abajo) que corresponden a los tres puntos de vista en A (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Potencial de acción y el análisis de calcio duración transitoria. A. duración potencial de acción en la repolarización del 80% (APD80) y la duración de calcio transitorio en la relajación del 80% (80 CAD) se muestran los mapas de un corazón en condiciones control (izquierda) y después de 30 aplicaciones isoproterenol nM (derecha). El color amarillo / verde en los ventrículos (derecha) indica isoproterenol acorta APD80 y 80 CAD. Ejemplo B. trazados de APD80 y 80 CAD de los ventrículos del ratón de tipo salvaje (Arriba) y en los atrios (abajo).

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este experimento se modificó el método de perfusión Langendorff mediante la adición de un pequeño tubo de silicona, que es especialmente importante después de la supresión de las contracciones ventriculares con un desacoplador de excitación-contracción. El tubo de silicona se utiliza para evitar la congestión de solución, la acidificación de la solución de perfusión, y el desarrollo de la isquemia en el ventrículo izquierdo. El corazón de ratón es muy sensible a la hipotermia, por lo que las variaciones de temperatura a través del corazón hará que las diferencias artificiales en la duración potencial de acción. En consecuencia, un sistema de calefacción se llevó a cabo en la cámara de perfusión para mantener una temperatura constante de 37 ° C durante la totalidad del experimento 8. Desde un modelo de Langendorff no retiene la inervación del corazón, es necesario considerar la incorporación de los neurotransmisores a la perfusión con el fin de investigar el tono fisiológico simpático y parasimpático 9. Además de perfusión retrógrada, además de superfusión del corazón ayuda a mantener adecuados los parámetros ambientales tales como el pH y la temperatura. En este método, el corazón Langendorff perfundidos fue colocado en posición horizontal. Una configuración de la perfusión Langendorff verticales también se puede utilizar 10, pero puede resultar en la mecánica cardíaca ligeramente diferente 11. Además de las cámaras CMOS, detectores de alternativas también están disponibles y se pueden aplicar a mapa V m y el gato al mismo tiempo 12. Aplicación de las cámaras CMOS de alta resolución espacio-temporal asegura la exactitud de las grabaciones, sin embargo, las señales ópticas de mapeo no son de una sola célula. Más bien, cada señal fluorescente proviene de cientos o miles de células, en función de magnificación óptica. La fluorescencia ventricular mucho más grande puede distorsionar las señales de dispersión óptica auricular, por lo tanto, una cuidadosa interpretación de las señales registradas ópticamente es necesario. Otra limitación de la preparación del ratón es la distorsión de la señal y el ruido inducido por la curvatura de la superficie debido al pequeño tamaño del corazón 13. Mediciones de velocidad de conducción puede ser alterada, no sólo de la curvatura del corazón del ratón, sino también de la polaridad del electrodo y los electrodos virtual. Para lograr la precisión de la velocidad de conducción, la anisotropía de la activación, y los mapas de la repolarización, enfoque correcto de la cámara en la superficie del corazón es esencial. En este método, en tiempo real ECG puede complementar la investigación óptica de la electrofisiología cardiaca. Sensibles al voltaje medio de contraste (RH237) y el indicador de calcio (Rhod-2AM) son utilizados en el protocolo debido a su rápida respuesta, la excitación similar, y los espectros de emisión de 3,7 distinta. Hay combinaciones alternativas de tintes que se pueden utilizar para medir la V m y otro gato que RH237 y 3 Rhod-2AM. Una novela de tintes sensibles al voltaje, PGHI, con un gran cambio de Stoke (&gt; 200 nm) fue encontrado para permitir una mejor m V y las señales de gato, porque la mayor separación de las longitudes de onda de emisión entre PGHI y 14 de Rhod-2AM. Mejoras en el futuro puede centrarse en la exploración de nuevas sondas fluorescentes, el desarrollo de detectores de imágenes nuevas y mejores programas informáticos de procesamiento de imágenes. Una resolución más alta y novedosa las técnicas de imagen óptico para el mapeo óptico 3D también son importantes las orientaciones futuras de mapeo óptico 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

El corazón de ratón es un modelo popular para estudios cardiovasculares, debido a la existencia de tecnología de bajo costo para la ingeniería genética en esta especie. Fenotipo cardiovascular fisiológica del corazón del ratón se puede hacer fácilmente utilizando imágenes de fluorescencia utilizando varias sondas de potencial de membrana (V m), los transitorios de calcio (CAT), y otros parámetros. Acoplamiento excitación-contracción se caracteriza por la dinámica de la acción del calcio intracelular y el potencial, por lo tanto, es muy importante planificar tanto m V y CAT simultáneamente desde la misma ubicación en el centro 4.1. Mapeo simultáneo óptica de Langendorff perfundidos corazones de ratón tiene el potencial para dilucidar los mecanismos subyacentes insuficiencia cardíaca, arritmias, enfermedades metabólicas y otras enfermedades del corazón. La visualización de la activación, la velocidad de conducción, la duración del potencial de acción y otros parámetros en una gran variedad de sitios no se puede lograr de la investigación a nivel celular, pero está bien resuelto por mapeo óptico 1,5,6. En este trabajo se presenta la configuración de los instrumentos y las condiciones experimentales para el mapeo simultáneo óptica de V m y el gato en el corazón de ratón con alta resolución espacio-temporal con el estado de la técnica de la tecnología CMOS de imagen. Consistente grabaciones ópticas obtenidas con este método ponen de manifiesto que la cartografía óptica simultánea de los corazones de ratón Langendorff perfundidos es factible y fiable.

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

El corazón de ratón es un modelo popular para los estudios cardiovasculares debido a la existencia de tecnología de bajo costo para la ingeniería genética en esta especie. ...

El objetivo general de este procedimiento es mapear simultáneamente el potencial transmembranal y el transitorio de calcio intracelular en corazones aislados de ratón intactos perfundidos con LOR. Esto se logra primero extrayendo el corazón intacto del ratón, luego canulando la aorta e iniciando la perfusión con LOR. El siguiente paso consiste en inmovilizar el corazón cargando un acoplador de excitación-contracción y posteriormente fijando el corazón en la cámara de perfusión.Los pasos finales consisten en cargar los colorantes ópticos y realizar preparativos para reducir los artefactos de movimiento durante el experimento. Las imágenes ópticas se obtienen recolectando la luz emitida por el corazón mediante cámaras my cam Ultima LC Moss. Oye, me llamo di.Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el microelectrodo, es que el mapeo óptico permite una mayor resolución espacial en toda la superficie del corazón. Hola, soy Matt Sulkin.Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. Este método, si se realiza correctamente, puede ayudar a responder muchas preguntas en electrofisiología cardíaca, como la base del desarrollo de arritmias. Comience por configurar una bomba peristáltica para hacer circular las soluciones a 40 mililitros por minuto.Luego, configure una segunda bomba peristáltica a 80 mililitros por minuto. Esta bomba devuelve el Perfuse ocho al depósito de almacenamiento y oxigenación. Encienda las bombas y lave el sistema con un litro de etanol al 70 % durante 30 minutos con recirculación.Después de este lavado, siga con dos litros de agua desionizada sin recirculación. Una vez que se haya evacuado el agua, circule dos litros de solución Tyro y páselos a través de un filtro de cinco micrones. Caliente el perfusado de ocho a 37 grados Celsius mediante una camisa de agua y burbujee gas oxigenado en la solución con un circulador.Ajuste la velocidad de burbujeo del gas para mantener el pH en 7,35 más o menos 0,05. Monitoree tanto el pH como la temperatura durante el experimento. El aparato de mapeo óptico dual consiste en dos cámaras C moss de alta velocidad que pueden capturar una imagen de 100 por 100 píxeles a 3000 cuadros por segundo.Coloque un filtro de paso de banda en la cámara de imagen de calcio y coloque un filtro de paso largo en la cámara de imagen de voltaje sobre un soporte dual para cámaras. Coloque un espejo dicróico y una lente de manera que la luz de emisión procedente del corazón se enfoque sobre el espejo mediante la lente. Además, fije dos cámaras al soporte y colóquelas de forma que queden perpendiculares entre sí.A continuación, configure la luz de excitación. La luz es generada por una lámpara de halógeno y dirigida a través de una guía de luz flexible. Haga pasar la luz a través de un filtro de calor, un obturador para limitar la exposición y un filtro de paso de banda de excitación.Finalmente, prepare electrodos de plata y cloruro de plata instalándolos en la cámara. Después de verificar y ajustar cuidadosamente los niveles en los amplificadores y filtros, el montaje está listo para un corazón. Utilice una mezcla de ketamina y xilacina con 100 unidades de heparina para anestesiar un ratón antes de continuar.Asegúrese de que el animal no tenga reflejo de dolor mediante una compresión del dedo del pie. Después de realizar una incisión media esternal, extraiga rápidamente el corazón y los tejidos circundantes. Luego, utilizando un microscopio de disección de forma rápida, identifique la aorta y realice un corte limpio a través de la aorta ascendente por debajo de la arteria subclavia derecha.Ahora, fije una sección corta de aorta a una cánula personalizada de calibre 21 utilizando cuatro suturas de seda negra trenzada. Después de la canulación, realice la perfusión retrograda y suprafusión del corazón. Con solución de Tyro, ajuste el caudal para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros de mercurio, según se mide mediante un transductor de presión.Ahora, diseccione y retire el tejido pulmonar, el timo y el tejido adiposo circundante. A continuación, inserte un tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de las venas pulmonares. Suture el tubo al tejido conectivo cercano.Este paso muy importante evita la congestión y la acidificación del Perfuse ocho atrapado en el ventrículo izquierdo, especialmente tras la supresión de las contracciones ventriculares. Para prevenir los movimientos cardíacos inducidos por el Perfuse ocho, sujete el corazón al fondo de la cámara de perfusión recubierta con protector de umbral mediante una aguja en su ápice. Además, estire y sujete con agujas las apéndices auriculares derecho e izquierdo para aumentar el área de superficie de las aurículas en la configuración vertical.Esto maximizará el área de superficie para la grabación. Para realizar las estimulaciones de estimulación, coloque un electrodo hecho a medida sobre la superficie del corazón. Para reducir los artefactos de movimiento, fije un pequeño cubreobjetos sobre el corazón en la superficie de la solución.Haga esto insertando el vidrio entre varios pasadores. Como preparativos finales, enfoque la luz de excitación en el corazón y coloque las cámaras para obtener una imagen óptica, luego comience a cargar el colorante mientras carga los dados. Monitoree continuamente las grabaciones de ECG para asegurar el funcionamiento eléctrico normal del corazón.Comience calentando los BLEs estatina a temperatura ambiente. Luego, mezcle medio mililitro de BLEs estatina en los ocho abundantes del depósito de almacenamiento y diluya el mililitro restante de un décimo de BLEs estatina en un mililitro de solución Tyros. Durante los próximos 20 minutos, inyecte lentamente los BLEs estatina en Tyros a través de un puerto de medicamento cerca de la cánula.El estatina BLE reducirá gradualmente el artefacto de movimiento. A continuación, diluya 30 microlitros de colorante sensible al voltaje en una solución Tyro de un mililitro e inyecte lentamente esta mezcla durante cinco a siete minutos en el mismo puerto de fármaco. Luego prepare nuevamente la misma mezcla.Esta vez, agregue un indicador de calcio adicional de 30 microlitros. Aplique lentamente esta mezcla durante cinco a 10 minutos a través del mismo puerto. Después de inyectar el indicador de calcio, espere otros cinco a 10 minutos para que la estatina BLE suprima completamente el movimiento y para que los colorantes penetren en las células antes de continuar con el experimento.Se realizó esta preparación del corazón. De acuerdo con el protocolo, se registraron señales de ECG durante el estímulo de estimulación ventricular desde S uno S uno. Se registraron potenciales de acción y señales transitorias de calcio desde las aurículas en el lado izquierdo y los ventrículos en el derecho.La flecha indica dónde ocurrió la dispersión de la señal desde los ventrículos al agrupar las grabaciones de la cámara en unidades de tres píxeles por tres píxeles; a partir de los datos de la matriz, puede mostrarse una serie de transitorios de calcio y potenciales de acción. Puede construirse una figura que muestre la conducción del potencial de acción. Los datos de tres puntos consecutivos sobre los ejes transversal y longitudinal muestran el cambio de amplitud con la propagación del potencial de acción a través de una superficie ventricular.Asimismo, puede construirse una figura que muestre las duraciones del potencial de acción y de los transitorios de calcio. Esto muestra una condición de control a la izquierda y a la derecha. Se administró una inyección de isoproterenol al corazón, lo que acorta claramente la duración tanto de los transitorios de calcio como de los potenciales de acción.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el protocolo de estimulación, para responder preguntas adicionales, como las relacionadas con el período refractario del nódulo AV.

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Este artículo describe la técnica utilizada para realizar el mapeo óptico de doble canal en monocapas de células auriculares HL-1 cultivadas. Este protocolo único permite la visualización simultánea de la actividad del calcio (Ca) y el voltaje (Vm) en la misma área para la detección y el análisis detallados de las propiedades electrofisiológicas de las monocapas de cultivo.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Aprende el mapeo óptico de potenciales de acción y calcio en corazones de ratón aislados con perfusión Langendorff. Esta técnica de alta resolución espacial permite estudiar la electrofisiología cardíaca y los mecanismos de arritmias.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

Explorar más videos