Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón
13 de septiembre de 2011
Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.
El objetivo general de este procedimiento es mapear simultáneamente el potencial transmembranal y el transitorio de calcio intracelular en corazones aislados de ratón intactos perfundidos con LOR. Esto se logra primero extrayendo el corazón intacto del ratón, luego canulando la aorta e iniciando la perfusión con LOR. El siguiente paso consiste en inmovilizar el corazón cargando un acoplador de excitación-contracción y posteriormente fijando el corazón en la cámara de perfusión.
Los pasos finales consisten en cargar los colorantes ópticos y realizar preparativos para reducir los artefactos de movimiento durante el experimento. Las imágenes ópticas se obtienen recolectando la luz emitida por el corazón mediante cámaras my cam Ultima LC Moss. Oye, me llamo di.
Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el microelectrodo, es que el mapeo óptico permite una mayor resolución espacial en toda la superficie del corazón. Hola, soy Matt Sulkin.
Soy estudiante de posgrado en la Universidad de Washington. Este método, si se realiza correctamente, puede ayudar a responder muchas preguntas en electrofisiología cardíaca, como la base del desarrollo de arritmias. Comience por configurar una bomba peristáltica para hacer circular las soluciones a 40 mililitros por minuto.
Luego, configure una segunda bomba peristáltica a 80 mililitros por minuto. Esta bomba devuelve el Perfuse ocho al depósito de almacenamiento y oxigenación. Encienda las bombas y lave el sistema con un litro de etanol al 70 % durante 30 minutos con recirculación.
Después de este lavado, siga con dos litros de agua desionizada sin recirculación. Una vez que se haya evacuado el agua, circule dos litros de solución Tyro y páselos a través de un filtro de cinco micrones. Caliente el perfusado de ocho a 37 grados Celsius mediante una camisa de agua y burbujee gas oxigenado en la solución con un circulador.
Ajuste la velocidad de burbujeo del gas para mantener el pH en 7,35 más o menos 0,05. Monitoree tanto el pH como la temperatura durante el experimento. El aparato de mapeo óptico dual consiste en dos cámaras C moss de alta velocidad que pueden capturar una imagen de 100 por 100 píxeles a 3000 cuadros por segundo.
Coloque un filtro de paso de banda en la cámara de imagen de calcio y coloque un filtro de paso largo en la cámara de imagen de voltaje sobre un soporte dual para cámaras. Coloque un espejo dicróico y una lente de manera que la luz de emisión procedente del corazón se enfoque sobre el espejo mediante la lente. Además, fije dos cámaras al soporte y colóquelas de forma que queden perpendiculares entre sí.
A continuación, configure la luz de excitación. La luz es generada por una lámpara de halógeno y dirigida a través de una guía de luz flexible. Haga pasar la luz a través de un filtro de calor, un obturador para limitar la exposición y un filtro de paso de banda de excitación.
Finalmente, prepare electrodos de plata y cloruro de plata instalándolos en la cámara. Después de verificar y ajustar cuidadosamente los niveles en los amplificadores y filtros, el montaje está listo para un corazón. Utilice una mezcla de ketamina y xilacina con 100 unidades de heparina para anestesiar un ratón antes de continuar.
Asegúrese de que el animal no tenga reflejo de dolor mediante una compresión del dedo del pie. Después de realizar una incisión media esternal, extraiga rápidamente el corazón y los tejidos circundantes. Luego, utilizando un microscopio de disección de forma rápida, identifique la aorta y realice un corte limpio a través de la aorta ascendente por debajo de la arteria subclavia derecha.
Ahora, fije una sección corta de aorta a una cánula personalizada de calibre 21 utilizando cuatro suturas de seda negra trenzada. Después de la canulación, realice la perfusión retrograda y suprafusión del corazón. Con solución de Tyro, ajuste el caudal para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros de mercurio, según se mide mediante un transductor de presión.
Ahora, diseccione y retire el tejido pulmonar, el timo y el tejido adiposo circundante. A continuación, inserte un tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de las venas pulmonares. Suture el tubo al tejido conectivo cercano.
Este paso muy importante evita la congestión y la acidificación del Perfuse ocho atrapado en el ventrículo izquierdo, especialmente tras la supresión de las contracciones ventriculares. Para prevenir los movimientos cardíacos inducidos por el Perfuse ocho, sujete el corazón al fondo de la cámara de perfusión recubierta con protector de umbral mediante una aguja en su ápice. Además, estire y sujete con agujas las apéndices auriculares derecho e izquierdo para aumentar el área de superficie de las aurículas en la configuración vertical.
Esto maximizará el área de superficie para la grabación. Para realizar las estimulaciones de estimulación, coloque un electrodo hecho a medida sobre la superficie del corazón. Para reducir los artefactos de movimiento, fije un pequeño cubreobjetos sobre el corazón en la superficie de la solución.
Haga esto insertando el vidrio entre varios pasadores. Como preparativos finales, enfoque la luz de excitación en el corazón y coloque las cámaras para obtener una imagen óptica, luego comience a cargar el colorante mientras carga los dados. Monitoree continuamente las grabaciones de ECG para asegurar el funcionamiento eléctrico normal del corazón.
Comience calentando los BLEs estatina a temperatura ambiente. Luego, mezcle medio mililitro de BLEs estatina en los ocho abundantes del depósito de almacenamiento y diluya el mililitro restante de un décimo de BLEs estatina en un mililitro de solución Tyros. Durante los próximos 20 minutos, inyecte lentamente los BLEs estatina en Tyros a través de un puerto de medicamento cerca de la cánula.
El estatina BLE reducirá gradualmente el artefacto de movimiento. A continuación, diluya 30 microlitros de colorante sensible al voltaje en una solución Tyro de un mililitro e inyecte lentamente esta mezcla durante cinco a siete minutos en el mismo puerto de fármaco. Luego prepare nuevamente la misma mezcla.
Esta vez, agregue un indicador de calcio adicional de 30 microlitros. Aplique lentamente esta mezcla durante cinco a 10 minutos a través del mismo puerto. Después de inyectar el indicador de calcio, espere otros cinco a 10 minutos para que la estatina BLE suprima completamente el movimiento y para que los colorantes penetren en las células antes de continuar con el experimento.
Se realizó esta preparación del corazón. De acuerdo con el protocolo, se registraron señales de ECG durante el estímulo de estimulación ventricular desde S uno S uno. Se registraron potenciales de acción y señales transitorias de calcio desde las aurículas en el lado izquierdo y los ventrículos en el derecho.
La flecha indica dónde ocurrió la dispersión de la señal desde los ventrículos al agrupar las grabaciones de la cámara en unidades de tres píxeles por tres píxeles; a partir de los datos de la matriz, puede mostrarse una serie de transitorios de calcio y potenciales de acción. Puede construirse una figura que muestre la conducción del potencial de acción. Los datos de tres puntos consecutivos sobre los ejes transversal y longitudinal muestran el cambio de amplitud con la propagación del potencial de acción a través de una superficie ventricular.
Asimismo, puede construirse una figura que muestre las duraciones del potencial de acción y de los transitorios de calcio. Esto muestra una condición de control a la izquierda y a la derecha. Se administró una inyección de isoproterenol al corazón, lo que acorta claramente la duración tanto de los transitorios de calcio como de los potenciales de acción.
Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el protocolo de estimulación, para responder preguntas adicionales, como las relacionadas con el período refractario del nódulo AV.
Descripción general
Este estudio presenta un procedimiento detallado para la cartografía óptica del potencial transmembranal y los transitorios de calcio intracelular en corazones de ratón aislados perfundidos mediante técnica de Langendorff. El método mejora la resolución espacial en comparación con las técnicas tradicionales, proporcionando información sobre la electrofisiología cardíaca.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electrofisiología Cardíaca
- Técnicas de Mapeo Óptico
- Modelos de Corazón de Ratón
Antecedentes
- El mapeo óptico permite la medición simultánea del potencial de membrana (Vm) y del transitorio de calcio (CaT).
- Los métodos tradicionales, como los microelectrodos, presentan limitaciones en la resolución espacial.
- Esta técnica puede ayudar a investigar la arritmogénesis.
- La perfusión Langendorff mantiene la viabilidad cardíaca para experimentos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la cartografía óptica en corazones de ratón.
- Mejorar la comprensión de la actividad eléctrica cardíaca.
- Facilitar la investigación sobre los mecanismos de las arritmias.
Métodos Utilizados
- Resección y canulación del corazón de ratón para la perfusión.
- Uso de cámaras de alta velocidad para capturar imágenes ópticas.
- Carga de colorantes ópticos para visualizar el potencial transmembranal y los transitorios de calcio.
- Monitoreo del pH y la temperatura durante el experimento.
Resultados principales
- Mapa óptico exitoso de Vm y CaT en el corazón aislado.
- Se demostraron artefactos de movimiento reducidos con la aplicación del colorante.
- Registro efectivo de potenciales de acción y señales transitorias de calcio.
- Se validó el método para estudios electrofisiológicos futuros.
Conclusiones
- La técnica de mapeo óptico proporciona una alta resolución espacial.
- Este método puede avanzar la investigación en electrofisiología cardíaca.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para explorar la arritmogénesis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El mapeo óptico del potencial transmembranal y de los transitorios de calcio en corazones de ratón proporciona datos espaciales y temporales de alta resolución, fundamentales para la desvinculación mecanicista en la validación de dianas cardiovasculares. Este enfoque permite la evaluación cuantitativa de fenotipos electrofisiológicos, reforzando la confianza predictiva en modelos preclínicos de arritmia e insuficiencia cardíaca. Al registrar simultáneamente la dinámica de Vm y CaT, el método conecta la biología del descubrimiento con el alineamiento de biomarcadores traslacionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de hipótesis terapéuticas mediante la representación de la dinámica del potencial de acción y de los transitorios de calcio en el tejido cardíaco.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la visualización simultánea de los parámetros del acoplamiento excitación-contracción.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en los blancos al vincular perturbaciones moleculares con resultados funcionales de naturaleza electrofisiológica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos mediante la adquisición estandarizada de señales ópticas.
- Resultados cuantitativos: Genera mediciones reproducibles de la duración del potencial de acción, la velocidad de conducción y la amplitud del transitorio de calcio.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en múltiples modelos de enfermedades cardíacas mediante protocolos consistentes de perfusión Langendorff y carga de colorantes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicable a estudios de insuficiencia cardíaca, arritmias y enfermedades metabólicas mediante modelos de ratón genéticamente modificados.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos mecanicistas de fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante la conservación de la arquitectura tisular y la perfusión fisiológica.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de avance al cuantificar tempranamente en la fase de descubrimiento la vulnerabilidad electrofisiológica.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de la eficacia preclínica, permitiendo la refinación iterativa de candidatos cardiovasculares basada en lecturas funcionales de respuestas electrofisiológicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo mecanicista mediante la correlación de intervenciones genéticas o farmacológicas con patrones electrofisiológicos espaciales.
- Selección: Ofrece normalización de ensayos y resultados cuantitativos esenciales para la selección fiable de compuestos en el descubrimiento de canales iónicos y moduladores.
- Análisis: Proporciona mediciones espacio-temporales del potencial de membrana (Vm) y del transitorio de calcio (CaT) que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales y genotipos.
- Investigación Traducional: Mantiene la relevancia fisiológica mediante la perfusión Langendorff, facilitando la extrapolación a respuestas de órganos intactos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable de fenotipado electrofisiológico aplicable a múltiples proyectos cardiovasculares y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la electrofisiología cardíaca.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante parámetros definidos de perfusión, carga del colorante e imagen.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar deficiencias electrofisiológicas antes de realizar inversiones significativas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basándose en perfiles cuantitativos de potenciales de acción y transitorios de calcio.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección cardíaca, perfusión Langendorff y sistemas de imagen óptica.
- Depende de cámaras CMOS de alta velocidad, fuentes de luz de excitación y conjuntos de filtros ópticos para la detección de dos canales.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de carga de colorantes y de las estrategias para reducir los artefactos por movimiento.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el método a diferentes cepas de ratón o modelos de enfermedad con fisiología cardíaca alterada.
- Incluye limitaciones prácticas como la toxicidad del colorante, el fotoblanqueo y la necesidad de una supresión meticulosa del movimiento para mantener la calidad de los datos.
