Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de Anopheles Spp.
9 de enero de 2013
Una forma rápida y asequible para extraer parásito calidad malaria y ADN del vector a partir de muestras de mosquitos se describe. Capitalizando en las propiedades quelantes de resina Chelex, el simple método permite el genotipado de parásitos de la malaria en mosquitos fases glándula del intestino medio y salivales, así como la identificación molecular de los Anopheles Entre hermanos especies por PCR.
El objetivo general de este procedimiento es extraer el ADN de la malaria, los parásitos y los mosquitos de las secciones del intestino medio y las glándulas salivales de las anomalías. Esto se logra cortando primero el mosquito exactamente en la unión entre el abdomen y el tórax, separando así la sección del intestino medio de la glándula salival. A continuación, cada sección se muele por separado en agua desionizada.
A continuación, se coloca y se lava la suspensión de tejido y se recupera la célula de pellet. Finalmente, la célula se reconstituye y se hierve, y se extrae el ADN. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran ADN de alta calidad para mosquitos y parásitos de la malaria, adecuado para su uso como plantilla para identificar anomalías, especies de vectores e infecciones genotípicas de la malaria mediante PCR y digestión de enzimas de restricción específica de alelos.
Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica tan sencilla sobre las existentes, como la extracción orgánica y los métodos de clasificación, es que utiliza muy pocos reactivos seguros y fácilmente disponibles, y también mucho menos tiempo de procesamiento. Para comenzar a diseccionar el mosquito, colóquelo en un pequeño trozo de paraforma y móntelo en un microscopio de disección. Cúbrelo con una gota de agua desionizada.
Para ablandar el tamaño del tejido, el mosquito se incrusta precisamente en la unión entre el tórax y el abdomen. De este modo, se corta la cabeza y el tórax de la sección abdominal. Transfiera cada sección de mosquito diseccionada a un autoclave limpio, tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado con el número de identificación del mosquito y la sección del cuerpo, deseche la película para y, con una toallita Kim humedecida al 70% de alcohol, limpie cuidadosamente la etapa del microscopio antes de procesarla al siguiente mosquito para extraer el ADN del mosquito, primero pipetee 20 microlitros de agua desionizada en el tubo de muestra.
Y use la punta de la pipeta para triturar la sección de mosquito sumergida hasta obtener una suspensión uniforme. Añada 100 microlitros de un autoclave, una solución de saponina XPBS al 1% al homogeneizado de la muestra y un vórtice suave para mezclar. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos.
A continuación, centrifugar a 20.000 g durante dos minutos y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros un XPBS. A continuación, repite el giro.
Añadir 75 microlitros de agua desionizada estéril y 25 microlitros de 20%peso por volumen. Suspensión de resina Cellex 100 en agua desionizada y vórtice suave para resuspender el pellet utilizando una aguja hipodérmica estéril de calibre 23 flameada en quemador bunsen. Perfora un agujero en la tapa del tubo de muestra.
Hervir la suspensión de la muestra en un bloque calefactor durante 10 minutos. Centrifugar a 20.000 g durante un minuto y transferir la solución de ADN a un vial de almacenamiento preetiquetado para su uso como plantilla en las reacciones de PCR para comprobar la calidad del ADN extraído, amplificar una región del gen de la subunidad cuatro de la nicotinamida adenina deshidrogenasa deshidrogenasa mitocondrial del artrópodo que se espera que produzca un fragmento de 400 pares de bases. A continuación, para diferenciar entre las especies de Ananais Gambia, amplifique una región que flanquea a los SNP en la región espaciadora intergénica que se espera que produzca tamaños de 390 pares de bases para Ananais Gambia Sens Stricto, y 315 pares de bases para Ananais api.
Ansis luego al genotipo p falciparum polimorfismos de resistencia a fármacos anti folato. Realice una PCR anidada para amplificar la región que flanquea los codones de aminoácidos 16, 51, 59, 108 y 164. En los parásitos, el gen de la dihidrofolato reductasa lleva a cabo la digestión específica del alelo del amplicón para detectar la resistencia a los fármacos antifolato.
Polimorfismos asociados. Comprueba las reacciones en un examen de gel al 2%AROS. Ejemplos de resultados de ensayos de PCR para la calidad del extracto de ADN de mosquito, la identificación molecular de ANALIS RABIS y el genotipado de p falciparum muestran que el método simplificado de Kelex produce resultados similares al protocolo estándar de salado, a pesar de que hay menos pasos y menos de una cuarta parte de las veces con una calidad de ADN comparable en los extractos respectivos, no es sorprendente que las tasas de positividad de la muestra con respecto a las anomalías, Las especies hermanas de Gambia, así como las tasas de infección por parásitos, no fueron estadísticamente diferentes según la prueba de chi cuadrado de McNear.
La adición de BSA a las mezclas de reacción da como resultado un aumento general de los positivos de PCR debido a la eliminación de los inhibidores de PCR tanto para el kelex simplificado como para el protocolo regular de salado. Sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo, excepto por la calidad del ADN en los extractos de kelex. La digestión de la enzima de restricción específica del alelo del amplicón de P. falciparum permite el genotipado de las infecciones de malaria del intestino medio y las glándulas salivales para los alelos de resistencia a los medicamentos una vez dominados.
Esta técnica debería poder realizarse en unos 37 minutos si se realiza correctamente.
Visión general
Este artículo describe un método rápido y asequible para extraer ADN de alta calidad de parásitos de la malaria y vectores de mosquitos. Utilizando resina Chelex, la técnica permite una genotipificación efectiva de los parásitos de la malaria y una identificación molecular de especies de Anopheles.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Genómica
Antecedentes
- La malaria es un importante problema de salud global, transmitido por mosquitos Anopheles.
- Los métodos tradicionales de extracción de ADN pueden ser lentos y requieren reactivos peligrosos.
- Existe la necesidad de técnicas más simples, seguras y eficientes para la extracción de ADN.
- Este estudio introduce un método que satisface estas necesidades utilizando resina Chelex.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método rápido y rentable para extraer ADN de parásitos de la malaria y vectores de mosquitos.
- Permitir la genotipificación de parásitos de la malaria y la identificación de especies de Anopheles.
- Comparar la eficiencia y efectividad del nuevo método con los protocolos tradicionales.
Métodos utilizados
- Disección de especímenes de mosquitos para separar secciones del intestino medio y glándulas salivales.
- Molienda del tejido en agua desionizada para crear una suspensión.
- Uso de resina Chelex para la extracción de ADN.
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la genotipificación e identificación de especies.
Principales resultados
- El método Chelex produce ADN de alta calidad adecuado para PCR.
- Los resultados son comparables a los métodos tradicionales con un tiempo de procesamiento significativamente reducido.
- Las tasas de positividad de las muestras para la identificación de especies e infecciones por parásitos fueron estadísticamente similares entre los métodos.
- La adición de BSA mejoró los resultados de PCR al reducir los inhibidores.
Conclusiones
- El método Chelex simplificado es efectivo para extraer ADN de vectores de la malaria.
- Esta técnica puede realizarse en menos de 40 minutos, haciéndola práctica para uso rutinario.
- Ofrece una alternativa más segura y eficiente a los métodos tradicionales de extracción de ADN.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vector-parasite interactions by providing DNA templates for species confirmation and infection status assessment.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent burden, supporting higher throughput in field-collected sample processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces DNA suitable for PCR-based assays targeting vector species discrimination and parasite genotyping.
- Operational Value: Uses only three reagents (deionized water, saponin, Chelex resin), enhancing assay standardization and reducing variability in resource-constrained labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from vector collection to downstream applications like drug resistance genotyping via nested PCR and restriction digestion.
- Operational Value: Eliminates need for hazardous organic solvents, improving safety and accessibility in field laboratories.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on vector species distribution and Plasmodium falciparum infection rates in field settings.
- Screening: Delivers DNA extracts with sufficient quality and yield for multiplex PCR applications, supporting assay readiness.
- Analytics: Enables quantitative assessment via PCR amplification of ND4, species-specific SNPs, and drug resistance loci, allowing comparison across sample groups.
- Translational Research: Connects entomological surveillance to parasite genotyping, supporting risk-adjusted decisions in malaria control strategies.
- Enterprise Reuse: Protocol simplicity and minimal equipment needs (microcentrifuge, heating block) allow adoption across multiple field sites and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vector species identification and parasite detection through comparable sensitivity and specificity to benchmark methods.
- Operational Value: Achieves high reproducibility with minimal reagent dependency, reducing supply chain vulnerability in remote settings.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in surveillance programs by shortening time-to-result for molecular confirmation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by delivering timely, accurate data on vector competence and parasite prevalence.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology training for tissue dissection, homogenization, and PCR setup.
- Needs access to a microcentrifuge capable of 20,000 × g and a heating block for boiling step.
- Standardization across teams benefits from consistent vortexing and pipetting techniques during homogenization and resin resuspension.
- Adaptation to other mosquito species or sample types may require validation of lysis efficiency and inhibitor removal.
- Practical limitation: The method includes a manual grinding step that may limit ultra-high-throughput automation without modification.
