El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

El objetivo general de este procedimiento es aislar el ARN total de Pseudomonas aerogen recuperado de ECMs murinos. Esto se logra primero cosechando los contenidos luminosos del secuel. A continuación, se aísla el ARN bacteriano.

Luego se realiza el tratamiento con D'S y la limpieza del ARN. Finalmente, se cuantifica el ARN y se verifica la pureza del aislado mediante análisis con bioanalizador y análisis espectrofotométrico. En última instancia, se puede obtener ARN bacteriano de calidad y cantidad suficientes para evaluaciones experimentales posteriores, como QPCR, análisis, perfilado de transcripción o experimentos de secuenciación de ARN.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la extracción con triol es que este método incorpora múltiples pasos de lisis en condiciones extremadamente rigurosas con ácido y extracciones con cloroformo para asegurar ARN de alta calidad. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lisis y extracción son difíciles de aprender porque los protocolos escritos omiten pequeños detalles críticos para el éxito. El procedimiento será demostrado por Eduardo Lopez Medina, investigador postdoctoral, y Megan Neubauer, responsable del laboratorio, ambos de mi laboratorio. Antes de comenzar la recolección, IMSA limpia un mortero de acero inoxidable en un baño de nitrógeno líquido.

Luego, tras sacrificar un ratón C3 HHEN colonizado con Pseudomonas aerogen de seis a ocho semanas de edad, coloque el animal en posición supina sobre una tabla de poliestireno y rocíe el abdomen con etanol al 95 %. A continuación, realice una incisión longitudinal media a través de la piel desde el esternón hasta el periné. Después, retire la piel y el peritoneo y exponga la cavidad abdominal.

Ahora reseccione todo el ciego utilizando fórceps. Sostenga el ciego sobre el mortero de acero inoxidable y luego corte ambos extremos del ciego con tijeras de disección. Llene la punta de una pipeta P 1000 con un mililitro de tampón de lavado secuencial ocho, y luego inserte la punta en el extremo proximal del ciego.

Lave el tampón de lavado eight del sequenciador y el contenido luminal del sequenciador hacia el mortero de acero inoxidable. Ahora triture el secuenciador. Lave el contenido eight con un mortero estéril.

Luego, vierta etanol en un recipiente con hielo seco y coloque un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros en el baño de etanol con hielo seco. Transfiera el contenido lumenal congelado y molido al tubo cónico y almacene el tubo a menos 80 grados Celsius. Esta siguiente serie de pasos son los más difíciles del procedimiento.

Dado el carácter complejo de los materiales obtenidos del ciego MI, son absolutamente necesarias extracciones repetidas en frío con filoformas para lograr una aceptable igualdad e integridad; pueden requerirse entre tres y cinco extracciones antes de que desaparezca la amplia interfase entre las fases acuosas y orgánicas. Transfiera un volumen de fenol ácido-cloroformo a un tubo centrífugo Oak Ridge de 50 mililitros. Asegure la tapa con parafina y luego caliente el tubo en un baño de agua a 65 grados Celsius.

Coloque la mitad del volumen de tampón de lisis en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros y luego hierva el tampón durante cinco minutos. Después de retirar el contenido luminal de SQL del almacenamiento a menos 80 grados Celsius, caliente brevemente el tubo frotándolo vigorosamente con las manos y a continuación añada el tampón de lisis hirviendo al tubo. Agite la mezcla para homogeneizar la solución del contenido luminal de SQL con el tampón de lisis.

Hervir el tampón de lisis y el contenido luminal de SQL durante cinco minutos. Con vortexado periódico, desprecintar el tubo centrífugo de Oak Ridge que contiene la solución de fenol-cloroformo y transferir la muestra de lisis del contenido de SQL al tubo. A continuación, volver a precintar la tapa con perfil y colocar el tubo nuevamente en el baño de agua a 65 grados Celsius durante 10 minutos, agitando el tubo cada dos minutos.

Lave la muestra a 2.500 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros tipo Oak Ridge, evitando cualquier parte de la interfase blanca. A continuación, agregue un volumen igual de fenol cloroformado ácido al nuevo tubo.

Cierre herméticamente la tapa con perfil y mezcle bien el contenido agitando el tubo en vórtex a alta velocidad. Continúe centrifugando la muestra y transfiera la fase acuosa al tubo de centrífuga. Si el volumen de la fase acuosa superior se vuelve demasiado pequeño, puede transferirse a un tubo de menor diámetro.

Continúe este proceso hasta que no haya una interfase blanca visible entre las fases acuosa y orgánica. Cuando la interfase blanca haya desaparecido, transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo de centrífuga nuevo. Luego, agregue un volumen igual de cloroformo, alcohol isoamílico al tubo, cierre la tapa y mezcle bien el contenido mediante vortex.

A continuación, tras centrifugar la muestra nuevamente, transfiera la fase acuosa a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros y agregue un volumen igual de isopropanol. Luego, incube la solución a menos 20 grados Celsius durante al menos dos horas o durante la noche. Tras incubar la muestra, centrifugue el tubo durante 45 minutos.

Después de identificar el sedimento de aspecto gelatinoso en el fondo del tubo, retire el sobrenadante. Luego lave el sedimento con un mililitro de etanol al 70 %, frío con hielo, agitando el tubo en vórtex y, a continuación, centrifugue la muestra a 10 000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Finalmente, retire el sobrenadante e invierta el tubo para dejar secar el sedimento al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Luego, resuspenda el precipitado de ARN en 200 microlitros de agua libre de ARNas. Primero, agregue 20 microlitros de tampón 10 x turbo DNAsa y dos microlitros de turbo DNAsa al tubo de microcentrífuga y mezcle suavemente la solución. A continuación, incube el tubo a 37 grados Celsius durante 20 minutos, y luego agregue 20 microlitros del reactivo de inactivación de ADN resuspendido al tubo y mezcle bien.

Ahora incube el tubo durante cinco minutos más a temperatura ambiente con mezclas ocasionales. A continuación, centrifugue el precipitado en una microcentrífuga a 10.000 ×g durante 1,5 minutos y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microfuge. Agregue un volumen de fenol ácido cloroformo frío al precipitado y luego mezcle la solución completamente mediante vortex durante un minuto.

Después de centrifugar la solución durante dos minutos a 12.500 ×g, transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo y agregue un volumen de cloroformo alcohol isoamílico. Luego, mezcle la solución mediante vortexeo tras centrifugar nuevamente la solución, en las mismas condiciones. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo microfuga.

Luego, agregue 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar y 2,5 volúmenes de etanol frío con hielo al 100 %. Vortexee el tubo para mezclar. Incube la muestra a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, tras centrifugar a 12.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, retire el sobrenadante. Finalmente, lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo. Retire el sobrenadante y seque el precipitado al aire durante 10 minutos.

Luego, resuspenda el precipitado en 100 microlitros de agua libre de ARN. El Agilent Bioanalyzer es una plataforma basada en microfluidos para la determinación del tamaño, cuantificación y control de calidad de ADN, ARN, proteínas y células, y utiliza una métrica de integridad del ARN conocida como número de integridad del ARN o RIN. El ARN extraído con este protocolo produce relaciones A260/A280 que varían de 1,7 a 2,0 y valores de RIN mayores o iguales a 7,0.

Aquí a la izquierda se muestra un ejemplo de electroferograma de ARN bacteriano obtenido con un bioanalizador Agilent, y aquí a la derecha se muestra una imagen similar a un gel de Pseudomonas arosa recuperada de contenidos de SQL murino. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa o la secuenciación de ARN para responder preguntas adicionales, como un perfilado refinado de la expresión génica.