Name: El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a aislar ARN de alta calidad de Pseudomonas aeruginosa en contenido cecal murino usando extracción con fenol-cloroformo ácido. Este método permite realizar qPCR, perfil de transcripción y secuenciación de ARN.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. Modelo murino de P. aeruginosa colonización gastrointestinal y Difusión <ol><li> Ratones C3H/HeN (6-8 semanas de edad, mujeres, Harlan) se tratan con antibióticos por vía oral a agotar la flora comensal y mono-colonizados por PA como se describió anteriormente 4. </li></ol> 2. La recolección murino contenido luminal cecal <ol><li> Sumerja un mortero de limpieza de acero inoxidable en un baño de nitrógeno líquido. </li><li> La eutanasia a los ratones por asfixia de dióxido de carbono. </li><li> Carcasa del ratón seguro en un tablero de espuma de poliestireno y ducha, con un 95% de etanol. Haga una incisión longitudinal línea media a través de la piel desde el esternón hasta el perineo. Reflejan en la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal. </li><li> Resecar el ciego entero. Mantenga el ciego con unas pinzas sobre el mortero de acero inoxidable. Cortar los dos extremos del ciego con tijeras de disección. </li><li> Inserte una punta de pipeta P1000 lleno de 1 ml de solución tampón flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA y 200 mM de NaCl) 5 en el extremo proximal del ciego. Vaciar el búfer de flushate cecal y cecal contenido luminal en el mortero de acero inoxidable. 1 ml de solución tampón flushate cecal será suficiente para el lavado de todo el contenido cecal. Cecal contenidos flushate se congela inmediatamente después de entrar en contacto con el mortero. </li><li> Triturar el contenido cecal flushate con un mortero estéril. </li><li> Suelo congelado lugar cecal contenido luminal en un tubo de polipropileno de 50 ml cónico sumergido en un hielo seco / etanol baño. </li><li> Repita los pasos 2.2 a 2.7 por cada ratón adicional. </li><li> Almacenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Bacteriana de aislamiento de ARN <ol><li> Caliente un volumen (en función del volumen final de dos contenidos luminal cecal, de aproximadamente 3 ml) de ácido fenol / cloroformo (5:1, v / v) contenida en un tubo de 50 ml centrífuga Oak Ridge con la tapa asegurada en parafina en un 65 ° C baño de agua. </li><li> Hervir 0,5 volumen de tampón de lisis (2% SDS, 16 mM EDTA y 200 mM de NaCl) 6 contenido en un tubo de polipropileno de 50 ml cónicos durante 5 minutos. </li><li> Añadir tampón de lisis de ebullición a cecal contenido luminal. Homogeneizar. Hervir durante 5 minutos con agitación periódica. </li><li> Añadir los 100 ° C el contenido cecal / muestra lisis de la 65 ° C el ácido fenol / cloroformo en el tubo de centrífuga de Oak Ridge. Sello de la tapa con parafilm. </li><li> Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos con agitación periódica (cada 2 minutos). </li><li> Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos. </li><li> Cuidado de transferencia de fase acuosa (evitando la interfaz de blanco) a un nuevo 50 ml de centrífuga Ridge, Oak. El volumen de la fase acuosa será de aproximadamente el 50% del volumen total del contenido cecal, tampón de lisis, y ácido fenol / cloroformo. Añadir un volumen igual de fenol / cloroformo. </li><li> Sello de la tapa con parafilm y mezclar bien por agitación a alta velocidad. </li><li> Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos. </li><li> Repita los pasos 3,7 a 3,9 hasta que no haya interfaz blanca visible entre las fases acuosa y orgánica. </li><li> Cuidado de transferencia de fase acuosa a un nuevo 50 ml de centrífuga Ridge, Oak. Añadir un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1, v / v). </li><li> Sello de la tapa y mezclar bien por agitación. </li><li> Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos. Eliminar la fase acuosa (el volumen será de aproximadamente el 50% del volumen total de reacción) al tubo de polipropileno de 15 ml y añadir un volumen igual de isopropanol. </li><li> Incubar a -20 º durante al menos 2 horas o durante la noche. </li><li> Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 45 minutos. Un gel de pellets se forman en la parte inferior del tubo. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de helado de etanol al 70%. Vortex. Centrifugar la muestra a 10.000 en g a 4 º durante 5 minutos. </li><li> Eliminar el sobrenadante e invierta el tubo para que el sedimento seco a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Resuspender el precipitado de ARN en 200 l de agua libre de RNasa. </li></ol> 4. DNasa tratamiento (Turbo sin ADN, Applied Biosystems) <ol><li> Añadir 20 l de tampón 10X Turbo DNasa y 2 l DNasa Turbo y mezclar suavemente. </li><li> Se incuba a 37 º durante 20 minutos. </li><li> Añadir 20 l de reactivo resuspendido inactivación DNasa y mezclar bien. </li><li> Incubar 5 minutos a temperatura ambiente, mezclando de vez en cuando. </li><li> Centrifugar a 10.000 g, a temperatura ambiente durante 1,5 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. </li><li> Añadir un volumen de frío (4 º) El ácido fenol / cloroformo y mezclar bien por agitación durante 1 minuto. </li><li> Centrifugar a 12.500 g a temperatura ambiente durante 2 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (49:1 v / v) y agitar. </li><li> Centrifugar a 12.500 g a temperatura ambiente durante 2 minutos. </li><li> Pasar la fase acuosa (aproximadamente el 50% del volumen total de reacción) a un tubo nuevo. </li><li> Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M, pH 5,5 y2.5 volúmenes de etanol helado al 100%. Vortex. </li><li> Incubar a -20 º durante al menos 2 horas o menos -80 º durante 30 minutos. </li><li> Centrifugar a 12.000 g durante 30 minutos a 4 ° </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de helado de etanol al 70% por centrifugación durante 5 minutos a 10.000 ga 4 °. </li><li> Retire el sobrenadante y secar el aire durante 10 minutos. </li><li> Resuspender el precipitado en 100 l de agua libre de RNasa. Puede necesitar para poner en baño de agua 65 ° a volver a suspender y disolver el precipitado. </li><li> Para probar la eficacia del tratamiento con DNasa, una norma de reacción de RT-PCR para la amplificación de una proteína ribosomal (o el gen de referencia) se puede realizar en las muestras tratadas y no tratadas, sin utilizar los controles de RT. </li></ol> 5. ARN Paso de limpieza (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Consulte las páginas 56-57 de Qiagen RNeasy Mini Manual (4 ª edición, abril de 2006). Siga las indicaciones. </li></ol> 6. Resultados representante La cantidad de bacterias ARN total recuperado mediante el uso de este protocolo es de aproximadamente 3.2 mg de dos cecums. El ARN se recupera de la cantidad y calidad suficientes para qPCR posteriores, perfiles de transcripción, y los experimentos de ARN Seq. La pureza del RNA se evalúan regularmente midiendo la relación 260nm/280nm 7 de la muestra, sin embargo, este método no proporciona ninguna información acerca de la integridad del ARN. El Bioanalyzer Agilent es una plataforma de microfluidos basada en el tamaño, la cuantificación y control de calidad de DNA, RNA, proteínas y células, y utiliza una métrica de la integridad del ARN conocidos como ARN Número de Integridad (RIN) 8. ARN extraído con este protocolo produce 260/280 ratios que van desde 1,7 hasta 2,0 y los valores de RIN ≥ 7,0. Un ejemplo de un análisis de Agilent Bioanalyzer del ARN bacteriano recuperado por este protocolo se muestra en la Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Agilent Bioanalyzer electroferograma y gel-como la imagen de la muestra Pseudomonas aeruginosa aisladas de ARN total y se recuperó de murino contenido cecal. RIN 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de extracción de ARN se describe aquí permite la recuperación de cantidades suficientes de alta calidad del ARN total de Pseudomonas aeruginosa cosecha de la murino tracto gastrointestinal. Este método no se limita a P. aeruginosa y, potencialmente, se puede aplicar a otras bacterias. La recuperación de los organismos microbianos suficiente en el intestino pueden variar significativamente de un organismo a otro. En nuestro modelo murino, P. aeruginosa suelen coloniza el tracto GI murino a niveles entre 5 x 10 7 5 x 10 8 UFC / g de heces 4. Dado que el contenido cecal recuperado son más o menos 0.5 gramos, el número estimado de P. aeruginosa se ​​recuperó de dos cecums es de 5 x 10 7 5 x 10 8 UFC. Si los microorganismos se utilizan otros, sería prudente para verificar los niveles de colonización gastrointestinal y luego calcular el número de cecums necesario para recuperar el número previsto de UFC. También es importante tener en cuenta que al utilizar este modelo murino particular, los ratones tratados con antibióticos no infectados por el PA no tienen cantidades cuantificables de ARN aislado de su contenido cecal. Nuestro modelo murino de la colonización por Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal y los intentos de difusión de emular a la patogénesis de la P. aeruginosa bacteriemia en pacientes con cáncer y trasplantes de células madre. En esta población de pacientes, la flora comensal es a menudo se agotan secundaria al tratamiento con antibióticos o quimioterápicos (por ejemplo, el agotamiento de los antibióticos de la flora comensal GI), resultando en un crecimiento excesivo de microbios patógenos (por ejemplo, mono-asociación con P. aeruginosa) y su posterior difusión después de la supresión inmune. Las ventajas y limitaciones de este modelo murino ya han sido tratados con anterioridad 4. El propósito de este estudio es proporcionar una metodología para el aislamiento de ARN total microbiana del tracto gastrointestinal. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otros modelos murinos que el estudio de otros aspectos de la patogénesis microbiana en el tracto gastrointestinal (es decir, las interacciones comensales flora, los efectos de bacterias en la enfermedad inflamatoria intestinal, etc.) Una de las ventajas de este método es la incorporación de medidas múltiples, incluyendo la lisis de congelación / descongelación, la rotura mecánica (pulverización con mortero / mortero homogeneización), hervir, y la lisis químicos (por ejemplo SDS). A pesar de la multitud de pasos de lisis, algunos microorganismos (principalmente bacterias Gram-positivas y hongos / levaduras) pueden requerir la interrupción mecánica adicional. Después de la lisis caliente / ácido fenol-cloroformo incubación (Paso 3.5), la adición de cuentas (0,1 mm para las bacterias y / o 0.5-0.7 mm de levadura) y una fase posterior de cuentas el maltrato debe ser suficiente para lisar las nueve organismos, 10. Dada la compleja naturaleza de los materiales recuperados de la murino ciego, las extracciones repetidas frío acid-phenol/chloroform (Paso 3,7 a 3,9) son absolutamente necesarios para lograr una calidad aceptable del ARN y la integridad de las reacciones más abajo. Entre 3.5 frío extracciones acid-phenol/chloroform puede ser requerida antes de la interfaz en blanco entre las fases acuosa y orgánica se elimina. Por último, la combinación de ambos el tratamiento DNasa (paso 4) y el Protocolo de limpieza RNeasy (Paso 5) son esenciales para la eliminación de la contaminación de ADN y los pequeños no ARNm (5 años y tRNA). Como se mencionó anteriormente, el ARN se recuperó mediante la utilización de este protocolo es de cantidad y calidad suficientes para la creación de perfiles de transcripción posterior 3, qPCR (inédito), y el ARN experimentos Seq (no publicados).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Mortero y la maja </td><td> Pescador </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogeneizador </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge tubos de centrifugación (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Ácido fenol / cloroformo </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> El alcohol isoamílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNasa </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M Acetato de Sodio </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% de etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

el aislamiento de arn pseudomonas aeruginosa que colonizan el tracto gastrointestinal murino

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA), las infecciones como resultado una significativa morbilidad y mortalidad en los hosts con sistemas inmunes comprometidos, como los pacientes con leucemia, quemaduras graves, o un trasplante de órganos. En pacientes con alto riesgo de desarrollar infecciones PA torrente sanguíneo, el tracto gastrointestinal (GI) es el principal reservorio para la colonización de 2, pero los mecanismos por los que las transiciones de la AP desde un microbio colonización asintomática a una invasión, y con frecuencia mortal, el agente patógeno no son claras. Previamente, se realizó en experimentos in vivo mediante la recuperación de la transcripción de perfiles de ARNm PA de las células bacterianas que residían en la cecums de ratones colonizados 3 con el fin de identificar los cambios en la expresión génica bacteriana durante alteraciones en el estado inmunitario del huésped. Al igual que con cualquier experimento de perfiles de transcripción, el paso limitante de la velocidad es en el aislamiento de la suficiente cantidad de ARNm de alta calidad. Dada la abundancia de enzimas, escombros, residuos de alimentos, y las partículas en el tracto gastrointestinal, el desafío de aislamiento de ARN es de enormes proporciones. A continuación, presentamos un método para el aislamiento fiable y reproducible de ARN bacteriano recuperado de la murino tracto gastrointestinal. Este método utiliza un modelo murino bien establecida de la PA colonización gastrointestinal y la neutropenia inducida por la difusión 4. Una vez que la colonización gastrointestinal con PA se confirma, los ratones son sacrificados y el contenido cecal se recuperan y congelados flash. ARN se extrae a continuación con una combinación de la alteración mecánica, de ebullición, con fenol / cloroformo extracciones, tratamiento de DNasa, y cromatografía de afinidad. La cantidad y la pureza son confirmados por espectrofotometría (Tecnologías de la Nanodrop) y Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Este método de aislamiento de microorganismos GI ARN se pueden adaptar fácilmente a otras bacterias y hongos.

Un método fiable para el aislamiento de ARN de<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Recuperado de cecums murino se describe. El ARN se recupera de la cantidad y calidad suficientes para qPCR posteriores, perfiles de transcripción, y los experimentos de ARN Seq. Esta técnica se puede adaptar para el aislamiento de ARN de otros microbios intestinales.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Las infecciones por Pseudomonas aeruginosa (PA) provocan una morbilidad y mortalidad significativas en huéspedes con sistemas inmunitarios comprometidos, como pacientes con...

El objetivo general de este procedimiento es aislar el ARN total de Pseudomonas aerogen recuperado de ECMs murinos. Esto se logra primero cosechando los contenidos luminosos del secuel. A continuación, se aísla el ARN bacteriano.Luego se realiza el tratamiento con D'S y la limpieza del ARN. Finalmente, se cuantifica el ARN y se verifica la pureza del aislado mediante análisis con bioanalizador y análisis espectrofotométrico. En última instancia, se puede obtener ARN bacteriano de calidad y cantidad suficientes para evaluaciones experimentales posteriores, como QPCR, análisis, perfilado de transcripción o experimentos de secuenciación de ARN.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la extracción con triol es que este método incorpora múltiples pasos de lisis en condiciones extremadamente rigurosas con ácido y extracciones con cloroformo para asegurar ARN de alta calidad. Una demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de lisis y extracción son difíciles de aprender porque los protocolos escritos omiten pequeños detalles críticos para el éxito. El procedimiento será demostrado por Eduardo Lopez Medina, investigador postdoctoral, y Megan Neubauer, responsable del laboratorio, ambos de mi laboratorio. Antes de comenzar la recolección, IMSA limpia un mortero de acero inoxidable en un baño de nitrógeno líquido.Luego, tras sacrificar un ratón C3 HHEN colonizado con Pseudomonas aerogen de seis a ocho semanas de edad, coloque el animal en posición supina sobre una tabla de poliestireno y rocíe el abdomen con etanol al 95 %. A continuación, realice una incisión longitudinal media a través de la piel desde el esternón hasta el periné. Después, retire la piel y el peritoneo y exponga la cavidad abdominal.Ahora reseccione todo el ciego utilizando fórceps. Sostenga el ciego sobre el mortero de acero inoxidable y luego corte ambos extremos del ciego con tijeras de disección. Llene la punta de una pipeta P 1000 con un mililitro de tampón de lavado secuencial ocho, y luego inserte la punta en el extremo proximal del ciego.Lave el tampón de lavado eight del sequenciador y el contenido luminal del sequenciador hacia el mortero de acero inoxidable. Ahora triture el secuenciador. Lave el contenido eight con un mortero estéril.Luego, vierta etanol en un recipiente con hielo seco y coloque un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros en el baño de etanol con hielo seco. Transfiera el contenido lumenal congelado y molido al tubo cónico y almacene el tubo a menos 80 grados Celsius. Esta siguiente serie de pasos son los más difíciles del procedimiento.Dado el carácter complejo de los materiales obtenidos del ciego MI, son absolutamente necesarias extracciones repetidas en frío con filoformas para lograr una aceptable igualdad e integridad; pueden requerirse entre tres y cinco extracciones antes de que desaparezca la amplia interfase entre las fases acuosas y orgánicas. Transfiera un volumen de fenol ácido-cloroformo a un tubo centrífugo Oak Ridge de 50 mililitros. Asegure la tapa con parafina y luego caliente el tubo en un baño de agua a 65 grados Celsius.Coloque la mitad del volumen de tampón de lisis en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros y luego hierva el tampón durante cinco minutos. Después de retirar el contenido luminal de SQL del almacenamiento a menos 80 grados Celsius, caliente brevemente el tubo frotándolo vigorosamente con las manos y a continuación añada el tampón de lisis hirviendo al tubo. Agite la mezcla para homogeneizar la solución del contenido luminal de SQL con el tampón de lisis.Hervir el tampón de lisis y el contenido luminal de SQL durante cinco minutos. Con vortexado periódico, desprecintar el tubo centrífugo de Oak Ridge que contiene la solución de fenol-cloroformo y transferir la muestra de lisis del contenido de SQL al tubo. A continuación, volver a precintar la tapa con perfil y colocar el tubo nuevamente en el baño de agua a 65 grados Celsius durante 10 minutos, agitando el tubo cada dos minutos.Lave la muestra a 2.500 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius. Ahora transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros tipo Oak Ridge, evitando cualquier parte de la interfase blanca. A continuación, agregue un volumen igual de fenol cloroformado ácido al nuevo tubo.Cierre herméticamente la tapa con perfil y mezcle bien el contenido agitando el tubo en vórtex a alta velocidad. Continúe centrifugando la muestra y transfiera la fase acuosa al tubo de centrífuga. Si el volumen de la fase acuosa superior se vuelve demasiado pequeño, puede transferirse a un tubo de menor diámetro.Continúe este proceso hasta que no haya una interfase blanca visible entre las fases acuosa y orgánica. Cuando la interfase blanca haya desaparecido, transfiera cuidadosamente la fase acuosa a un tubo de centrífuga nuevo. Luego, agregue un volumen igual de cloroformo, alcohol isoamílico al tubo, cierre la tapa y mezcle bien el contenido mediante vortex.A continuación, tras centrifugar la muestra nuevamente, transfiera la fase acuosa a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros y agregue un volumen igual de isopropanol. Luego, incube la solución a menos 20 grados Celsius durante al menos dos horas o durante la noche. Tras incubar la muestra, centrifugue el tubo durante 45 minutos.Después de identificar el sedimento de aspecto gelatinoso en el fondo del tubo, retire el sobrenadante. Luego lave el sedimento con un mililitro de etanol al 70 %, frío con hielo, agitando el tubo en vórtex y, a continuación, centrifugue la muestra a 10 000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Finalmente, retire el sobrenadante e invierta el tubo para dejar secar el sedimento al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos.Luego, resuspenda el precipitado de ARN en 200 microlitros de agua libre de ARNas. Primero, agregue 20 microlitros de tampón 10 x turbo DNAsa y dos microlitros de turbo DNAsa al tubo de microcentrífuga y mezcle suavemente la solución. A continuación, incube el tubo a 37 grados Celsius durante 20 minutos, y luego agregue 20 microlitros del reactivo de inactivación de ADN resuspendido al tubo y mezcle bien.Ahora incube el tubo durante cinco minutos más a temperatura ambiente con mezclas ocasionales. A continuación, centrifugue el precipitado en una microcentrífuga a 10.000 ×g durante 1,5 minutos y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microfuge. Agregue un volumen de fenol ácido cloroformo frío al precipitado y luego mezcle la solución completamente mediante vortex durante un minuto.Después de centrifugar la solución durante dos minutos a 12.500 ×g, transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo y agregue un volumen de cloroformo alcohol isoamílico. Luego, mezcle la solución mediante vortexeo tras centrifugar nuevamente la solución, en las mismas condiciones. Transfiera la fase acuosa a un nuevo tubo microfuga.Luego, agregue 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar y 2,5 volúmenes de etanol frío con hielo al 100 %. Vortexee el tubo para mezclar. Incube la muestra a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, tras centrifugar a 12.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, retire el sobrenadante. Finalmente, lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % frío con hielo. Retire el sobrenadante y seque el precipitado al aire durante 10 minutos.Luego, resuspenda el precipitado en 100 microlitros de agua libre de ARN. El Agilent Bioanalyzer es una plataforma basada en microfluidos para la determinación del tamaño, cuantificación y control de calidad de ADN, ARN, proteínas y células, y utiliza una métrica de integridad del ARN conocida como número de integridad del ARN o RIN. El ARN extraído con este protocolo produce relaciones A260/A280 que varían de 1,7 a 2,0 y valores de RIN mayores o iguales a 7,0.Aquí a la izquierda se muestra un ejemplo de electroferograma de ARN bacteriano obtenido con un bioanalizador Agilent, y aquí a la derecha se muestra una imagen similar a un gel de Pseudomonas arosa recuperada de contenidos de SQL murino. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa o la secuenciación de ARN para responder preguntas adicionales, como un perfilado refinado de la expresión génica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Morrill, S. R., et al. Modelos de colonización vaginal murina por bacterias cultivadas anaeróbicamente. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra un protocolo para modelar la colonización vaginal en ratones utilizando bacterias anaeróbicas resistentes a los antibióticos. Comienza con un tratamiento hormonal para aumentar la susceptibilidad epitelial, seguido de la inoculación vaginal y la co-inoculación en condiciones anaeróbicas. El procedimiento concluye con un muestreo y cultivo...

Modelado de la colonización vaginal murina por bacterias anaeróbicas

Fuente: Taylor, M. N., et.al. Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones entre Caenorhabditis elegans y bacterias. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra la exposición de gusanos Caenorhabditis elegans libres de gérmenes y de la misma edad a una cepa bacteriana para la colonización intestinal. Explica la eliminación selectiva de bacterias externas y no adheridas, dejando solo bacterias viables adheridas al epitelio intestinal para su cuantificación.

Evaluación de la colonización bacteriana intestinal en C. elegans libre de gérmenes

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

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La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

Aquí, se describe un procedimiento para el establecimiento de la infección sistémica en la rata neonatal con cultivos de Escherichia coli K1. Este procedimiento no invasivo permite la colonización del tracto gastrointestinal, la translocación del patógeno a la circulación sistémica, y la invasión del sistema nervioso central en el plexo coroideo.

Modelo no invasiva de neuropatogénico Escherichia coli La infección en Neonatología Rata

Se presenta un protocolo detallado de un modelo de ratón para enterohemorrágica e. coli (EHEC) colonización utilizando bacterias etiquetado bioluminiscencia. La detección de estas bacterias bioluminiscentes por un no-invasivo en vivo sistema de animales vivos de imagen puede avanzar nuestra comprensión actual de la colonización de EHEC.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Este protocolo describe un método sencillo de aislar a las células epiteliales individuales, vejiga infectada de un modelo murino de infección del tracto urinario.

Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular

Aquí, describimos un protocolo simple y reproducible del modelo de ratón de infección para evaluar la atenuación de las cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa en comparación con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobada por escherichia coli para aplicaciones comerciales.

Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Este protocolo describe los pasos necesarios para la colonización de ratones con pks+ Escherichia coli en condiciones no inflamatorias, así como métodos no invasivos para la validación de la colonización y evaluación de la expansión de pks+ E. coli en heces.

Colonización con pks+ Escherichia coli de Murina en condiciones no inflamatorias

Aprenda a aislar ARN de alta calidad de Pseudomonas aeruginosa en contenido cecal murino usando extracción con fenol-cloroformo ácido. Este método permite realizar qPCR, perfil de transcripción y secuenciación de ARN.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

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