Name: Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Aprende a visualizar el rastreo intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de neutrófilos en tejido de músculo cremáster de ratón mediante microscopía intravital de campo claro.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, MOP-86749). L. Liu es un recipiente del Premio de CIHR Nueva Investigador (MSH-95374).

1. Preparación de quimioatrayente en gel de agarosa <ol><li> Pipeta de 10 ml de 2 × PBS en un tubo cónico de 50 ml, y calentar el tubo por ponerlo en un recipiente que contiene agua caliente. </li><li> Pipeta de 10 ml de agua destilada y añadir 0,4 g de polvo de agarosa en otro tubo cónico de 50 ml (con la tapa ligeramente floja) y calentar la mezcla hasta que esté hirviendo en un horno de microondas (para ~ 1 min en un horno microondas de 700 vatios) . </li><li> Agregue el calentado de 2 × PBS a la solución de agarosa al tubo, agitar la solución mixta y mantenerlo caliente en el vaso de agua caliente. </li><li> Micropipeta solución quimiotáctica (por ejemplo, 10 l de 0,5 mg de quimiocinas CXC MIP-2 y 12 l de WKYMVm 1 mM) en la tapa de un tubo de 1,5 ml Eppendorf que contiene 3 l tinta china y mezclar bien mediante aspiración con una micropipeta (evitar burbuja de aire). </li><li> Cortar el extremo de la punta de una punta de pipeta de 200 l 110 l y micropipeta de agarosa solución (42 ° C) en la tapa e inmediatamente mezclar bien con otro punta de la pipeta (evite burbujas de aire). </li><li> Guarde el gel quimioatrayente que contienen a + 4 ° C. </li></ol> 2. Preparación de músculo Cremaster de microscopía intravital (Figura 1) <ol><li> Anestesiar a un ratón macho adulto con una inyección ip de una mezcla de 10 mg / kg de xilazina y 200 mg / kg de clorhidrato de ketamina. </li><li> Afeitar el área de más de vena yugular externa derecha y la cara anterior del escroto con una maquinilla de afeitar eléctrica. Después de la anestesia, es importante prestar especial atención y cuidado para el ratón anestesiado. Una lámpara de calor se puede utilizar para evitar que el ratón de la hipotermia. El ratón debe estar libre de dolor reflejo. </li><li> Se practica una incisión horizontal, encontrar y cateterizar la vena yugular con una tubería de PE-10 lleno de solución salina con heparina 100 U / mL. La cateterización de la vena yugular que se necesita para la administración de anestésicos y medicamentos adicionales cuando sea necesario. </li><li> Fijar las patas traseras del ratón con una cinta umbilical con el ratón boca arriba sobre una placa de fabricación casera músculo cremáster (Figura 1). </li><li> Conecte la tarjeta a un 37 ° C de recirculación de agua para mantener el músculo cremáster y el cuerpo del ratón caliente. </li></ol> Nota: Todos los procedimientos de 2,6 a 2,14 se debe realizar con mucho cuidado 5. <ol start="6"><li> Hacer una incisión en la piel del escroto para exponer el músculo cremáster izquierda. Diseccionar cuidadosamente el músculo de la fascia asociada. </li><li> Superfuse el músculo cremáster con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, en mM, pH 7,4) usando una bomba peristáltica. </li><li> Atar una sutura 4-0 al extremo distal del músculo cremáster que se mantenga en el pedestal de visualización de cristal transparente de la junta directiva del músculo cremáster. </li><li> Cauterizar el músculo cremáster longitudinalmente. Con sutura 4-0, mantenga el plano muscular y seguro que a lo largo de los bordes en el pedestal. Separar el testículo y el epidídimo del músculo subyacente y los trasladan a la cavidad abdominal. </li><li> Superfuse el músculo en 22 ~ 0,6 ml / min con el tampón de 37 ° C-perfusión caliente y cubrir el músculo expuesto con un 22 × cubreobjetos mm. </li><li> Coloque la tarjeta de músculo cremáster en la platina del microscopio, examina el músculo bajo el microscopio, encontrar una vénula adecuado postcapilares (Seleccione la vénula que es recto y no ramificado y tiene una tasa de corte normal y un diámetro de 25-40 micras) y ajustar la cámara de vídeo para permitir la vénula para ser visualizados en una posición vertical en los extremos izquierdo o derecho de la pantalla del televisor. </li><li> Después de equilibrio de 30 min, grabar las imágenes de vídeo de la vénula seleccionado postcapilares durante 5 minutos como datos de referencia utilizando una grabadora de video. </li><li> Detener la superfusión y quitar el cubreobjetos sobre el músculo. </li><li> Un lugar ~ 1-3 mm de tamaño quimioatrayente que contienen gel en la superficie del músculo cremáster en un área preseleccionada 350 micras y paralelo a la vénula postcapilares observado, añadir cubreobjetos para mantener el gel en su lugar y superfuse el tejido muscular en un momento muy ritmo lento (≤ 10 l / min) para permitir el establecimiento de un gradiente de quimioatrayente que se libera lentamente y formado a partir del gel. </li><li> Grabar la imagen de vídeo de 90 minutos después de la adición del gel que contiene chemoattractant. Durante la grabación, ajustar y mantener el enfoque en el microscopio de la adhesión, gatear, transmigración y chemotaxing leucocitos en el interior de la vénula y en el tejido muscular. </li><li> Después del experimento, importar el archivo de vídeo a un ordenador para su análisis. </li></ol> 3. Celular seguimiento mediante ImageJ <ol><li> En un equipo, extraer y convertir el vídeo a formato AVI (por ejemplo, el uso de software libre bitRipper equipo para convertir el vídeo de DVD a formato AVI). </li><li> Utilice el software de edición de vídeo para generar la película el tiempo transcurrido. Por ejemplo, utilizar Windows Movie Maker para hacer una película de tiempo transcurrido (a 1 / 512 o 1 / 1024 de lapso de tiempo unt 30 fps velocidad) de la original, vídeo en tiempo real. Convertir y guardar el tiempo transcurrido sin comprimir películas a formato DV-AVI. </li><li> Grabar las imágenes del micrómetro de calibración en el ajuste mismo microscopio, importar imágenes a la computadora, abrir las imágenes con ImageJ. En ImageJ, el total de píxeles aparecen en la parte superior izquierda de la pantalla (por ejemplo, 720 × 480 píxeles). Medir el tamaño de la pantalla en ambos ejes X e Y (por ejemplo, 200 x 150 mm). De esto, calcular el número de píxeles por micras (por ejemplo, x = 720/200 = 3,6 píxeles / m, y = 480/150 = 3,2 píxeles / mm). </li><li> Para importar la película, abre ImageJ nuevo, haga clic en "Archivo-Importar-Uso de películas de QuickTime Plug-in", seleccionar la película a analizar y haga clic en "OK" en la interfaz de "Abridor de la película de QT". </li><li> Haga clic en "Plugins-Manual de seguimiento" para rastrear las células. Llene la información relevante en los campos de la base antes de comenzar el seguimiento. En pocas palabras, <ol><li> Intervalo de tiempo (en segundos) = fold-time-lapse/30 (Por ejemplo, un 1020 × lapso de tiempo sería 1020/30 = 34 seg / marco de intervalo). </li><li> x / y calibración de la medición = m / pixel con la calibración de la imagen del micrómetro. </li><li> z de calibración = 0 (ya que el músculo cremáster de ratón es una capa muy delgada de arrastre de tejidos y células y la migración son aproximadamente 2D en campo brillante transiluminación). </li><li> Buscar tamaño cuadrados para centrar = 1. </li><li> Tamaño de punto / Ancho de línea / Tamaño de fuente: se puede ajustar si es necesario. </li></ol></li><li> Seleccione un punto estable y claro como punto de referencia. Este punto de referencia puede ser cualquier punto estructural claro y pequeño que se mantiene sin cambios y estables a lo largo de todo el experimento. Haga clic en "Añadir pista" para realizar el seguimiento del punto de referencia desde el primero hasta el último fotograma y haga clic en "Track End". Los datos aparecen en la tabla de resultados de forma automática. </li><li> Seguimiento de rastreo y la migración de neutrófilos, uno por uno: haga clic en "Añadir pista" para hacer un seguimiento de la célula desde su aparición en el tejido a su desaparición en cada fotograma y haga clic en "Track End" para finalizar y guardar los resultados en Microsoft Excel. </li></ol> 4. Análisis de los parámetros de reclutamiento de neutrófilos <ol><li> Abra el archivo de resultados en Microsoft Excel, y analizar los datos (toma los cambios de punto de referencia en el análisis). </li><li> Gatear intraluminal <ol><li> Rastreo distancia: la distancia total de la célula se arrastra en el lumen del sitio adherentes iniciales a la transmigración sitio óptimo (m). </li><li> Rastreo de velocidad: el rastreo a distancia / tiempo (m / min). </li></ol></li><li> Migración transendotelial <ol><li> Tiempo de la transmigración: desde el momento en la célula comienza a transmigrar a través del endotelio a la época en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula y no del cuerpo celular puede ser observado en la luz (minutos o segundos). </li><li> Tiempo de separación: desde el momento en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula (inmediatamente después de la transmigración) hasta el punto de tiempo cuando la célula pierde el contacto con la vénula (se retrae la cola) (min o seg). </li></ol></li><li> Quimiotaxis en el tejido <ol><li> La distancia de migración: la suma de la distancia de la celda se mueve desde el punto de inicio hasta el punto final de la migración en el tejido (m). </li><li> La velocidad de la migración: la migración en el tejido de distancia / tiempo (m / min). </li><li> Distancia de la quimiotaxis: la suma de la distancia de la célula migra en el eje x en el tejido (m). </li><li> La velocidad de la quimiotaxis: quimiotaxis de distancia / tiempo (m / min). </li><li> Quimiotaxis índice: el coeficiente de dividir la distancia de la quimiotaxis de la distancia de migración en el tejido. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Aunque bightfield microscopía intravital se utiliza para el estudio de las interacciones leucocito-endotelial y pueden no ser necesariamente de los neutrófilos, que confirmó que, por nuestros estudios de histología, más del 95% de las células reclutadas en los neutrófilos tratados quimioatrayente los músculos cremáster eran de hecho los neutrófilos . En este informe, el uso selectivo de neutrófilos quimiotácticos, se presentan los procedimientos de seguimiento del reclutamiento de neutrófilos en vivo. En concreto, se describe un protocolo de seguimiento de rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial, y la quimiotaxis en el tejido músculo cremáster en ratones anestesiados utilizando time-lapse video microscopía intravital y ImageJ. El gel de agarosa que contienen chemoattractant en el músculo cremáster libera lentamente quimioatrayente y permite un gradiente quimiotáctico que se establezca en el tejido. Quimiotáctica de neutrófilos induce neutrófilos interacciones célula endotelial en cremastérico vénulas post-capilares en ratones. El experimento se visualiza con un microscopio de campo claro en posición vertical intravital con imágenes de video proyectadas por una cámara de vídeo en color de un monitor de televisión y grabado por una grabadora de vídeo. Se determinó el recuento de neutrófilosgatear intraluminal, la migración y la migración transendotelial y la quimiotaxis en el tejido muscular en respuesta a los neutrófilos chemoattractant MIP-2 y WKYMVm preparados en gel de agarosa (Figura 2). Se encontró que el MIP-2 (a 0,5 M) y WKYMVm (a 0,1 mM) provocó el rastreo intraluminal de neutrófilos a una velocidad similar, la migración de neutrófilos transendotelial y el desprendimiento de la vénula para la longitud de tiempo comparable de la migración de neutrófilos y quimiotaxis en el tejido muscular a casi la misma velocidad y con similares índices de quimiotaxis de neutrófilos (P&gt; 0,05, prueba t de Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. La representación esquemática de un sistema de microscopía intravital. El músculo cremáster de ratón se exterioriza en el pedestal de una visión clara de la junta del músculo cremáster en platina del microscopio y superfused con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada. El microscopio vertical se conecta con una cámara de vídeo CCD color de campo claro microscopía intravital. Un blanco y negro profundo enfriado cámara CCD digital también está conectado al puerto de microscopio de fluorescencia microscopia intravital, las imágenes de las cuales están directamente procesados ​​por un ordenador. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Neutrófilos parámetros de contratación de la microscopía de campo claro intravital. El reclutamiento de neutrófilos fue inducida por la liberación gradual de quimioatrayente de neutrófilos MIP-2 o WKYMVm en la preparación de un gel de agarosa 350 micras colocado junto a la vénula postcapilares. El tiempo transcurrido de datos de vídeo fueron analizados por ImageJ después de procesar la grabación de vídeo en tiempo real del experimento. Rastreo de neutrófilos intraluminal (A), el tiempo de la transmigración y el tiempo de separación (B), la velocidad de la migración y la velocidad de la quimiotaxis de los tejidos (C), y el índice de quimiotaxis en el músculo cremáster (D) se determinaron después de la administración de MIP-2 o WKYMVm en gel de agarosa en cremáster muscular en ratones C57BL / 6 (n = 3, N º de células seguimiento = 22 (en A y B) y 27 (en C y D), respectivamente, para MIP-2, y 26 = (en A y B) y 44 ( en C y D), respectivamente, para WKYMVm).

<ol><li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment%3A+organ-specific+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li>
<li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+leukocyte+recruitment%3A+an+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li>
<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
<li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de 1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas únicas y lo...

Tabla: Materiales, reactivos y equipos específicos <table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Tubo de polietileno, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0.28mm x 0.61mm OD </td></tr><tr><td> Tinta china </td><td> Speedball Arte </td><td> Super Negro </td><td> 100% de pigmento negro de humo no colorantes </td></tr><tr><td> Cauterización </td><td> Aaron Médico </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> El clorhidrato de ketamina </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> MIP-2 recombinante murino </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapura </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> Color 3CCD cámara de vídeo </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD grabador de vídeo </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de TV </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Agua circulante </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Gilson, Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster bordo del músculo </td><td> Universidad de Saskatchewan </td><td></td><td> Hecho en casa </td></tr></table>

seguimiento de rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

El reclutamiento de leucocitos circulantes del torrente sanguíneo al tejido inflamado es un proceso crucial y compleja de 1,2 inflamación. En las vénulas postcapilares de tejido inflamado, leucocitos inicialmente cuerda y rodar sobre la superficie luminal de la pared venular. Rolling arresto leucocitos en el endotelio y se someten a la adhesión firme en respuesta a quimioquinas o quimiotácticos otros en la superficie venular. Muchos leucocitos adherentes trasladarse desde el sitio inicial de la adhesión al lugar de la extravasación de la unión en el endotelio, un proceso denominado intraluminal arrastrándose 3. Después de gatear, los leucocitos se mueven a través del endotelio (transmigración) y migran en el tejido extravascular hacia la fuente de quimioatrayente (quimiotaxis) 4. Microscopia intravital es una poderosa herramienta para la visualización de las interacciones leucocito-endotelial de células in vivo y revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos 2,5. En este informe, se presenta una descripción completa de la utilización de la microscopía intravital campo claro para visualizar y determinar los procesos detallados de reclutamiento de neutrófilos en el ratón músculo cremáster en respuesta a la pendiente de un quimioatrayente de neutrófilos. Para inducir el reclutamiento de neutrófilos, un pequeño trozo de gel de agarosa (~ 1 mm de tamaño 3) con recuento de neutrófilos chemoattractant MIP-2 (CXCL2, una quimiocina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un análogo sintético del péptido bacteriano) se coloca en el tejido muscular adyacente a la vénula postcapilares observado. Con el tiempo transcurrido fotografía de vídeo y el ordenador el software ImageJ, el rastreo de neutrófilos intraluminal en el endotelio, la migración de neutrófilos y transendotelial la migración y la quimiotaxis de los tejidos se visualizan y seguimiento. Este protocolo permite a los análisis cuantitativos y fiables de muchos parámetros de reclutamiento de neutrófilos, tales como la velocidad de rastreo intraluminal, el tiempo de la transmigración, el tiempo de separación, la velocidad de la migración, la velocidad de la quimiotaxis y el índice de quimiotaxis en el tejido. Se demuestra que el uso de este protocolo, estos parámetros el reclutamiento de neutrófilos puede ser estable y determinado la locomoción sola célula convenientemente seguimiento en vivo.

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

El reclutamiento de leucocitos circulantes desde el torrente sanguíneo hacia el tejido inflamado es un proceso crucial y complejo de la inflamación1,2. En el...

El objetivo general de este protocolo es utilizar microscopía intravital de campo claro y fotografía de video con lapso de tiempo para estudiar las interacciones dinámicas entre neutrófilos y células endoteliales durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a un quimioatractante para neutrófilos in vivo. En este video, demostramos los procedimientos para utilizar la microscopía intravital de campo claro con video con el fin de visualizar y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración transendotelial y el quimiotaxismo en el tejido muscular cremáster del ratón. El reclutamiento de leucocitos es la característica distintiva de la inflamación.Este proceso de reclutamiento se inicia cuando los leucocitos en la corriente sanguínea comienzan a rodar sobre el endotelio de las venas poscapilares en el sitio de inflamación. En respuesta a quimioquinas u otros quimioatractantes en la superficie endotelial, estos leucocitos en rodadura se detienen y se adhieren firmemente al endotelio. Tras la adhesión, muchos leucocitos se desplazan sobre la superficie luminal y parecen buscar un sitio óptimo para la transmigración.Después de que los leucocitos migran a través del endotelio, un proceso denominado migración transendotelial. Posteriormente, los neutrófilos migran hacia el tejido extravascular en dirección a la fuente del quimioatractante en el sitio inflamatorio, un proceso llamado quimiotaxis MOIs. Este video muestra el experimento sobre cómo utilizar la videografía intravital en campo claro, la microscopía de lapso de tiempo y ImageJ para visualizar, rastrear y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración transendotelial y la migración en quimiotaxis en el tejido muscular Oma, así como la respuesta hacia la fuente de un quimioatractante para neutrófilos.Hola, soy Lis Liu del Departamento de Farmacología del Colegio de Medicina de la Universidad de Saskatchewan. Hoy les mostraremos cómo preparar el quimiotránsito de neutrófilos en gel de agarosa y cómo preparar el músculo retractor del ratón para microscopía intravital.Cómo rastrear el movimiento celular utilizando MEGJ. Y finalmente, cómo analizar los parámetros de reclutamiento de neutrófilos, dos estudiantes de posgrado en nuestro laboratorio, ngel Naja, sh, y Chile les mostrarán los procedimientos experimentales detallados. Hola, soy Naja Sh. Hola, soy Chile.Para comenzar este experimento, prepare el quimiotactante para neutrófilos en gel de agarosa. Primero, agregue con pipeta 10 mililitros de PBS al doble en un tubo cónico de 50 mililitros. Caliente el tubo colocándolo en un vaso que contiene agua caliente. Agregue con pipeta 10 mililitros de agua destilada.Añada 0,4 gramos de polvo de agros y otros 50 mililitros a un tubo cónico. Caliente la mezcla hasta que hierva ligeramente en un horno de microondas para preparar agros al 2% en PBS. Añada el PBS tibio dos veces al tubo de la solución de agros.Agite la solución mezclada y manténgala tibia en el vaso de agua caliente. Mezcle bien la solución de quimioatractivo con tres microlitros de tinta de la India en la tapa de un tubo eppendorf de 1,5 mililitros. Evite generar una burbuja de aire durante la mezcla.Corte el extremo de la punta de un pipeta de 200 microlitros y pipetee 110 microlitros de solución agro a 42 grados Celsius en la tapa e inmediatamente mezcle bien. Usando otra punta de pipeta, guarde este gel que contiene el quimioatractivo en el refrigerador hasta su uso. Anestesie un ratón macho adulto mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilacina y ketamina.Afeite el área sobre la vena yugular externa derecha y la cara anterior del escroto con una cuchilla de afeitar. Con una afeitadora eléctrica después de la anestesia, es importante prestar especial atención y cuidado al ratón anestesiado. Se puede utilizar una lámpara de calor para prevenir la hipotermia en el ratón.El ratón debe estar libre de reflejo de dolor. Realice una incisión horizontal, localice y canule la vena yugular utilizando un tubo PE 10 lleno con solución salina heparinizada a 100 unidades por mililitro. Conecte la plataforma a un circulador de agua a 37 grados Celsius para mantener caliente el músculo cremáster y la mayor parte del cuerpo.Sujete las patas traseras del ratón con cintas umbilicales, colocando la cara más plana hacia arriba sobre la tabla del músculo cremaster. Haga una incisión en la piel escrotal para exponer el músculo cremaster izquierdo. Diseque cuidadosamente el músculo de la fascia asociada.Súper fusione el músculo cremáster con solución salina tamponada con bicarbonato calentada a 37 grados Celsius. Amarre una sutura 4.0 en el extremo distal del músculo cremáster para mantenerlo fijo sobre el pedestal de vidrio transparente del soporte del músculo cremáster. Cauterice longitudinalmente el músculo cremáster con un bisturí eléctrico y una sutura de cuatro hilos.Sostenga el músculo plano y fíjelo a lo largo de los bordes sobre el pedestal. Separe el testículo y el epidídimo del músculo subyacente y colóquelos dentro de la cavidad abdominal. Añada una capa fina de grasa al vacío a los bordes opuestos de un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros.Luego, cubra el músculo expuesto con la laminilla de vidrio. Coloque la placa maestra del músculo sobre la platina del microscopio. Examine el músculo bajo el microscopio y localice una vénula poscapilar adecuada.Seleccione el vaso que tenga una tasa de corte normal y un diámetro entre 25 y 40 micrómetros. Ajuste la cámara de video para permitir que el vaso se visualice en posición vertical en cualquiera de los extremos, derecho o izquierdo, del monitor de televisión. Después de 30 minutos, registre las imágenes de video del vaso postcapilar seleccionado como datos basales de control utilizando un dispositivo grabador de video, como un grabador de DVD.Estas son las imágenes de video de control de línea base del vaso poscapilar. Antes de colocar el gel que contiene el quimioatractante sobre la superficie del músculo cremástero, detenga la superfusión y retire la cubreobjetos de vidrio del músculo. Extraiga con una perforación un gel de un milímetro cúbico de tamaño que contenga el quimioatractante de la tapa del tubo Eppendorf. Utilizando el extremo cortado de una punta de pipeta de 200 microlitros, coloque el gel perforado que contiene el quimioatractante sobre la superficie del músculo cremástero en un área previamente seleccionada, a 350 micrómetros del vaso poscapilar observado.Agregue un cubreobjetos para mantener el gel en su lugar y superfinuse el tejido muscular a una velocidad muy lenta, menor o igual a 10 microlitros por minuto, para permitir el establecimiento de un gradiente de quimioatractante que se libera y forma lentamente desde el gel. Registre la imagen de video durante 90 minutos después de la adición del gel que contiene el quimioatractante. Durante la grabación, ajuste y mantenga el enfoque del microscopio sobre los leucocitos adheridos, en movimiento, transmigrando y realizando quimiotaxis dentro de la vénula y en el tejido muscular.Después del experimento, importe el archivo de video a una computadora. Para el análisis en una computadora, extraiga y convierta el video a un formato VI. Por ejemplo, utilice el software gratuito para computadora bit ripper para convertir el video de DVD a un archivo A VI.Utilice software de edición de video, por ejemplo, Windows Movie Maker, para crear una película de lapso de tiempo a partir del video original en tiempo real; convierta y guarde la película de lapso de tiempo en formato DV AVI. Registre las imágenes del micrómetro de calibración con la misma configuración del microscopio. Importe las imágenes al ordenador.Abra las imágenes con ImageJ. Mida el tamaño de la pantalla en ambos ejes, x e y, y calcule el número de píxeles por micrómetro. Para importar la película, abra ImageJ. Nuevamente, haga clic en Archivo, luego en Importar utilizando el complemento QuickTime Movies, seleccione la película que se analizará y haga clic en Aceptar en la interfaz del abridor de películas QT. A continuación, haga clic en Complementos. Utilice el seguimiento manual para rastrear células; complete la información pertinente en los campos situados en la parte inferior de la pantalla antes de iniciar el seguimiento. Los siguientes parámetros deben determinarse antes del seguimiento temporal.El intervalo en segundos es el intervalo de tiempo completo dividido por 30. La calibración xy es la medición de micrómetros por píxel obtenida mediante la calibración de la imagen del micrómetro. La calibración z se establece en cero. El tamaño del cuadrado de búsqueda para centrar es igual a uno. Es necesario seleccionar en el video grabado un punto estable y claro como punto de referencia. Este punto de referencia puede ser cualquier punto estructural pequeño y definido que permanezca invariable y estable durante todo el experimento.Haga clic en "agregar trayectoria" para rastrear el punto de referencia desde el primer hasta el último fotograma. Luego, haga clic y rastree los neutrófilos que se desplazan y migran uno por uno. Haga clic en "agregar trayectoria" para rastrear la célula desde su aparición en el tejido hasta su desaparición en cada fotograma.Luego, haga clic y realice un seguimiento para finalizar y guardar los resultados en Microsoft Excel. Abra el archivo de resultados en Microsoft Excel. Comience a analizar los datos.Es importante tener en cuenta los movimientos del punto de referencia en el análisis. Al rastrear la migración de neutrófilos y su desplazamiento luminal, determinamos la distancia recorrida por los neutrófilos y su velocidad de desplazamiento. Al analizar la migración transendotelial de neutrófilos, medimos el tiempo de migración trans y el tiempo de desprendimiento.Al determinar la quimiotaxis de neutrófilos en el tejido muscular, medimos la distancia y la velocidad de la migración de neutrófilos y la quimiotaxis en el músculo, y también determinamos el índice de quimiotaxis durante la quimiotaxis de neutrófilos en el tejido muscular. Las definiciones de estos parámetros que se muestran en pantalla se proporcionan con detalle en nuestro protocolo escrito. En este experimento, demostramos los procedimientos para utilizar la microscopía intravital de campo brillante con el fin de visualizar y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración endotelial y la migración en quimiotaxis.En respuesta al quimioatractante de neutr&oacute;filos in vivo, utilizamos ya sea MIP dos CX CL dos o el p&eacute;ptido sint&eacute;tico W-K-Y-M-V-M para preparar un gel de agar para inducir el reclutamiento de neutr&oacute;filos en el tejido muscular CMA de rat&oacute;n. Como podemos observar en esta figura, MIP dos a 0,5 MICROMOLAR y W-K-Y-M-V-M a 0,1 milimolar indujeron el desplazamiento intraluminal de neutr&oacute;filos a velocidades similares. La migraci&oacute;n transendotelial de neutr&oacute;filos y su desprendimiento del v&eacute;nulo fueron comparables en cuanto a la duraci&oacute;n.Estos dos quimioatractantes también indujeron la migración de neutrófilos y quimiotaxis en el tejido muscular a una velocidad casi idéntica y con índices de quimiotaxis de neutrófilos similares. El microscopio intravital es una herramienta valiosa para la observación directa del proceso de reclutamiento de neutrófilos y para la determinación cuantitativa de las funciones de las células y moléculas en cada etapa del reclutamiento. Mediante el uso de fotografía de video con intervalos de tiempo y ImageJ, se puede medir el desplazamiento intraluminal, la migración endotelial y la migración en quimiotaxis de leucocitos y tejido bajo microscopía de campo claro, microscopía intravital, con inhibidores selectivos, ratones transgénicos y quimioatractantes selectivos.El sistema de ensayo puede ayudarnos a revelar las funciones de proteínas específicas en el reclutamiento de leucocitos.

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Research

Investigación

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Immunology and Infection

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Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

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Este protocolo actual emplea reporteros fluorescentes, marcaje in vivo y técnicas de imagen intravital para permitir el monitoreo del proceso dinámico de cebado de neutrófilos en animales vivos.

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Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

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Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital (Video) | JoVE Journal

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

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