Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

El objetivo general de este protocolo es utilizar microscopía intravital de campo claro y fotografía de video con lapso de tiempo para estudiar las interacciones dinámicas entre neutrófilos y células endoteliales durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a un quimioatractante para neutrófilos in vivo. En este video, demostramos los procedimientos para utilizar la microscopía intravital de campo claro con video con el fin de visualizar y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración transendotelial y el quimiotaxismo en el tejido muscular cremáster del ratón. El reclutamiento de leucocitos es la característica distintiva de la inflamación.

Este proceso de reclutamiento se inicia cuando los leucocitos en la corriente sanguínea comienzan a rodar sobre el endotelio de las venas poscapilares en el sitio de inflamación. En respuesta a quimioquinas u otros quimioatractantes en la superficie endotelial, estos leucocitos en rodadura se detienen y se adhieren firmemente al endotelio. Tras la adhesión, muchos leucocitos se desplazan sobre la superficie luminal y parecen buscar un sitio óptimo para la transmigración.

Después de que los leucocitos migran a través del endotelio, un proceso denominado migración transendotelial. Posteriormente, los neutrófilos migran hacia el tejido extravascular en dirección a la fuente del quimioatractante en el sitio inflamatorio, un proceso llamado quimiotaxis MOIs. Este video muestra el experimento sobre cómo utilizar la videografía intravital en campo claro, la microscopía de lapso de tiempo y ImageJ para visualizar, rastrear y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración transendotelial y la migración en quimiotaxis en el tejido muscular Oma, así como la respuesta hacia la fuente de un quimioatractante para neutrófilos.

Hola, soy Lis Liu del Departamento de Farmacología del Colegio de Medicina de la Universidad de Saskatchewan. Hoy les mostraremos cómo preparar el quimiotránsito de neutrófilos en gel de agarosa y cómo preparar el músculo retractor del ratón para microscopía intravital.

Cómo rastrear el movimiento celular utilizando MEGJ. Y finalmente, cómo analizar los parámetros de reclutamiento de neutrófilos, dos estudiantes de posgrado en nuestro laboratorio, ngel Naja, sh, y Chile les mostrarán los procedimientos experimentales detallados. Hola, soy Naja Sh. Hola, soy Chile.

Para comenzar este experimento, prepare el quimiotactante para neutrófilos en gel de agarosa. Primero, agregue con pipeta 10 mililitros de PBS al doble en un tubo cónico de 50 mililitros. Caliente el tubo colocándolo en un vaso que contiene agua caliente. Agregue con pipeta 10 mililitros de agua destilada.

Añada 0,4 gramos de polvo de agros y otros 50 mililitros a un tubo cónico. Caliente la mezcla hasta que hierva ligeramente en un horno de microondas para preparar agros al 2% en PBS. Añada el PBS tibio dos veces al tubo de la solución de agros.

Agite la solución mezclada y manténgala tibia en el vaso de agua caliente. Mezcle bien la solución de quimioatractivo con tres microlitros de tinta de la India en la tapa de un tubo eppendorf de 1,5 mililitros. Evite generar una burbuja de aire durante la mezcla.

Corte el extremo de la punta de un pipeta de 200 microlitros y pipetee 110 microlitros de solución agro a 42 grados Celsius en la tapa e inmediatamente mezcle bien. Usando otra punta de pipeta, guarde este gel que contiene el quimioatractivo en el refrigerador hasta su uso. Anestesie un ratón macho adulto mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de xilacina y ketamina.

Afeite el área sobre la vena yugular externa derecha y la cara anterior del escroto con una cuchilla de afeitar. Con una afeitadora eléctrica después de la anestesia, es importante prestar especial atención y cuidado al ratón anestesiado. Se puede utilizar una lámpara de calor para prevenir la hipotermia en el ratón.

El ratón debe estar libre de reflejo de dolor. Realice una incisión horizontal, localice y canule la vena yugular utilizando un tubo PE 10 lleno con solución salina heparinizada a 100 unidades por mililitro. Conecte la plataforma a un circulador de agua a 37 grados Celsius para mantener caliente el músculo cremáster y la mayor parte del cuerpo.

Sujete las patas traseras del ratón con cintas umbilicales, colocando la cara más plana hacia arriba sobre la tabla del músculo cremaster. Haga una incisión en la piel escrotal para exponer el músculo cremaster izquierdo. Diseque cuidadosamente el músculo de la fascia asociada.

Súper fusione el músculo cremáster con solución salina tamponada con bicarbonato calentada a 37 grados Celsius. Amarre una sutura 4.0 en el extremo distal del músculo cremáster para mantenerlo fijo sobre el pedestal de vidrio transparente del soporte del músculo cremáster. Cauterice longitudinalmente el músculo cremáster con un bisturí eléctrico y una sutura de cuatro hilos.

Sostenga el músculo plano y fíjelo a lo largo de los bordes sobre el pedestal. Separe el testículo y el epidídimo del músculo subyacente y colóquelos dentro de la cavidad abdominal. Añada una capa fina de grasa al vacío a los bordes opuestos de un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros.

Luego, cubra el músculo expuesto con la laminilla de vidrio. Coloque la placa maestra del músculo sobre la platina del microscopio. Examine el músculo bajo el microscopio y localice una vénula poscapilar adecuada.

Seleccione el vaso que tenga una tasa de corte normal y un diámetro entre 25 y 40 micrómetros. Ajuste la cámara de video para permitir que el vaso se visualice en posición vertical en cualquiera de los extremos, derecho o izquierdo, del monitor de televisión. Después de 30 minutos, registre las imágenes de video del vaso postcapilar seleccionado como datos basales de control utilizando un dispositivo grabador de video, como un grabador de DVD.

Estas son las imágenes de video de control de línea base del vaso poscapilar. Antes de colocar el gel que contiene el quimioatractante sobre la superficie del músculo cremástero, detenga la superfusión y retire la cubreobjetos de vidrio del músculo. Extraiga con una perforación un gel de un milímetro cúbico de tamaño que contenga el quimioatractante de la tapa del tubo Eppendorf. Utilizando el extremo cortado de una punta de pipeta de 200 microlitros, coloque el gel perforado que contiene el quimioatractante sobre la superficie del músculo cremástero en un área previamente seleccionada, a 350 micrómetros del vaso poscapilar observado.

Agregue un cubreobjetos para mantener el gel en su lugar y superfinuse el tejido muscular a una velocidad muy lenta, menor o igual a 10 microlitros por minuto, para permitir el establecimiento de un gradiente de quimioatractante que se libera y forma lentamente desde el gel. Registre la imagen de video durante 90 minutos después de la adición del gel que contiene el quimioatractante. Durante la grabación, ajuste y mantenga el enfoque del microscopio sobre los leucocitos adheridos, en movimiento, transmigrando y realizando quimiotaxis dentro de la vénula y en el tejido muscular.

Después del experimento, importe el archivo de video a una computadora. Para el análisis en una computadora, extraiga y convierta el video a un formato VI. Por ejemplo, utilice el software gratuito para computadora bit ripper para convertir el video de DVD a un archivo A VI.

Utilice software de edición de video, por ejemplo, Windows Movie Maker, para crear una película de lapso de tiempo a partir del video original en tiempo real; convierta y guarde la película de lapso de tiempo en formato DV AVI. Registre las imágenes del micrómetro de calibración con la misma configuración del microscopio. Importe las imágenes al ordenador.

Abra las imágenes con ImageJ. Mida el tamaño de la pantalla en ambos ejes, x e y, y calcule el número de píxeles por micrómetro. Para importar la película, abra ImageJ. Nuevamente, haga clic en Archivo, luego en Importar utilizando el complemento QuickTime Movies, seleccione la película que se analizará y haga clic en Aceptar en la interfaz del abridor de películas QT. A continuación, haga clic en Complementos. Utilice el seguimiento manual para rastrear células; complete la información pertinente en los campos situados en la parte inferior de la pantalla antes de iniciar el seguimiento. Los siguientes parámetros deben determinarse antes del seguimiento temporal.

El intervalo en segundos es el intervalo de tiempo completo dividido por 30. La calibración xy es la medición de micrómetros por píxel obtenida mediante la calibración de la imagen del micrómetro. La calibración z se establece en cero. El tamaño del cuadrado de búsqueda para centrar es igual a uno. Es necesario seleccionar en el video grabado un punto estable y claro como punto de referencia. Este punto de referencia puede ser cualquier punto estructural pequeño y definido que permanezca invariable y estable durante todo el experimento.

Haga clic en "agregar trayectoria" para rastrear el punto de referencia desde el primer hasta el último fotograma. Luego, haga clic y rastree los neutrófilos que se desplazan y migran uno por uno. Haga clic en "agregar trayectoria" para rastrear la célula desde su aparición en el tejido hasta su desaparición en cada fotograma.

Luego, haga clic y realice un seguimiento para finalizar y guardar los resultados en Microsoft Excel. Abra el archivo de resultados en Microsoft Excel. Comience a analizar los datos.

Es importante tener en cuenta los movimientos del punto de referencia en el análisis. Al rastrear la migración de neutrófilos y su desplazamiento luminal, determinamos la distancia recorrida por los neutrófilos y su velocidad de desplazamiento. Al analizar la migración transendotelial de neutrófilos, medimos el tiempo de migración trans y el tiempo de desprendimiento.

Al determinar la quimiotaxis de neutrófilos en el tejido muscular, medimos la distancia y la velocidad de la migración de neutrófilos y la quimiotaxis en el músculo, y también determinamos el índice de quimiotaxis durante la quimiotaxis de neutrófilos en el tejido muscular. Las definiciones de estos parámetros que se muestran en pantalla se proporcionan con detalle en nuestro protocolo escrito. En este experimento, demostramos los procedimientos para utilizar la microscopía intravital de campo brillante con el fin de visualizar y determinar el desplazamiento intraluminal de neutrófilos, la migración endotelial y la migración en quimiotaxis.

En respuesta al quimioatractante de neutrófilos in vivo, utilizamos ya sea MIP dos CX CL dos o el péptido sintético W-K-Y-M-V-M para preparar un gel de agar para inducir el reclutamiento de neutrófilos en el tejido muscular CMA de ratón. Como podemos observar en esta figura, MIP dos a 0,5 MICROMOLAR y W-K-Y-M-V-M a 0,1 milimolar indujeron el desplazamiento intraluminal de neutrófilos a velocidades similares. La migración transendotelial de neutrófilos y su desprendimiento del vénulo fueron comparables en cuanto a la duración.

Estos dos quimioatractantes también indujeron la migración de neutrófilos y quimiotaxis en el tejido muscular a una velocidad casi idéntica y con índices de quimiotaxis de neutrófilos similares. El microscopio intravital es una herramienta valiosa para la observación directa del proceso de reclutamiento de neutrófilos y para la determinación cuantitativa de las funciones de las células y moléculas en cada etapa del reclutamiento. Mediante el uso de fotografía de video con intervalos de tiempo y ImageJ, se puede medir el desplazamiento intraluminal, la migración endotelial y la migración en quimiotaxis de leucocitos y tejido bajo microscopía de campo claro, microscopía intravital, con inhibidores selectivos, ratones transgénicos y quimioatractantes selectivos.

El sistema de ensayo puede ayudarnos a revelar las funciones de proteínas específicas en el reclutamiento de leucocitos.