Cambio de la dirección y la orientación del campo eléctrico durante la aplicación pulsos eléctricos Mejora la transferencia de genes plásmido In vitro
12 de septiembre de 2011
Transfección de genes mediante electroporación se mejora aproximadamente dos veces en la orientación del campo eléctrico se modifica durante la aplicación de pulsos, mientras que la viabilidad celular no se ve afectada. El aumento de la transfección de genes es causada por el aumento de la superficie de membrana que se hace competente para la entrada de ADN en la célula.
La transferencia génica por electroforesis es un método físico utilizado para introducir genes en las células mediante la aplicación de pulsos eléctricos breves e intensos. En una transferencia génica por electroforesis exitosa, se involucran varios pasos: la formación de un complejo entre el ADN y la membrana celular, la translocación del ADN a través de la membrana perturbada, el transporte del ADN desde el citoplasma hacia el núcleo y la expresión génica tras la electrotransferencia. Se utilizan diferentes protocolos de pulsos eléctricos con el fin de lograr una transfección génica máxima.
Uno de ellos consiste en cambiar la orientación del campo eléctrico durante la aplicación del pulso. En este video, demostramos la diferencia en la eficiencia de transferencia de genes mediante electroporación cuando todos los pulsos se aplican en la misma dirección y cuando se aplican pulsos cambiando la orientación del campo eléctrico. Los experimentos se realizaron en células de ovario de hámster chino, CHOK1, para el estudio.
Siga estos pasos: cultive las células en un matraz de cultivo en la incubadora durante 24 horas. El día del experimento, prepare la suspensión celular mediante tripsina con solución de tripsina al 0,25 % en EDTA y cuente las células. Centrifugue las células durante cinco minutos a 1000 rotaciones por minuto a cuatro grados Celsius y resuspenda los botones celulares en tampón de fosfato de sodio ISO OSM Miller hasta alcanzar una densidad celular de 5 millones de células por mililitro. Luego, transfiera la muestra al recipiente adecuado. Las células se exponen a un campo eléctrico en una punta de pipeta con electrodos integrados conectados a un generador prototipo de alto voltaje.
Estos electrodos permiten aplicar un campo eléctrico relativamente homogéneo en diferentes direcciones. La punta y el generador fueron desarrollados en el laboratorio de bioingeniería de la facultad de ingeniería eléctrica. La Universidad de Luana añade el plásmido E-G-F-P-N uno a una suspensión celular con una concentración de 10 microgramos por mililitro.
Mezcle las células con ADN plasmídico completamente e incube la mezcla durante dos o tres minutos a temperatura ambiente antes de aplicar los pulsos eléctricos. Aspire 100 microlitros de la suspensión celular hacia la punta del pipeteo con electrodos integrados. En este experimento, se aplica un tren de ocho pulsos rectangulares utilizando un generador prototipo de alto voltaje; se emplean diferentes protocolos de campo eléctrico en el primer protocolo.
Todos los pulsos se aplican en la misma dirección, mientras que en el segundo protocolo, los pulsos se aplican cambiando la orientación del campo eléctrico. El segundo protocolo solo puede utilizarse con un generador de pulsos adecuado, que permita la aplicación de pulsos eléctricos en diferentes direcciones. Inmediatamente después de la aplicación del pulso, transfiera las células desde la punta del pipeta a placas de seis pocillos y agregue suero bovino fetal.
Incubar las células durante cinco minutos a 37 grados CELs con un volumen de muestra del 25%. Para permitir el re-sellado de la membrana celular, añadir dos mililitros de HAMF 12 a cada muestra en una placa de seis pocillos e incubar las células durante 24 horas a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5%CO2 en el incubador. La eficiencia de la electrotransferencia génica se determina como el porcentaje de células que expresan GFP 24 horas después de la aplicación del pulso.
Las células se observan utilizando un microscopio de fluorescencia en el software de adquisición. Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nanómetros y seleccione un filtro de paso de banda adecuado para la imagen fluorescente verde a fin de detectar las células que expresan GFP. Adquiera al menos cinco imágenes, con contraste de fase y fluorescencia verde, a 20 aumentos.
El recuento de células mediante aumento objetivo en la imagen de contraste de fase y las células que expresan GFP en la imagen de fluorescencia verde determina el porcentaje de eficiencia de electrotransferencia génica, dividiendo el número de células que expresan GFP entre el número total de células en cada imagen correspondiente. El porcentaje de células que expresan GFP cuando todos los pulsos se aplican en la misma dirección y cuando los pulsos se aplican cambiando la orientación del campo eléctrico se presenta mediante el cambio en la orientación del campo eléctrico. El porcentaje de células que expresan GFP aumenta significativamente.
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Descripción general
Este estudio investiga la transfección génica mediante electropermeabilización, destacando el impacto de la orientación del campo eléctrico en la eficiencia de la transfección. Los resultados indican que modificar la dirección del campo eléctrico durante la aplicación del pulso puede duplicar las tasas de transfección génica sin comprometer la viabilidad celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Terapia génica
- Biología celular
- Técnicas de electrotransferencia
Antecedentes
- La transferencia génica por electroporación es un método para introducir genes en células.
- Consiste en aplicar pulsos eléctricos breves e intensos para facilitar la entrada de ADN.
- Para lograr una transfección exitosa, el ADN debe atravesar la membrana celular e ingresar al núcleo.
- Diferentes protocolos de pulsos eléctricos pueden mejorar la eficiencia de la transfección.
Objetivo del estudio
- Evaluar el efecto de la orientación del campo eléctrico en la eficiencia de transfección génica.
- Determinar si el cambio de orientación afecta la viabilidad celular.
- Mostrar el proceso utilizando células de ovario de hámster chino (CHO).
Métodos Utilizados
- Aplicación de pulsos eléctricos a células CHO.
- Comparación de la eficiencia de transfección con distintas orientaciones del campo eléctrico.
- Evaluación de la viabilidad celular tras la transfección.
- Análisis de la entrada de ADN en las células y la expresión génica subsiguiente.
Resultados Principales
- La eficiencia de transfección génica mejoró aproximadamente dos veces con la orientación alterada del campo eléctrico.
- No se observó un impacto significativo en la viabilidad celular.
- El aumento del área de la membrana contribuyó a una mayor entrada de ADN.
- Se demostró la eficacia de diferentes protocolos de pulsos eléctricos.
Conclusiones
- Cambiar la orientación del campo eléctrico durante la aplicación del pulso mejora significativamente la transfección génica.
- Este método puede optimizarse sin comprometer la salud celular.
- Investigaciones futuras podrían explorar protocolos adicionales para mejorar la entrega de genes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La optimización de la orientación del campo eléctrico durante la electroporación mejora la eficiencia de transferencia génica de plásmidos, ofreciendo una estrategia no viral para aumentar los rendimientos de transfección en protocolos iniciales de validación de dianas e identificación de compuestos activos. Este enfoque facilita la desactivación mecanicista de riesgos al incrementar la entrada de ADN mediante una mayor competencia de la membrana sin comprometer la viabilidad celular, mejorando así la confianza predictiva en modelos preclínicos. El método permite una entrega génica reproducible y escalable para el desarrollo de ensayos y aplicaciones de cribado fenotípico en la I+D de biotecnología y farmacéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Aumenta el área de membrana competente para la entrada de ADN, mejorando la eficiencia de transfección y apoyando la validación funcional de objetivos en estudios de expresión de proteínas recombinantes.
- Valor operativo: Permite una entrega consistente de plásmidos en poblaciones celulares, reduciendo la variabilidad en pruebas de hipótesis en etapas iniciales y en la aclaración de vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia de la eficiencia de transferencia génica compatibles con plataformas de cribado de alto contenido.
- Valor operativo: Estandariza los parámetros de electrotransferencia mediante puntas de electrodo integradas y generadores de pulsos programables, mejorando la reproducibilidad del ensayo entre laboratorios.
- Valor estratégico: Facilita la preparación escalable de líneas celulares transfectadas para ensayos posteriores de interacción con dianas y biomarcadores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la viabilidad celular tras la transfección, lo que permite estudios longitudinales de la expresión génica y de los efectos fenotípicos en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Facilita la generación de modelos preclínicos estables o transfectados transitoriamente utilizando células CHO, un hospedador ampliamente empleado en la producción de biológicos y en el análisis de vías metabólicas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, donde se requiere una entrega génica eficiente para evaluar la función del blanco y modular vías en modelos celulares.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la sobreexpresión o reducción fiable de genes de interés en células de mamífero.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados de transfección que permiten comparar constructos genéticos o elementos reguladores.
- Análisis: Genera métricas de eficiencia basadas en porcentajes (células GFP+/células totales) que permiten comparaciones estadísticas entre protocolos de pulsos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al producir células transfectadas viables adecuadas para validaciones posteriores en modelos 3D o sistemas de co-cultivo.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de electropermeabilización reutilizable aplicable en múltiples proyectos que requieren la entrega de plásmidos en líneas celulares adherentes o en suspensión.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en los resultados de la transferencia génica al aumentar la eficiencia de transfección mediante la optimización biofísica de los parámetros del pulso.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización de los procedimientos de transferencia génica mediante trenes de pulsos definidos y control de la orientación del campo.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en la validación de objetivos al garantizar una expresión suficiente del transgén para la evaluación fenotípica, minimizando los falsos negativos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos genéticos según los niveles alcanzables de expresión en ensayos celulares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células de mamífero, preparación de plásmidos y microscopía de fluorescencia para la evaluación de la eficiencia de transfección.
- Depende del acceso a generadores de pulsos de alto voltaje capaces de cambios programables en la orientación del campo eléctrico y puntas integradas con electrodos compatibles.
- Necesita la estandarización de los parámetros del pulso (voltaje, duración, número) y de la densidad celular entre experimentos para garantizar comparabilidad.
- Implica la optimización de la relación ADN-célula y de los tiempos de incubación para equilibrar la eficiencia de transfección con el estrés celular.
- Se limita a líneas celulares adherentes o en suspensión compatibles con la electrotransferencia; células primarias o sensibles pueden requerir métodos alternativos de entrega.
