Name: GENPLAT: una plataforma automatizada para el descubrimiento de enzimas de la biomasa y la optimización Cocktail (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Aprende a optimizar cócteles enzimáticos para la degradación de biomasa lignocelulósica mediante el sistema automatizado GENPLAT. Este método mejora la eficiencia en la conversión de biomasa a azúcares fermentables para producción de biocombustibles.

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Este trabajo fue financiado en parte por el Departamento de Energía de EE.UU. de los Grandes Lagos Centro de Investigación en Bioenergía (DOE Oficina de Ciencia BER DE-FC02-07ER64494) y conceder DE-FG02-91ER200021 del Departamento de Energía de EE.UU., Oficina de Ciencias Básicas de Energía, División de de Ciencias Químicas, Geociencias y Ciencias Biológicas. Agradecemos a John Scott-Craig y Borrusch Melissa por sus contribuciones materiales y conceptuales.

1. Producción de enzimas <ol><li> La producción de proteínas en Pichia pastoris mediante la clonación de los genes correspondientes en vectores pPICZ o pPICZα y su transformación en P. pastoris. Se cultivan las células en 300 ml en lotes desconcertado matraces de 500 ml con la inducción de metanol cada 24 horas (Banerjee et al., 2010a). </li><li> Concentrar y desalinizar los filtrados del cultivo por filtración de flujo tangencial. </li><li> Tienda de las enzimas en pequeñas alícuotas de 20% de glicerol a -80 ° C. El rango de concentración es 1.10 mg / ml. </li></ol> 2. Diseño del Experimento <ol><li> Introduzca el número de enzimas para la prueba, su superior e inferior de proporciones (por ejemplo, una menor proporción de 5% para las enzimas del núcleo), y el tipo de diseño experimental (por ejemplo, cuadrática o cúbica) en el diseño Expertsoftware. </li><li> Calcular la cantidad en mg de cada enzima que se añade a hacer una carga total de 15 mg / g glucano, y después calcular la cantidad de cada enzima en l que añadir acada reacción. </li><li> Generar hojas de cálculo Excel especificando material de laboratorio de origen, los pozos de la fuente, material de laboratorio de destino, los pozos de destino, y los volúmenes de transferencia para la distribución de agua y las enzimas de acuerdo con el diseño experimental y la importación en el software Biomek FXP utilizando la función de transferencia-de-archivo. </li></ol> 3. La hidrólisis enzimática <ol><li> Suspender la suspensión de la biomasa en 50 mM de citrato sódico, pH 4,8, que contiene 5 mg / ml de tetraciclina y 5 cicloheximida mg / ml, en el embalse de paddle. </li><li> Robot pipeta 200 ul de la mezcla en cada pocillo de una placas de 96 pocillos de reacción de pozo profundo con Span-8 1000-l puntas de pipeta con los últimos 0,5 cm cortado. Mezclar la pasta una vez a 100 l / seg y luego aspirar el mismo volumen de la reserva paddle y se distribuye en las placas. </li><li> Prescindir de las enzimas en el mismo plato con el programa entró en el FX Beckman. </li><li> Sellar las placas con capmats perforables. </li><li> Invertir y toquelas placas en varias ocasiones para superar la tensión superficial. Coloque las placas a 50 ° C durante 48 horas en la hibridación incubadora girando a 10 rpm. </li></ol> 4. Determinación de la Glc y XYL <ol><li> Centrifugar las placas de reacción durante 3 minutos a 1250 xg en una centrífuga de basculante. </li><li> Transferencia de 100 l del sobrenadante en regulares placas de 96 pocillos con la vaina de la AP96 FX Biomek. </li><li> Las placas se incuban a 90-95 ° C durante 10 minutos para inactivar las enzimas, y luego se centrifuga a 1250 xg durante 30 segundos. </li><li> Para las mediciones de Glc, la transferencia de 12 l de los sobrenadantes en regulares placas de 96 pocillos. Añadir 192 l de la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) reactivo. Las placas se incuban a 50 ° C durante 20 minutos y leer las absorbancias a 510 nm en un lector de microplacas. En blanco se mezcla de reacción sin enzima. </li><li> Para las mediciones de XYL, la transferencia de 4 l en placas de 384 pocillos. Añadir los reactivos de ensayo y leer las placas a 340 nm. En blancoes la mezcla de reacción sin enzima. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Convertir los valores de absorbancia a su Glc% y los rendimientos XYL basada en el conocido Glc y contenido XYL de la biomasa original. Importación de estos porcentajes, las respuestas en el software Design-Expert. Compruebe la paramenters estadísticos para asegurarse de que los criterios para un modelo sólido que se cumplan. </li><li> Confirman la predicción mejor modelo experimental. </li></ol> 6. Los resultados representativos con GENPLAT: (1) Creación de mezclas optimizadas de cada uno de proteínas puras. Los resultados indican que las enzimas son importantes, y en qué proporciones, y también que las enzimas no son importantes. Algunas proteínas que son abundantes en la T. reesei secretoma (Nagendran et al., 2009), como Cip1 y CIP2, parecen desempeñar ningún papel en la liberación del maíz Glc pretratados por la expansión de fibra amoniaco (AFEX) o alcalino hyd rastrojo Rogen peróxido (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Por otro lado, algunas proteínas son inesperadamente importante. Por ejemplo, endo-xilanasas de las familias de glicosil hidrolasa 10 y 11 son importantes para la liberación Glc, una xilanasa no puede sustituir a la otra (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, una proteína de menor importancia en la T. reesei secretoma, es muy importante para Glc pero no XYL liberación. Algunas enzimas son importantes para la liberación de ambos Glc y XYL, mientras que otros sólo son necesarios para uno u otro (Banerjee et al., 2010c). Una mezcla sintética que contiene 16 componentes, cada uno a una concentración de 0,94 mg / ml (es decir, una mezcla no optimizado), lanzado el 38% de la disponible Glc de AFEX pretratados DDG. En condiciones de hidrólisis idénticas, una mezcla optimizada, en la que las concentraciones de los 16 componentes del 0% al 32%, dado a conocer el 52% de la Glc (Fig. 2). Este experimento ilustra la utilidad de la construcción de mezclas definidas. _content "&gt; (2) Creación de un cóctel optimizado para el pretratamiento diferentes / combinaciones de sustrato. actuales preparaciones de celulasa comerciales son de" talla única para todos ". En realidad, el mejor cóctel depende del sustrato y el pretratamiento. Un solo producto como Accellerase 1000 ofrece diferentes rendimientos de los diferentes sustratos tratados previamente de la misma manera, y desde el mismo sustrato expuestos a diferentes tratamientos previos (Fig. 1). Hemos utilizado GENPLAT para optimizar las mezclas de enzimas puras para múltiples tratamientos previos y materias primas mutiple (Banerjee et al., 2010c). Figura 2 muestra cómo la proporción óptima de la enzima de 16 enzimas puras es diferente para el rastrojo de maíz AFEX pretratados, AHP pretratados rastrojo de maíz y DDG AFEX pretratados. Sólo el 11 por enzimas se muestra en la Fig. 2. porque el óptimo proporciones de los otros cinco (Cel61B, AbfB, Cip1, CIP2 y Cel12A) resultaron ser del 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) Nuevos descubrimiento de enzimas T. reesei y A. niger cultivado en diferentes sustratos. Un extracto especial impulsado Glc rendimiento cuando se añade a nuestra colección básica. La proteína responsable fue purificado y ha demostrado ser una hidrolasa novela glicosil no están presentes en cualquier preparado enzimático comercial (Banerjee y Walton, resultados no publicados). (4) El descubrimiento de mejores enzimas. Después de haber demostrado con GENPLAT que las enzimas son más importantes para la degradación de unbiomasa en particular, tenemos una mejor comprensión de las enzimas que debe ser el enfoque de mejora. Mejores ejemplos de las enzimas críticas se puede encontrar buscando en la naturaleza o fabricados por ingeniería de proteínas. (Una enzima podría ser "mejor" que su homólogo de T. reesei de varias maneras, dependiendo de la propiedad deseada, por ejemplo, actividad específica más alta, una mayor sinergia, disminución de la sensibilidad proteolítica, o la estabilidad térmica mejorada). GENPLAT ofrece una plataforma significativa para el ensayo de enzimas potencialmente mejor, ya que utiliza un cóctel complejo realista (importante porque no enzimática de biomasa funciona en forma aislada) y un sustrato realista (importante porque los resultados con pura celulosa u otros sustratos artificiales pueden no ser relevantes para lignocelulósicos naturales materiales). (5) la optimización de enzimas comerciales. Cantidades suficientes de enzimas puras no existen en el mundo real. Hasta que lo hagan, el etanol prolos productores deben confiar en los productos comerciales, tales como Accellerase 1000 y MultifectXylanase. Sin embargo, las mezclas de enzimas comerciales funcionan mejor que cualquier individuo, y GENPLAT se puede utilizar para el diseño optimizado de múltiples cócteles de enzimas comerciales. La Figura 3 muestra el uso de GENPLAT para optimizar una mezcla de cuatro preparados enzimáticos comerciales. Las proporciones óptimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG se encontró que el 47% Accellerase1000, el 27% Multifect pectinasa, el 22% Novozyme 188, y el 4% Multifect xilanasa (Banerjee et al., 2010c). Figura 3B muestra las diferencias en el rendimiento de AFEX Glc-DDG con cuatro preparados enzimáticos, la mezcla comercial optimizado ofrece un mayor rendimiento de Glc Accellerase1000 solo, SpezymeCP solo, o una mezcla sintética de 16 componentes. Esta experiencia también indica que la mezcla sintética de 16 componentes que falta uno o más enzimas necesarias para la óptima liberación Glc, que están presentes en uno o más de las enzimas comerciales. GENPLAT puede sered para identificar estos componentes. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. No solo la preparación enzimática comercial es óptimo para todos los sustratos y pretratamientos todos. Cinco sustratos y tratamientos previos tres se compararon en las mismas condiciones de la molienda (0,5 mm de tamaño de partícula), la carga de la enzima (15 mg / g glucano), y las condiciones de hidrólisis (48 h, 50 ° C). A. La digestión de los diferentes sustratos pretratados AFEX con Accellerase 1000. digestión B. de rastrojo de maíz pretratadas con tres métodos diferentes con Accellerase 1000 (ver Banerjee et al., 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Proporciones óptimas de 11 enzimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados con el rastrojo de maíz (AFEX-CS), alcalinas de peróxido de hidrógeno pretratados con el rastrojo de maíz (AHP-CS), o AFEX pretratados secos destilargranos de res "(AFEX-DDG). Los datos proceden de Banerjee et al. (2010c). Números en la parte superior de las barras son los rendimientos Glc como un porcentaje del total de Glc en la muestra de la biomasa. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A. El uso de GENPLAT para producir una mezcla optimizada de los cuatro preparados enzimáticos comerciales para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG. Multifect xilanasa hecho la contribución más pequeña (4%) y por lo tanto, se omitió en este diagrama ternario. Glc B. rendimientos de AFEX-DDG con tratamientos de enzimas diferentes en condiciones de hidrólisis idénticos (15 mg / g enzima glucano, 48 h, 50 ° C) . "Cuatro componentes comerciales" tiene las proporciones determinadas a partir del experimento se muestra en la fig. 3A.

<ol><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction%3A+production+and+optimization+of+a+core+set%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengineer%22%5BJournal%5D)">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment%2Fbiomass+feedstock+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li>
<li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li>
<li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li>
<li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+%28AFEX%29+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li>
<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Es ampliamente reconocido que la reducción del costo de las enzimas es importante para el desarrollo de una industria de etanol lignocelulósico económica. Cócteles comerciales disponibles en la actualidad las enzimas son mezclas complejas y mal definido de muchas proteínas (Nagendran et al., 2009), y están adaptados principalmente para el uso de ácido pretratados con el rastrojo de maíz. Con el fin de acelerar el desarrollo de un cóctel de enzimas mejor, varios laboratorios han desarrollado plataformas de alto rendimiento para el descubrimiento y caracterización de enzimas. Los esfuerzos en esta área han incorporado uno o más de las siguientes propiedades también se encuentra en GENPLAT: robot de dispensación de las enzimas y lodos de la biomasa, el diseño estadístico de experimentos, y / o determinación automática de Glc y XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT extiende estos primeros esfuerzos, lo más importante en la complejidad de las mezclas de enzimas que pueden ser analizados desde un máximo de 6 componentes enlos estudios anteriores de más de 16 años en nuestros últimos trabajos (Banerjee et al., 2010c). Otras funciones clave de GENPLAT son el uso de una cámara de mezcla de bolas (depósito de remo) que puede mantener el rastrojo lodos suspendidos durante la distribución, mezcla suave durante la digestión de extremo a extremo de rotación, y la determinación colorimétrica automatizado de Glu y XYL.

Equipos y software que se utiliza: <ol><li> Design-Expert, versión 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP laboratorio de automatización de estaciones de trabajo (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Biomek FXP software, la versión 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Paddle depósito (Modelo VP 756C-1P100, V &amp; P Scientific Inc., San Diego) </li><li> Placas, de 96 de profundidad (1,5 ml) y (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Reino Unido) </li><li> Capmats perforable (EE.UU. Científico, Ocala, FL) </li><li> Rotación de hibridación incubadora (Modelo 5420, VWR) </li><li> Swinging-cubo de centrífuga (Modelo 5810R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) </li><li> Placas, Costar de 96 pocillos (ABgene, Fisher Scientific, Epson, Reino Unido) </li><li> Placas, 384-y (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Reactivos utilizados: <ol><li> Pichia pastoris y vectores: cepa X33, y pPICZ y pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei y vectores: la tensión QM9414 (EE.UU. Departamento de Agricultura de Centro Nacional para la Investigación de Utilización Agrícola en Peoria, IL), y pCB1004 EV-(Banerjee et al, 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (número de lote 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY) </li><li> Sodio 50 mM citrato, pH 4,8 </li><li> Tetraciclina stock: 10 mg / ml </li><li> Acciones cicloheximida: 10 mg / ml </li><li> GoPod kit de ensayo, el catálogo de K-gluc (Megazyme, Bray, Irlanda) </li><li> Xilosa kit de ensayo, el catálogo de K-xilosa (Megazyme, Bray, Irlanda) </li></ol>

genplat: una plataforma automatizada para el descubrimiento de enzimas de la biomasa y la optimización cocktail

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

El alto costo de las enzimas para la descomposición de la biomasa es un impedimento importante para la conversión económica de materias primas lignocelulósicas en combustibles líquidos de transporte como el etanol. Hemos desarrollado una plataforma integrada de alto rendimiento, denominada GENPLAT, para el descubrimiento y desarrollo de enzimas novedosas y cócteles enzimáticos destinados a liberar azúcares a partir de diversas combinaciones de biomasa y pretratamientos. GENPLAT comprende cuatro elementos: enzimas puras individuales, diseño estadístico de experimentos, pipeteo robótico de suspensiones de biomasa y enzimas, y determinación automática colorimétrica de Glc y Xyl liberados. Las enzimas individuales se producen mediante expresión en Pichia pastoris o Trichoderma reesei, o mediante purificación cromatográfica a partir de cócteles comerciales o de extractos de microorganismos novedosos. Los modelos de mezclas simplex reticulados (factoriales fraccionados) se diseñan utilizando software estadístico comercial de diseño de experimentos. Las mezclas enzimáticas de alta complejidad se construyen mediante pipeteo robótico en formato de placas de 96 pocillos. La medición de Glc y Xyl liberados se automatiza utilizando ensayos colorimétricos acoplados a enzimas. Se han probado mezclas enzimáticas optimizadas, que contienen hasta 16 componentes, en diversas combinaciones de materias primas y pretratamientos.
GENPLAT es adaptable a mezclas de enzimas puras, mezclas de productos comerciales (por ejemplo, Accellerase 1000 y Novozyme 188), extractos de microorganismos novedosos, o combinaciones de estos. Para preparar y probar mezclas de &tilde;10 enzimas puras requieren menos de 100 &mu;g de cada proteína y menos de 100 reacciones totales, cuando se opera con una carga total final de 15 mg de proteína/g de glucano. Utilizamos enzimas de varias fuentes. Las enzimas pueden purificarse de fuentes naturales tales como cultivos fúngicos (por ejemplo, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, y Galerina marginata), o pueden obtenerse mediante la expresión de los genes que los codifican (obtenidos del creciente número de secuencias genómicas microbianas) en hospedadores como E. coli, Pichia pastoris, o un hongo filamentoso como T. reeseiLas proteínas también pueden purificarse a partir de cócteles enzimáticos comerciales (por ejemplo, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Un número creciente de enzimas puras, incluidas glicosil hidrolasas, esterasas activas sobre la pared celular, proteasas y liasas, están disponibles en fuentes comerciales, por ejemplo, Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) y PROZOMIX (www.prozomix.com).
El software Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) se utiliza para crear diseños de rejilla simplex y para analizar las respuestas (en este caso, la liberación de Glc y Xyl). Las mezclas contienen de 4 a 20 componentes, cuyas proporciones pueden variar entre 0 y 100 %. Los puntos del ensayo incluyen típicamente los vértices extremos, con un número suficiente de puntos intermedios para generar un modelo válido. En la terminología del diseño experimental, la mayoría de nuestros estudios son experimentos de «mezcla», lo que significa que la suma de todos los componentes equivale a una carga total fija de proteína (expresada como mg/g de glucano). El número de mezclas en la rejilla simplex depende tanto del número de componentes en la mezcla como del grado del polinomio (cuadrático o cúbico). Por ejemplo, un experimento con 6 componentes requerirá 63 reacciones separadas con un modelo cúbico especial aumentado, el cual puede detectar interacciones de tres factores, mientras que solo se necesitan 23 reacciones individuales con un modelo cuadrático aumentado. Para mezclas que contienen más de ocho componentes, un diseño experimental cuadrático es más práctico, y en nuestra experiencia tales modelos suelen ser estadísticamente válidos.
Todas las cargas enzimáticas se expresan como un porcentaje de la carga total final (que en nuestros experimentos es típicamente 15 mg de proteína/g de glucano). Para las enzimas «principales», el límite inferior se establece en 5 %. Este límite se derivó de nuestra experiencia, en la cual los rendimientos de Glc y/o Xyl fueron muy bajos si alguna enzima principal estaba presente en 0 %. Los modelos deficientes resultan de demasiadas muestras que muestran rendimientos muy bajos de Glc o Xyl. Establecer un límite inferior determina a su vez un límite superior. Es decir, en un experimento de seis componentes, si el límite inferior para cada componente individual se establece en 5 %, entonces el límite superior de cada componente individual será del 75 %. Los límites inferiores para todas las demás enzimas consideradas «accesorias» se establecen en 0 %. Las designaciones «principal» y «accesoria» son algo arbitrarias y variarán según el sustrato, pero en nuestros estudios las enzimas principales para la liberación de Glc a partir del bagazo de maíz comprenden las siguientes enzimas de T. reesei: CBH1 (también conocida como Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glucosidasa), EX3 (endo-β1,4-xilanasa, GH10) y BX (β-xilosidasa).
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GENPLAT (Plataforma GLBRC la enzima) es una plataforma automatizada para el descubrimiento y optimización de los cócteles de enzimas para la degradación de la biomasa. Se puede adaptar a las materias primas y varias mezclas de enzimas que contienen múltiples componentes.

GENPLAT: una plataforma automatizada para el descubrimiento de enzimas de la biomasa y la optimización Cocktail

El elevado coste de las enzimas para la desconstrucción de la biomasa es un impedimento importante para la conversión económica de materias primas lignocelulósicas en líquidos...

En este procedimiento, se optimizan mezclas enzimáticas para convertir la biomasa lignocelulósica en azúcares libres mediante un sistema automatizado conocido como plataforma enzimática A-G-L-B-R-C o gen plat. Primero, se diseña un modelo de mezcla en el que se combinan de cuatro a 18 enzimas distintas en hasta 96 proporciones diferentes utilizando un software de diseño de experimentos. Luego, la biomasa y las enzimas se pipetean en placas de 96 pocillos profundos mediante un sistema robótico de manipulación de líquidos.Las placas se sellan y se incuban durante 48 horas a 50 grados Celsius. Tras la incubación, se toman muestras de los pocillos mediante un sistema automatizado de manipulación de líquidos, y se miden la glucosa y xilosa libres utilizando un ensayo acoplado a enzimas con detección colorimétrica. Luego, se utiliza un software de diseño de experimentos para determinar qué combinaciones de enzimas producen la máxima cantidad de glucosa libre y xilosa.El objetivo general de este procedimiento es probar simultáneamente la eficiencia de diversas mezclas enzimáticas para convertir materiales de biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables para etanol, con el fin último de reducir los costos de producción de biocombustibles. Aunque utilizamos este método principalmente para analizar mezclas enzimáticas sobre bagazo de maíz pretatado con álcali, es adaptable a cualquier tipo de pretratamiento y cualquier materia prima, como álamo tratado con ácido, pasto switch y granos secos de destilería. Esta técnica puede emplearse para descubrir enzimas novedosas que sean importantes para la descomposición de la biomasa y para encontrar ejemplos mejores de enzimas ya conocidas.Aunque las enzimas utilizadas para los geles de gem pueden provenir de diversas fuentes, las enzimas empleadas en esta demostración se producen mediante la expresión de PPIC o PPIC alfa en células de Pia Pastis gro en lotes de 300 mililitros y matraces de 500 mililitros con placas deflectoras durante tres días. Luego, durante los siguientes cuatro días, realice la inducción con metanol cada 24 horas tras el último día de inducción con metanol. Vierta las muestras en un sistema de filtración de flujo tangencial con una membrana de corte de 10 kilodalton para concentrar y desalinizar el cultivo.Los filtrados realizan entonces un intercambio de tampón con cinco volúmenes de acetato de sodio 25 milimolar, pH 5, y se concentra la muestra para reducir el volumen a entre 10 y 25 mililitros. Mida la proteína mediante el método BCA utilizando BSA como estándar; la concentración final de las soluciones stock de enzima debe estar entre 0,5 y 10 miligramos por mililitro. Almacene las enzimas en alícuotas pequeñas en glicerol al 20 % a −80 grados Celsius para crear diseños de red simplex.Comience abriendo el programa Design Expert en una computadora. Ingrese el número de enzimas que se probarán y las proporciones superiores e inferiores. Por ejemplo, una proporción inferior del 5 % para enzimas centrales; luego indique si el diseño experimental es cuadrático o cúbico.Quadratic es necesario para mezclas con más de ocho componentes en Excel. Calcule la cantidad en microgramos de cada enzima que se agregará para cargar un total de 15 miligramos por gramo de glucano por muestra. Luego, calcule la cantidad de cada enzima en microlitros para agregar a cada reacción según las concentraciones de proteína de los stocks.Genere hojas de cálculo adicionales de Excel, especificando los pocillos fuente del LabWare, el LabWare de destino, los pocillos de destino y los volúmenes de transferencia para la dispensación de agua y enzimas según el diseño experimental. Finalmente, importe la hoja de cálculo al software Biome FX utilizando la función de transferencia desde archivo para generar una suspensión de biomasa de estufa de maíz pretratada. Vierta la biomasa seca en un molino Wiley y muélela hasta que pase por un tamiz de 0,5 milímetros.Recolecte la biomasa molida en un vaso de precipitados. El contenido de glucano se mide mediante métodos estándar, como se describe en el análisis composicional completo de partículas de paredes celulares vegetales de JoVE, parte uno lignina. Una vez determinado el contenido de glucano, mezcle la biomasa con tampón de citrato de sodio para que la concentración final de glucano sea del 0,5 %. Encienda el depósito del agitador y vierta la suspensión de biomasa en él.Ahora, aunque las enzimas estén sobre hielo, la cantidad de cada enzima necesaria depende del tamaño del experimento para dispensar la biomasa. Las suspensiones generan puntas anchas cortando con una cuchilla el último 0,5 centímetro del extremo. Ocho puntas de pipeta de 100 microlitros.Los puntas recortadas del SPAN eight se pueden reutilizar. Una vez recortadas, coloque las puntas en una caja de pipetas para que puedan ser recogidas automáticamente por el SPAN eight. Este instrumento está equipado con un módulo SPAN eight con función de punta desechable que puede dispensar soluciones individuales en pozos individuales y un módulo fijo AP 96, que puede transferir 96 soluciones idénticas a la vez a una placa de 96 pozos. A continuación, organice la plataforma del sistema de manipulación de líquidos.Esto consta de una placa de reacción de pozo profundo de 96 pocillos, una tapa de caja de puntas que contiene agua, un portaenzimas que contiene las enzimas en tubos eppendorf de 1,5 mililitros y varias cajas de puntas llenas en las posiciones del deck según lo programado en la configuración del instrumento. Una vez que el deck esté listo, verifique el programa en busca de errores. Inicie la Beckman fx.El brazo SPAN de ocho canales pipeteará primero 200 microlitros de la suspensión de biomasa en cada pocillo de las placas de reacción de 96 pocillos con fondo profundo. A continuación, el módulo SPAN de ocho canales dispensará enzimas en cada uno de los pocillos, según la hoja de cálculo importada al software Biome FX. Una vez completada la pipetación, retire la placa de 96 pocillos con fondo profundo de la plataforma.Selle la placa con una membrana adhesiva o tapa. A continuación, invierta la placa y golpéela una o dos veces para romper la tensión superficial. Coloque la placa en el horno de hibridación durante 48 horas tras la centrifugación de incubación.Coloque la placa de 96 pocillos con bordes inclinados durante tres minutos a 1.500 veces G en una centrífuga con rotor de cabezal oscilante mientras la placa gira. Programe el Beckman FX para utilizar el cabezal AP 96 y pipetee 100 microlitros de cada pocillo hacia una placa de 96 pocillos convencional. Luego de la centrifugación, coloque la placa en el instrumento e inicie la pipetación.Cuando la pipetación haya terminado, incube las placas a 100 grados Celsius durante 10 minutos en un calentador de placas para inactivar las enzimas; luego centrifugue la placa a 1.500 ×g durante 30 segundos. Para las mediciones de GLC, primero agregue 192 microlitros del reactivo de glucosa oxidasa peroxidasa, utilizando un programa escrito para el AP 96 pod del Beckman fx.Luego, utilice el pod AP 96 para transferir 12 microlitros de la muestra a una placa estándar de 96 pocillos. Incube las placas a 50 grados Celsius durante 20 minutos y mida la absorbancia a 510 nanómetros en un lector de microplacas. Para mediciones de xlo, agregue los reactivos del ensayo según las instrucciones del kit.Luego, utilice el pod AP 96 para transferir cuatro microlitros de cada pocillo a placas de 384 pocillos y mida la absorbancia a 340 nanómetros. Realice el análisis de datos según se describe en el documento adjunto utilizando el software Design Expert. Se compararon cinco sustratos y tres pretratamientos bajo condiciones similares de molienda de tamaño de partícula de 0,5 milímetros, carga de enzima de 15 miligramos por gramo de glucano y condiciones de hidrólisis.48 horas a 50 grados Celsius, como se puede observar aquí. Existen diferencias notables entre materias primas y entre pretratamientos. Es evidente que el cóctel enzimático acelera 1000 solo, no puede manejar toda la variabilidad observada en los pretratamientos y las materias primas.Este experimento compara una estufa de maíz pretratada con A FEX, denominada A-F-E-X-C-S, peróxido alcalino, estufa de maíz pretratada, A-H-P-C-S y granos secos de destilería pretratados con A FEX, A-F-E-X-D-D-G. Los números en la parte superior de las barras indican los rendimientos de glucosa como porcentaje de la glucosa total en la muestra de biomasa. Téngase en cuenta que la composición de los cócteles difiere significativamente según el pretratamiento y el sustrato de biomasa.Aunque el uso principal de gem plat es crear mezclas sintéticas de enzimas puras, también puede utilizarse para producir mezclas optimizadas de preparaciones enzimáticas comerciales. El panel A muestra un diagrama de barras de cuatro enzimas optimizadas para la liberación de glucosa a partir de A-F-E-X-D-D-G; el panel B muestra los rendimientos resultantes al usar esta mezcla optimizada en comparación con otras tres preparaciones enzimáticas. Acabamos de demostrar el uso de gen plat para ayudar en la degradación de biomasa empleando enzimas puras individuales.Cada enzima tiene una actividad catalítica específica que contribuye a la degradación completa de las paredes celulares vegetales en azúcares individuales. Sin embargo, no es necesario conocer la actividad catalítica precisa de una enzima para evaluar su importancia en la descomposición de la biomasa. Usando Gen pla, saber qué enzimas son importantes y en qué proporciones es fundamental para orientar la bioprospección.Para nuevos enzimas en la ingeniería de proteínas y para el desarrollo de organismos en procesos biológicos consolidados, a veces los resultados son sorprendentes. Por ejemplo, descubrimos que para la liberación de glucosa a partir de Conover, una combinación de dos Xin ais no relacionados es superior a cualquiera de los Xin por separado. También encontramos que la mejor manasa es importante para la liberación de glucosa a partir de granos secos de destilería.Aunque este material tenga un bajo mejorador y contenido, este método allanará el camino para que los investigadores desarrollen cócteles enzimáticos aún mejores para una variedad de condiciones. Ni siquiera es necesario saber qué hace enzimáticamente una proteína particular para probar su contribución a la descomposición de la lignocelulosa.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas

Un método simple, rápido para determinar el potencial de la sacarificación de un gran número de muestras de biomasa vegetal se describe. La plataforma automatizada para este análisis consiste en la preparación de la biomasa vegetal para su análisis en placas de 96 pozos y la realización posterior de pretratamiento, hidrólisis y la cuantificación de los azúcares liberados.

De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

En este video, demostramos un ensayo de alto rendimiento para el cribado de enzimas activas en carbohidratos utilizando sustratos de hidrogel de polímeros cromogénicos insolubles. La enzima degrada estos sustratos en un producto coloreado soluble que se puede cuantificar midiendo la intensidad del color del producto.

Ensayo de cribado enzimático basado en hidrogel de polímero cromogénico: un método de alto rendimiento para cribar las enzimas activas en carbohidratos utilizando sustratos sintéticos

Este video muestra un ensayo para detectar enzimas efectivas en la degradación de polisacáridos complejos en biomasa vegetal utilizando biomasa cromogénica insoluble o ICB. Las enzimas hidrolizan ICB para liberar oligosacáridos solubles ligados a colorantes, y la actividad enzimática se evalúa mediante un análisis colorimétrico del producto de la reacción.

Cribado de enzimas basadas en biomasa cromogénica insoluble: un ensayo para evaluar la actividad de degradación de las enzimas degradadoras de biomasa vegetal

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

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