Name: Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a generar líneas celulares linfoblastoides transformadas por el virus Epstein-Barr a partir de células B humanas. Este método permite predecir el éxito de la transformación en tres a cuatro días mediante citometría de flujo.

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Esta investigación fue financiada por el NIH K08 AI062732, K12 HD001401, y 1UL1RR024139-02 y una beca de investigación de Salud Infantil de la Charles H. Hood Foundation para SB-M. y por la Fundación para la Investigación de la Universidad Estatal de Nueva York en Stony Brook.

1. EBV acciones de preparación <ol><li> Subcultura que crece exponencialmente B95-8 células (ATCC # CRL 1612, 13) a 3 x 10 5 células / ml en un frasco de 75 cm 2 de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril. Las células se cultivan en completo RPMI 1640 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), penicilina / estreptomicina en 100U/ml y 100 ug / ml, respectivamente, y anfotericina B de 0,5 mg / ml a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2. </li><li> Cuarenta y ocho horas más tarde, suspender las células en fresco RPMI 1640 completo en 1 x 10 6 células / ml. Para inducir la producción de virus, estimular las células con 20ng/ml tetradecanoyl acetato de forbol (TPA) durante 1 hora en un estándar de incubadora de CO 2. Lavar las células tres veces con RPMI 1640 para eliminar la TPA. </li><li> Resuspender las células en el volumen original de RPMI 1640 completo (de 1.2) y colocar el matraz en incubadora de CO 2 durante 96 horas. Este método se ha demostrado que producen altos títulos de par virus infecciosotículos 6. </li><li> Centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4 ° C para separar EBV que contienen sobrenadante de cultivo de células. Sobrenadante del filtro a través de un filtro de 0,45 micrones, alícuota y almacenar a -70 ° C durante más de un año. Una alternativa es obtener el sobrenadante de B95-8 que contiene las células EBV de la ATCC (VR-1492) y el uso a la dilución recomendada por la ATCC. </li></ol> 2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) <ol><li> Draw 10 ml de sangre de donantes en una jeringa heparinizada o un tubo de sangre heparinizada. Diluir la sangre con 20 ml de PBS a temperatura ambiente en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Subyace la sangre diluida con 15 ml de medio de separación Ficoll Hypaque linfocitos. Centrifugar a 225 x g sin freno a temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Quitar la capa leucocitaria y la transferencia a un nuevo tubo de 50 ml cónico. Suben el volumen hasta 50 ml con PBS y se giran a 600 xg a temperatura ambiente durante 10 minutos. </li><li> Pour el sobrenadante. Lavar las células por la resuspensión de sedimento en 50 ml de PBS y centrifugado a 600 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lavar dos veces más de una manera similar. </li><li> Resuspender las células lavadas en 1 ml de RPMI completo. Use 5 l de las células para preparar una dilución 1 / 10 en azul tripán. Contador de células vivas utilizando un hemocitómetro. </li><li> Ajuste el volumen utilizando RPMI completo en un 25 cm 2 frasco de cultivo de tejido para obtener una concentración celular de 2 x 10 6 / ml. </li></ol> 3. La infección con EBV <ol><li> Añadir FK506 (AG Científica) para la suspensión celular de 2,6 a una concentración final de 20 nM. Lugar botella de CO 2 incubadora a 37 ° C durante una hora. </li><li> Rápido deshielo de una parte alícuota de este virus. Quitar frasco de la incubadora y añadir EBV a las células a dilución 1 / 10. Por lo general, esta dilución proporciona una MOI de 50 a 100. Remolino matraz para mezclar bien y colocarlo en posición vertical en incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Nota ªen el Paso 4, realizada para predecir el resultado exitoso, es un paso opcional. Paso 4 Si va a realizar, será necesario para la incubación de un frasco adicional de la ONU infectados PBMC a 2 x 10 6 células / ml como control. 4. La identificación de la población la proliferación de las células (paso opcional) <ol><li> Preparar tampón FACS: PBS + 5% de SFB. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Hacer la siguiente mezcla de anticuerpos en un volumen de 50 l cada uno para la tinción de las células en el Paso 4.6. Diluciones de anticuerpos deben hacerse en tampón FACS contiene 1mg/ml de IgG de ratón (Sigma) para inhibir la unión no específica de los anticuerpos. <ol class="lroman"><li> solo teñidas con PE conjugado de anticuerpos anti-CD23 (1 / 50 de dilución) </li><li> solo se tiñeron con FITC conjugado anti-CD58 de anticuerpos (1 / 50 de dilución) </li><li> solo teñidas con PE-Cy5 conjugado de anticuerpos anti-CD19 (1 / 50 de dilución) </li><li> triple tinción para CD23, CD58, CD19 y (1 / 50 de cada dilución) </li><li> solo se tiñeron con el control de isotipo conjugado con PEanticuerpos coincide con CD23-PE (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD23) </li><li> solo se tiñeron con anticuerpo conjugado FITC isotipo de control coincide con CD58-FITC (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD58) </li><li> solo teñidas con PE-Cy5 anticuerpos conjugados isotipo de control coincide con CD19-PE-Cy5 (en la misma concentración de anticuerpos anti-CD19) </li><li> triple-teñidas con los tres anticuerpos isotipo de control. </li></ol> Almacenar temporalmente la mezcla a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> En el tercer día posterior a la exposición a este virus, cuidado frasco agitar para obtener una suspensión celular más uniforme. Quitar 2 ml del frasco en un tubo Eppendorf de 2 ml. Girar el tubo en una microcentrífuga a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en tampón FACS a 5 x 10 6 a 1 x 10 7 células / ml. </li><li> Extraiga ocho alícuotas 50μl en tubos Eppendorf individuales o una placa de 96 pocillos de fondo en V. Tubos de centrifugado o la placa a 1500 x gdurante 3 minutos. </li><li> Descartar el sobrenadante y los tubos de vórtice / placa. Resuspender las células en cada tubo / y en 50 l de tampón FACS que contienen las diluciones adecuadas de anticuerpos preparados en 4,2. </li><li> Incubar los tubos / placa de hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos, retire el sobrenadante y añadir 200 l de tampón FACS. Centrifugar las células de nuevo y eliminar el sobrenadante para completar el lavado. Repita dos lavados más. </li><li> Resuspender las células en 200 l FACS buffer y la adquisición de datos utilizando un citómetro de flujo, la adquisición de 20.000 eventos / tubo. </li><li> Analizar datos usando WinMDI (freeware para FACS análisis de datos en el PC). Puerta de células vivas mediante perfiles de dispersión frontal y lateral. Luego, las células viven puerta para la expresión de CD19 + (marcador de células B), después de comparar con las células teñidas con el anticuerpo control de isotipo coincide con anticuerpos anti-CD19. Parcela B CD19 + en vivo las células con la intensidad de fluorescencia de CD23 en el eje X y la intensidad de fluorescencia para CD58 en el eje. Determinar CD23 + y CD58 + en las células mediante la comparación con el EBV-expuestos células teñidas con anticuerpos isotipo emparejado control. La presencia de CD23 + CD58 hi células EBV-expuestos de cultivo (Fig. 2C) predice consecuencia el éxito de las células infectadas con EBV de crecimiento transformado. Por el contrario, CD23 hi células CD58 + no surgen cuando las células no están expuestos a este virus (Figura 2) o expuestos a una cepa no inmortalizando de EBV (Figura 2B). CD23 hi células CD58 + se han demostrado experimentalmente que someterse a la proliferación y, posteriormente, establecer LCL (14). </li></ol> 5. La expansión y la criopreservación de LCL <ol><li> Visualización de las células al microscopio óptico: Por una semana después de la infección por VEB, grupos de células son visibles al microscopio óptico. La Figura 3 muestra un ejemplo de los primeros grupos microscópicos (Figura 3B) en un matraz. </li><li> Con el tiempo, los grupos microscópicos se hacen más grandes grupos de tal manera que sean visiblesmacroscópicamente en el matraz. Figura 3C muestra grandes grupos de células en LCL establecido por microscopía de luz. </li><li> La alimentación de las células: el doble de volumen de medio de cultivo en el frasco de cultivo en el día 12. Posteriormente, ampliar la cultura mediante el aumento de su volumen de 2.3 veces con RPMI completo. </li><li> Periodicidad de las células de alimentación debe ser determinado con base en la tasa de crecimiento de las células. Cuando el medio de cultivo se vuelve amarilla, por lo general el momento de sustituir los medios de comunicación que el anterior. Normalmente, esto ocurre una vez por semana. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden necesitar ser alimentado con más o con menos frecuencia. Ampliar la cultura de 75 a 100 ml durante las próximas semanas. </li><li> Criopreservación: Al congelar las células de las células se centrifuga a 600 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de células y resuspender el pellet en medio de un frío que contiene 90% de SFB y el 10% dimetilsulfóxido a 1 x 10 7 células / ml. Colocar el tubo en nitrógeno líquido. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Éxito está en relación con la presencia de CD23 + CD58 hi células. Aproximadamente 2.3% de células vivas en el día 3-4 después de la exposición a este virus debe tener este perfil (Fig. 2C). Otros sub-poblaciones de CD23 +, CD23 -, CD58 +, CD58 y - las células observadas después de la exposición a este virus muestran la proliferación de un mínimo de 14. Un de las células infectadas (Figura 2A) y las células expuestas a este virus de HH514-16 células (Figura 2B), que alberga una cepa no inmortalizando de EBV, no demuestran CD23 + CD58 hi células. También puede visualizar las células al microscopio óptico para controlar éxito: Como se mencionó anteriormente, dentro de una semana después de la infección por VEB, pequeños grupos de células en el matraz son visibles al microscopio óptico (Figura 3B). A medida que avanza el tiempo y las células se convierten en LCL, los grupos microscópicos se hacen más grandes (Figura 3C) de tal manera que son visibles macroscópicamente grupos en el matraz. Figura 1. Flujo de trabajo para la generación y la criopreservación de líneas de células linfoblásticas. Sangre periférica, se centrifuga a través de un gradiente de Ficoll. PBMC presente en la capa leucocitaria de un gradiente establecido se exponen a FK506 seguido por la adición de este virus. EBV-expusieron células se cultivan a 37 ° C en presencia de 5% de CO 2 para establecer y posteriormente ampliar LCL para la criopreservación. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> Figura 2. Identificación de una subpoblación de células B espera de someterse a la proliferación después de la exposición a este virus. Un infectados PBMC (A) o PBMC expuestos a este virus derivados de HH514-16 células (B) o de células B95-8 (C) en presencia de FK506 fueron cosechadas en el día 3. Las células se tiñeron con fluorocromo y conjugado con anticuerpos dirigidos contra CD19, CD23, CD58 y. Después de gating en células vivass, sin infección (A) y EBV-expuestos (B y C) las células B CD19 + fueron examinados para la expresión de CD23 y CD58. Una subpoblación de células B que expresan CD58 y los niveles altos de CD23 (CD23 hi CD58 +), observado sólo en las células expuestas a la transformación competente EBV (derivado de la B95-8 células), se representa. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> Figura 3. Visualización de grupos de células en las células infectadas por EBV. PBMC fueron tratados con FK506 e infectadas con este virus. Un infectadas (A) y EBV-expuestos (B), las células fueron examinados una semana después de la infección por microscopía de contraste de fase (10 aumentos). Cinco semanas de la antigua línea de células linfoblásticas se muestra en la C.

<ol><li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li>
<li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines%3A+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li>
<li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+under+influence%3A+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li>
<li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li>
<li>Oh, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li>
<li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li>
<li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li>
<li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li>
<li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li>
<li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+prolonged+experience+with+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li>
<li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus%3A+Transformation%2C+cytopathic+changes%2C+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li>
<li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método descrito en este documento genera LCL de donantes de sangre periférica, con la inmortalización rápido y los tiempos de criopreservación. Mediante el uso de FK506, un inmunosupresor de células T, y altos títulos de virus infecciosos que son capaces de promover la proliferación de las células B infectadas con EBV en las células mononucleares de sangre periférica. Estas intervenciones que el método descrito más eficiente, resultando en la rápida expansión de las células para los experimentos posteriores. Tradicionalmente, la transformación del crecimiento ha sido supervisado por la visualización de grupos de células por microscopía de luz alrededor de una semana después de la exposición a este virus 6, 15. Sin embargo, la agrupación de células no es un indicador específico de la transformación del crecimiento mediada por VEB. Hemos demostrado anteriormente identificación consistente de la población de células proliferantes mediante citometría de flujo 14, proporcionando un método preciso y específico para determinar el resultado exitoso tan pronto como tres días de popaer la exposición de las células B a este virus.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Anfotericina B </td><td> Fisher Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal, inactivado por calor </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque medios de linfocitos separación </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Científico </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG de suero de ratón </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD23 humano conjugado con PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo conjugado con PE IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD58 humano conjugado con FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo IgG1 conjugados con FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD19 humano conjugado con PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Ratón isotipo conjugado con PE-Cy5 IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Medio RPMI 1640 </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl forbol acetato (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS buffer (fosfato 1X solución salina tamponada con + 5% de suero fetal bovino) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de epstein-barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Infección de las células B con el virus Epstein-Barr (EBV) conduce a la proliferación y posterior inmortalización, lo que resulta en el establecimiento de líneas de células linfoblásticas (LCL) in vitro. Desde LCL son latentes infectadas con este virus, que proporcionan un sistema modelo para investigar la latencia y el virus EBV impulsado por la proliferación de células B y la tumorigénesis 1. LCL se han utilizado para presentar antígenos en una variedad de ensayos inmunológicos 2, 3. Además, LCL se puede utilizar para generar anticuerpos monoclonales humanos 4, 5 y proporcionan una fuente potencialmente ilimitada cuando el acceso a materiales biológicos primaria es limitada 6, 7. Una variedad de métodos han sido descritos para generar LCL. Los métodos anteriores han incluido el uso de mitógenos como fitohemaglutinina, lipopolisacárido 8 y 9 mitógeno de hierba carmín para incrementar la eficiencia de VEB mediada por la inmortalización. Más recientemente, otros han utilizado immunosuppressive agentes, como la ciclosporina A para inhibir las células T mediada por el asesinato de las células B infectadas por 7, 10-12. El largo periodo de tiempo de la infección por EBV para el establecimiento de líneas celulares de las unidades de la necesidad de métodos más rápidos y más confiables para el VEB impulsada por la transformación B el crecimiento celular. Usando una combinación de alta EBV título y un agente inmunosupresor, que son capaces de infectar constantemente, transformar y generar LCL de las células B en sangre periférica. Este método utiliza una pequeña cantidad de células mononucleares de sangre periférica que se infectan en los cúmulos de células in vitro puede ser demostrada. La presencia de CD23 con este virus en la presencia de FK506, una célula T inmunosupresores. Tradicionalmente, la consecuencia de la proliferación de células B es controlada por la visualización de grupos microscópicos de células alrededor de una semana después de la infección con este virus. Los grupos de LCL se puede ver a simple vista después de varias semanas. Se describe un ensayo para determinar pronto si VEB mediada por grecimiento de transformación tiene éxito incluso antes de que grupos microscópicos de células se puede demostrar. La presencia de CD23 hi células CD58 + observó a tres días después de la infección indica un resultado exitoso.

Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

La infección de las células B con el virus de Epstein-Barr (EBV) provoca la proliferación y posterior inmortalización, lo que resulta en el establecimiento de líneas linfoblastoides...

El objetivo general de este procedimiento es generar LCL, líneas celulares de linfoblastos transformados por el virus de Epstein-Barr, a partir de linfocitos B humanos. Esto se logra primero aislado células mononucleares de sangre periférica de sangre humana.A continuación, las células se infectan con el virus de Epstein-Barr eps en presencia de FK 5 0 6 y agentes inmunosupresores; tres o cuatro días después de la infección con el virus de Epstein-Barr EP, surge una subpoblación de células marcada como CD 23, CD 58 positiva alta, y que se predice que experimentará proliferación CD 23 alta. Las células CD 58 positivas se pueden enumerar mediante citometría de flujo como un predictor de resultado exitoso. Las células proliferantes pueden identificarse adicionalmente, micro y macroscópicamente, por los grupos de linfoblastos que forman líneas celulares en cultivos celulares transformados con éxito.El paso final consiste en expandir líneas celulares de linfoblastos para su criopreservación. En mi laboratorio, generamos líneas celulares de linfoblastos o LCLs para comprender las interacciones entre el huésped y el virus de Epstein-Barr. Las líneas celulares de linfoblastos también son de amplio interés general para la comunidad científica, particularmente para virólogos, inmunólogos y biólogos del cáncer.Como investigadora postdoctoral O en un laboratorio du Macintosh, demostraré el procedimiento para generar líneas celulares de linfoblastos. Después de extraer 10 mililitros de sangre de un donante, añada la sangre heparinizada a un tubo cónico de 50 mililitros y luego dilúyala uno a dos. Añadiendo 20 mililitros de PBS a temperatura ambiente al tubo, subyaga la sangre diluida con 15 mililitros de medio de separación de linfocitos FICO HIA, y luego centrifugue la sangre a 225 × g sin freno a temperatura ambiente durante 30 minutos para establecer un gradiente.A continuación, retire la capa de buffy coat y transfiera esta fracción a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Ajuste el volumen a 50 mililitros con PBS y luego centrifugue las células a 600 veces G durante 10 minutos para obtener el pellet. Deseche el sobrenadante, re suspenda el pellet en 50 mililitros de PBS y lave las células dos veces más bajo las mismas condiciones.Ahora, re suspenda las células en un mililitro de RPM completo. Utilizo cinco microlitros de células para preparar una dilución de uno a 10 en azul de tripano y contar las células viables mediante un hemocitómetro, luego uso RPMI completo para ajustar el volumen y obtener una concentración celular de dos veces. Centre las seis células por mililitro y transfiera las células a un frasco de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados.Para preparar las células para la infección con el virus de Epstein-Barr, añada FK 5 0 6 al frasco de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 20 M. A continuación, coloque el frasco en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora. Cuando las células hayan terminado casi por completo la incubación, descongele rápidamente una alícuota del virus de Epstein-Barr, obtenida de células B 95 8. Luego, retire el frasco del incubador y añada el virus de Epstein-Barr a las células en una dilución de uno a 10. Agite suavemente el frasco para mezclar el virus de Epstein-Barr en la solución y, a continuación, coloque el frasco en posición vertical dentro del incubador con la tapa puesta, pero ligeramente floja si se utiliza un frasco no ventilado, durante dos a tres semanas antes de la expansión del cultivo para la criopreservación.Una semana después de los eps, la infección por el virus de Epstein Barr, se observan agrupaciones de células mediante microscopía óptica, como se ve en esta figura representativa de agrupaciones microscópicas tempranas. Con el tiempo, las agrupaciones microscópicas aumentan de tamaño, de modo que los agregados son visibles macroscópicamente en el frasco, como se muestra en esta figura donde pueden observarse agrupaciones más grandes de LCL. Para alimentar las células, duplique el volumen del medio de soporte en el frasco de cultivo el día 12. Cuando el medio de cultivo se torna amarillo, generalmente una vez por semana, suele ser el momento adecuado para alimentar las células y expandirlas, aumentando el volumen del cultivo entre dos y tres veces.Utilizando RPMI completo, expanda el cultivo a 70-100 mililitros en un matraz de 75 centímetros cuadrados durante las próximas semanas para generar células para criopreservación. Un resultado exitoso se predice por la presencia de CD23 y un alto porcentaje de células CD58 positivas, como se observa en este gráfico de dispersión. Aproximadamente del 2 al 3 % de las células viables entre el día tres y cuatro después de la exposición al virus de Epstein-Barr presentan este perfil. Otras subpoblaciones de células CD23 positivas, CD23 negativas, CD58 positivas y CD58 negativas observadas tras la exposición al virus de Epstein-Barr muestran una proliferación mínima, y las células no infectadas o infectadas con una cepa no inmortalizante del virus de Epstein-Barr no muestran expresión alta de CD23.Células positivas para CD58. Las células también pueden visualizarse mediante microscopía óptica. Como se mencionó, dentro de una semana de la infección por el virus de Epstein-Barr, se observan pequeños grupos de células en el frasco mediante microscopía óptica.A medida que avanza el tiempo y las células se desarrollan en LCL, los agregados microscópicos aumentan de tamaño, de modo que los grumos son visibles macroscópicamente en el frasco. Muy bien. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células mononucleares de la sangre periférica a partir de sangre humana y cómo generar líneas celulares de linfoblastos transformados por el virus de Epstein-Barr a partir de linfocitos B humanos, aunque la generación de líneas celulares de linfoblastos ya ha sido descrita por otros laboratorios.La ventaja de nuestro protocolo es que proporciona a los investigadores un método para predecir un resultado exitoso tan pronto como tres a cuatro días después de la infección de las células B con el virus de Epstein-Barr.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

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Un método de lisis de glóbulos rojos simple para el establecimiento de B-LCLs se desarrolló con una alta eficiencia de la inmortalización, lo que requiere una pequeña cantidad de sangre y el ahorro de tiempo desde el inicio de la crioconservación.

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Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.

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Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

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Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones

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Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

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