Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

El objetivo general de este procedimiento es generar LCL, líneas celulares de linfoblastos transformados por el virus de Epstein-Barr, a partir de linfocitos B humanos. Esto se logra primero aislado células mononucleares de sangre periférica de sangre humana.

A continuación, las células se infectan con el virus de Epstein-Barr eps en presencia de FK 5 0 6 y agentes inmunosupresores; tres o cuatro días después de la infección con el virus de Epstein-Barr EP, surge una subpoblación de células marcada como CD 23, CD 58 positiva alta, y que se predice que experimentará proliferación CD 23 alta. Las células CD 58 positivas se pueden enumerar mediante citometría de flujo como un predictor de resultado exitoso. Las células proliferantes pueden identificarse adicionalmente, micro y macroscópicamente, por los grupos de linfoblastos que forman líneas celulares en cultivos celulares transformados con éxito.

El paso final consiste en expandir líneas celulares de linfoblastos para su criopreservación. En mi laboratorio, generamos líneas celulares de linfoblastos o LCLs para comprender las interacciones entre el huésped y el virus de Epstein-Barr. Las líneas celulares de linfoblastos también son de amplio interés general para la comunidad científica, particularmente para virólogos, inmunólogos y biólogos del cáncer.

Como investigadora postdoctoral O en un laboratorio du Macintosh, demostraré el procedimiento para generar líneas celulares de linfoblastos. Después de extraer 10 mililitros de sangre de un donante, añada la sangre heparinizada a un tubo cónico de 50 mililitros y luego dilúyala uno a dos. Añadiendo 20 mililitros de PBS a temperatura ambiente al tubo, subyaga la sangre diluida con 15 mililitros de medio de separación de linfocitos FICO HIA, y luego centrifugue la sangre a 225 × g sin freno a temperatura ambiente durante 30 minutos para establecer un gradiente.

A continuación, retire la capa de buffy coat y transfiera esta fracción a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Ajuste el volumen a 50 mililitros con PBS y luego centrifugue las células a 600 veces G durante 10 minutos para obtener el pellet. Deseche el sobrenadante, re suspenda el pellet en 50 mililitros de PBS y lave las células dos veces más bajo las mismas condiciones.

Ahora, re suspenda las células en un mililitro de RPM completo. Utilizo cinco microlitros de células para preparar una dilución de uno a 10 en azul de tripano y contar las células viables mediante un hemocitómetro, luego uso RPMI completo para ajustar el volumen y obtener una concentración celular de dos veces. Centre las seis células por mililitro y transfiera las células a un frasco de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados.

Para preparar las células para la infección con el virus de Epstein-Barr, añada FK 5 0 6 al frasco de cultivo celular hasta alcanzar una concentración final de 20 M. A continuación, coloque el frasco en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora. Cuando las células hayan terminado casi por completo la incubación, descongele rápidamente una alícuota del virus de Epstein-Barr, obtenida de células B 95 8. Luego, retire el frasco del incubador y añada el virus de Epstein-Barr a las células en una dilución de uno a 10. Agite suavemente el frasco para mezclar el virus de Epstein-Barr en la solución y, a continuación, coloque el frasco en posición vertical dentro del incubador con la tapa puesta, pero ligeramente floja si se utiliza un frasco no ventilado, durante dos a tres semanas antes de la expansión del cultivo para la criopreservación.

Una semana después de los eps, la infección por el virus de Epstein Barr, se observan agrupaciones de células mediante microscopía óptica, como se ve en esta figura representativa de agrupaciones microscópicas tempranas. Con el tiempo, las agrupaciones microscópicas aumentan de tamaño, de modo que los agregados son visibles macroscópicamente en el frasco, como se muestra en esta figura donde pueden observarse agrupaciones más grandes de LCL. Para alimentar las células, duplique el volumen del medio de soporte en el frasco de cultivo el día 12. Cuando el medio de cultivo se torna amarillo, generalmente una vez por semana, suele ser el momento adecuado para alimentar las células y expandirlas, aumentando el volumen del cultivo entre dos y tres veces.

Utilizando RPMI completo, expanda el cultivo a 70-100 mililitros en un matraz de 75 centímetros cuadrados durante las próximas semanas para generar células para criopreservación. Un resultado exitoso se predice por la presencia de CD23 y un alto porcentaje de células CD58 positivas, como se observa en este gráfico de dispersión. Aproximadamente del 2 al 3 % de las células viables entre el día tres y cuatro después de la exposición al virus de Epstein-Barr presentan este perfil. Otras subpoblaciones de células CD23 positivas, CD23 negativas, CD58 positivas y CD58 negativas observadas tras la exposición al virus de Epstein-Barr muestran una proliferación mínima, y las células no infectadas o infectadas con una cepa no inmortalizante del virus de Epstein-Barr no muestran expresión alta de CD23.

Células positivas para CD58. Las células también pueden visualizarse mediante microscopía óptica. Como se mencionó, dentro de una semana de la infección por el virus de Epstein-Barr, se observan pequeños grupos de células en el frasco mediante microscopía óptica.

A medida que avanza el tiempo y las células se desarrollan en LCL, los agregados microscópicos aumentan de tamaño, de modo que los grumos son visibles macroscópicamente en el frasco. Muy bien. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células mononucleares de la sangre periférica a partir de sangre humana y cómo generar líneas celulares de linfoblastos transformados por el virus de Epstein-Barr a partir de linfocitos B humanos, aunque la generación de líneas celulares de linfoblastos ya ha sido descrita por otros laboratorios.

La ventaja de nuestro protocolo es que proporciona a los investigadores un método para predecir un resultado exitoso tan pronto como tres a cuatro días después de la infección de las células B con el virus de Epstein-Barr.