Name: Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Aprende a derivar poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos de ratones neonatos y a establecer co-cultivos mielinizantes con neuronas de ganglios de la raíz dorsal para estudiar biología de la mielina.

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Este proyecto fue financiado por una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá a RKRWO es beneficiario de una beca de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá. El DEG es un receptor de becas post-doctorales de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá y de Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este informe describe un método para aislar OPC murino para la diferenciación de las culturas OL-enriquecido o OL / DRGN co-culturas. Cuando se cultiva solo, el OPC se diferencian en MBP + LB ve, la producción de mielina, como las hojas membranosas. Cuando se añade a DRGN camas neuritas, LB envuelven las neuritas DRGN con MBP + membrana ve. Este modelo beneficia a la investigación de los complejos fundamentos que rigen OL mediada ensheathment axonal. Aunque de gran valor, el establecimiento de estas culturas es un reto técnico. En particular, los aspectos difíciles incluyen la digestión del tejido eficiente / disociación, el mantenimiento de la cultura equilibrada pH del medio, y los cambios DRGN los medios de comunicación. Es importante tener en cuenta que la longitud de la digestión, la cantidad de tejido que se digieren y la cantidad de trituración afecta el resultado de la eficacia y al final de la disociación del tejido. No es inusual para los investigadores con experiencia para obtener bajos rendimientos celulares de disociar los tejidos del sistema nervioso. Además, los OPC murino tienden a ser sensibles a los cambios en el pH del medio de cultivo, especialmente bajo condiciones alcalinas. El mantenimiento de los cultivos en el 8,5% de CO 2 tiene por objeto prevenir esto, ya que los OPC parecen tolerar mejor las condiciones más básicas ligeramente ácido. En cuanto a DRGNs alimentación, cambios en los medios debe realizarse rápidamente ya que no para desecar las neuronas, sin embargo, debe ser suave como para no interrumpir la cama neuritas en desarrollo. Cambios bruscos de medios puede desplazar la cama neuritas del sustrato, y el resultado probable de su disociación completa de la cubreobjetos. El mérito potencial de este modelo de sistema enormemente eclipsa su naturaleza exigente técnicamente. Una de las ventajas de este sistema es el uso de post-natal para la derivación de los ratones de cultivo celular, evitando la necesidad de sacrificar las hembras reproductoras de la cosecha del tejido embrionario. Otra ventaja es la falta de exigencia de los factores de crecimiento (FC) para la expansión de las OPC. Mezcla de culturas gliales ofrecen un entorno que apoye la difusión de las OPC, presumiblemente debido a la presencia de factores tróficos astrocitos derivados. Otros métodos, como la derivación a través de neuroesferas 7,8, se basan en las propiedades mitogénicas de FC como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el derivado de plaquetas factor de crecimiento (PDGF) para la expansión de OPC. Del mismo modo, el uso postnatal (P5-10) de los ratones DRGNs evita la necesidad de complementar los medios de cultivo con el factor de crecimiento nervioso (NGF), un factor neurotrófico necesarios para la supervivencia in vitro de embriones DRGNs 9, 10. Es de interés para evitar el uso de NGF, ya que influye negativamente en la capacidad de myelinating LB cuando se cultivan con DRGNs 4. Evitar el uso de GF-complementado los medios de comunicación también tiene beneficios económicos, ya que estos reactivos ser costoso cuando se utiliza a gran escala. Tal vez el beneficio más importante de este modelo de cultivo es su derivación de ratón sólo los tejidos, proporcionando así las oportunidades para obtener los OPC y DRGNs de la amplia variedad de líneas de ratones transgénicos. Esto permite el estudio de ambos DRGN y / o OPC propiedades específicas que rigen la mielinización. Esto será especialmente importante para dilucidar las interacciones receptor / ligando que regulan OL mediada por la mielinización de los axones. En total, esta técnica es de gran valor en cuanto a investigación en neurociencias, debido a sus aplicaciones a la comprensión de las señales moleculares que subyacen en la mielinización.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del producto </td><td> Empresa </td><td> Número de producto </td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle modificado (DMEM) </td><td> Multicelda </td><td> 319 a 005-CL </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Mínimo de los medios de comunicación esencial (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (penicilina / estreptomicina) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Humanos merosina proteico purificado (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> El factor recombinante de rata neurotrófico ciliar (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-tiroxina </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> Suplemento B27 </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Insulina bovina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triyodo-L-tironina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Selenita de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> La papaína solución </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 y los platos de cultivo de tejidos </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> Frascos de cultivo de tejidos-T25 con la tapa del respiradero </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm platos de cultivo de tejidos </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm de una caja de petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Colagenasa A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 micras filtro (opcional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Proteína básica de mielina (MBP) Anticuerpo </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Mielina glicoproteína asociada (MAG) de anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-cíclico de nucleótido 3&#39;-fosfodiesterasa (CNP) de anticuerpos </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actina pan Ab-5 de anticuerpos </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilamentos-200 (NF) de anticuerpos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Beta-3 de cadena tubulina (Tuj1) de anticuerpos </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 cabra anti-ratón IgG (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 cabra anti-rata (IgG) (H + L) anticuerpo secundario </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Cabra anti-ratón IgG (H + L)-HRP anticuerpo secundario conjugado </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> De cabra anti-IgG de rata (H + L)-HRP anticuerpo secundario conjugado </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Los medios de comunicación Recetas OL-100X Suplemento * <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Cantidad a añadir </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesterona </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescina </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Selenita de sodio </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-triyodo-L-tironina </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Almacene a -80 ° C en 250 alícuotas t &quot;&gt; los medios de comunicación OL <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Cantidad a añadir </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 ml </td></tr><tr><td> OL-100X Suplemento </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> Insulina bovina (de 1 mg / ml) </td><td> 125 l </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 l </td></tr><tr><td> Holo-transferrina (de 33 mg / ml) </td><td> 37,5 l </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 l </td></tr><tr><td> CNTF (de 50 ng / mL de archivo) </td><td> 25 l </td></tr></tbody></table> Mezcla de medios de cultivo gliales (compuesta en DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (0,33% del stock) </td><td> 33 unidades / ml de penicilina y estreptomicina 33 mg / ml </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN los medios de comunicación (hecho en DMEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (1% del stock) </td><td> 100 unidades / ml de penicilina y estreptomicina 100 mg / ml </td></tr></tbody></table> Recetas de la digestión de solución: OPC papaína solución (compuesto en el MEM) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> La papaína solución </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mg / ml </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 mg / ml </td></tr></tbody></table> DRG papaína solución (hecho en HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> 360 mg / ml </td></tr></tbody></table> DRG colagenasa Una solución (hecho en HBSS) <table border="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> Colagenasa A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

derivación de las culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating co-culturas de post-natal tejidos murinos

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identificar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo OL no sólo es fundamental para ampliar nuestro conocimiento de la biología OL, pero también tiene implicaciones para la comprensión de la patogénesis de las enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM). Desarrollo celular es comúnmente estudiadas con modelos de cultivos celulares primarios. Cultivo de células primarias facilita la evaluación de un tipo de célula, proporcionando un ambiente controlado y libre de las variables externas que están presentes en vivo. Mientras que las culturas OL derivadas de ratas han proporcionado una gran cantidad de conocimiento de la biología OL, esfuerzos similares en el establecimiento de cultivos de OL de los ratones se ha encontrado con obstáculos importantes. El desarrollo de métodos de cultivo primario LB murino es imprescindible a fin de tomar ventaja de las líneas de ratones transgénicos disponibles. Múltiples métodos para la extracción de OPC a partir de tejido de roedores se han descrito, desde la derivación neuroesfera, purificación y adhesión diferencial inmunopurificación 1-3. Mientras que muchos métodos ofrecen el éxito de la mayoría, requieren tiempos de amplia cultura y / o equipos costosos / reactivos. Para evitar esto, purificación de OPC a partir de tejido murino con una adaptación del método descrito originalmente por McCarthy y de Vellis 2 es preferido. Este método consiste en separar físicamente los OPC a partir de un cultivo mixto gliales derivadas de cortezas de roedores recién nacidos. El resultado es una población purificada OPC que pueden diferenciarse en una cultura OL-enriquecido. Este enfoque es atractivo debido a su tiempo de cultivo relativamente corto y el requisito innecesario para los factores de crecimiento o anticuerpos immunopanning. Mientras explora los mecanismos de desarrollo OL en una cultura purificada es informativo, no proporciona el entorno más fisiológicamente relevantes para la evaluación de la formación de la vaina de mielina. Co-cultivo LB con las neuronas que ayudan a comprender la las bases moleculares que regulan la OL mediada por la mielinización de los axones. Para muchos OL / co-cultivo de neuronas estudios, las neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRGNs) han demostrado ser el tipo de neurona de la elección. Son ideales para el co-cultivo con LB, debido a su facilidad de extracción, cantidad mínima de células contaminantes, y la formación de neuritas camas densas. Mientras que los estudios con ratas / ratones myelinating xenocultures han sido publicados por 4-6, un método para la obtención de tales OL / DRGN myelinating co-cultivos de post-natal tejido murino no se ha descrito. Aquí se presentan los métodos detallados sobre la manera de producir eficazmente estos cultivos, junto con ejemplos de los resultados esperados. Estos métodos son útiles para abordar cuestiones relacionadas con el desarrollo OL / myelinating función, y son herramientas útiles en el campo de la neurociencia.

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Hola, soy Ryan O'Mara, estudiante de doctorado de la Universidad de Ottawa y del Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa. Este protocolo describirá métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos a partir de ratones, que pueden diferenciarse solas o en combinación con neuronas del ganglio raquídeo dorsal de ratón para producir cultivos mielinizantes. Comencemos con una breve descripción general del procedimiento.Los cultivos de ratones neonatos se disocian y se siembran en frascos T 25. Después de un período de cultivo de nueve días, se forma una monocapa de astrocitos en la base del frasco, sobre la cual proliferan las células precursoras de oligodendrocitos. Luego se obtienen y purifican las células precursoras de oligodendrocitos, que pueden diferenciarse posteriormente en oligodendrocitos maduros en un cultivo enriquecido.Si se desean cultivos co-mielinizantes, las neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones P5 a P10 se cultivan junto con los cultivos mixtos de glía. Durante un período de nueve días, estas neuronas forman un lecho denso de neuritas sobre el cual pueden sembrarse las células precursoras de oligodendrocitos.Esto permite el enrollamiento de las neuritas mediado por oligodendrocitos, lo que resulta en un cultivo frío mielinizante. Primero, cerebros completos de ratones desde P0 hasta P2 se colocan en MEM frío con hielo y se transfieren a un microscopio de disección; utilizando un bisturí, se realiza un corte a través de la capa meníngea de cada corteza de forma longitudinal. A continuación, se separan los meninges del cortex subyacente. Después, retire los bulbos olfatorios con el cerebro en posición ventral hacia arriba.Realice incisiones longitudinales profundas donde los cortices se unen con el cefalón ventral. Con el cerebro con la cara dorsal hacia arriba, desprenda los cortices y luego corte la médula en aproximadamente cuatro trozos cada uno. Transfiera los cortices a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 350 microlitros de MEM frío por cerebro.Los cerebros del mismo genotipo se agrupan en el mismo tubo, de modo que cuatro cerebros requerirían 1400 microlitros de MEM. Una vez finalizada la disección, coloque los cerebros agrupados en un baño de agua a 37 grados durante tres minutos. A continuación, en una campana estéril de cultivo de tejidos, pase los fragmentos cerebrales a través de una punta de pipeta P 1000 para descomponerlos en trozos más pequeños.Agregue 75 microlitros de Pap pain OPC precalentado por cerebro al tubo cónico. Luego incube en un baño de agua a 37 grados durante 20 minutos. Invierta el tubo cada dos minutos para evitar la agregación del tejido.Una vez finalizada la incubación, añada dos mililitros de cultivo mixto de glía. Medios por cerebro al digestivo, déjelos reposar durante 10 minutos. Después de 10 minutos, alícuote la suspensión de tejido en tubos plásticos de cinco mililitros.El número de tubos debe coincidir con el número de cerebros en la preparación. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio pulida con llama, agite suavemente el contenido de cada tubo al principio, luego con mayor intensidad a medida que los fragmentos comiencen a disociarse. Deje de agitar una vez que no queden trozos visibles de tejido en la suspensión. Reúna el contenido de cada tubo en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de cultivo mixto de glía.Después de invertir suavemente el tubo varias veces, distribuya el medio por cerebro en alícuotas del volumen de suspensión celular en tubos cónicos de 15 mililitros. El número de tubos debe coincidir con el número de cerebros en la preparación. Centrifugue los tubos a 300 × g durante cinco minutos y resuspenda los pellets en un mililitro de medio de cultivo de glía mixta. Añada las células resuspendidas de cada tubo cónico a matraces T25 recubiertos con poli-L-lisina que previamente se equilibraron con cinco mililitros de medio de cultivo de glía mixta.El número de frascos debe ser igual al número de cerebros diseccionados; incubar los frascos en un incubador a 37 grados y 8,5 % de CO₂. Tras tres o cuatro horas, las células deberían haberse adherido al sustrato. Sin embargo, habrá mucha debris persistente en el medio, lo cual podría afectar negativamente la viabilidad celular.Para evitar esto, cambie el medio después de tres o cuatro horas por medio fresco para cultivo mixto de células gliales, si es posible. Este cambio de medio elimina gran parte de los restos celulares. Al día siguiente.Deben observarse muchas células en la base del frasco. Al tercer día, debería estar formándose una monocapa de astrocitos en la base del frasco. En este momento, realice un cambio de dos tercios del medio, retirando cuatro mililitros de medio y agregando de vuelta cuatro mililitros de medio fresco.Este paso debe repetirse cada tres días. En el sexto día, debe ser claramente visible una monocapa de astrocitos sobre la cual están proliferando las células precursoras de oligodendrocitos. En este momento, suplemente el medio de cultivo con insulina a una concentración final de cinco microgramos por mililitro. En el noveno día, las células precursoras de oligodendrocitos estarán listas para ser separadas de la monocapa de astrocitos.Para hacer esto, coloque los matraces en un agitador orbital y en un incubador con 5 % de CO2. Deje que el matraz se equilibre en este incubador durante una hora. Luego, agite las células a 50 rpm durante 45 minutos.Este paso elimina muchas células contaminantes débilmente adheridas. Realice un cambio completo del medio eliminando todo el medio y agregando nuevamente cuatro mililitros de medio de cultivo fresco. Vuelva a colocar el frasco en un incubador con 5%CO2 y deje que se equilibre durante tres horas.A las tres horas, verifique la coloración del medio de cultivo. El medio de cultivo debe ser rojo, lo que indica un pH equilibrado. Si el color tiende hacia el naranja o el púrpura, ajuste el nivel de CO2 del incubador en consecuencia.El mantenimiento de un pH equilibrado es importante para la supervivencia de las células precursoras de oligodendrocitos durante la agitación nocturna. Una vez que se ha alcanzado un pH equilibrado, agite el matraz a 220 RPM durante aproximadamente 16 horas. A la mañana siguiente, retire el matraz del agitador y transfiera el medio de los matraces a placas de cultivo tisular de 10 centímetros.Estos platillos servirán como medio para purificar aún más las células precursoras de oligodendrocitos mediante adhesión diferencial. Cada platillo debe recibir medio de dos frascos y luego incubar los platillos a 5 %CO₂ durante 30 minutos. En el minuto 15, agite suavemente cada platillo para evitar que las células precursoras de oligodendrocitos se adhieran al plástico.Después de la incubación de 30 minutos, examine los cultivos bajo contraste de fase. Las células precursoras de oligodendrocitos son evidentes como pequeños agregados de células. Algunas de estas células pueden haberse adherido al cultivo.Suelte las células precursoras de oligodendrocitos adheridas del recipiente mediante agitación suave. Tenga cuidado. Una agitación excesiva puede provocar el desprendimiento de los tipos celulares contaminantes.Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugar a 300 veces la gravedad durante cinco minutos. Resuspender suavemente el precipitado con una punta de pipeta P1000. A continuación, con una punta de pipeta P200, contar las células utilizando un hemocitómetro. Luego, los oligodendrocitos purificados pueden sembrarse sobre cubreobjetos recubiertos con laminina para su diferenciación en cultivos enriquecidos de oligodendrocitos al día uno.Después del siembra, las células precursoras de oligodendrocitos enriquecidas tienen una morfología relativamente simple, extendiendo solo unos pocos procesos. Al tercer día, los oligodendrocitos en diferenciación han extendido numerosos procesos que recuerdan a los oligodendrocitos inmaduros. Al sexto día, los oligodendrocitos han extendido láminas membranosas semejantes a mielina en cualquier momento durante este período.Las laminillas con cultivos pueden fijarse y procesarse para inmunoquímica citológica. En lugar de sembrar las células precursoras de oligodendrocitos purificadas sobre laminillas recubiertas con laminina, pueden sembrarse sobre lechos de neuritas de ganglios de la raíz dorsal para producir cultivos mixtos de mielinización. La siguiente sección describirá los métodos para producir estos cultivos.Para comenzar, aísle las vértebras completas de ratones P5 a P10 y transfiéralas a un microscopio de disección con tijeras de disección. Corte la región medial ventral de la vértebra de forma longitudinal. Retire cuidadosamente los ganglios de la raíz dorsal o DRG con pinzas de punta fina en cuatro pasos.Transfiera los ganglios a la solución salina tamponada de Hank en una placa de Petri. Recorte las raíces excesivamente largas de cualquier DRG. Utilice una punta de pipeta ancha P 1000.Transfiera los ganglios a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Mantenga el tubo en hielo hasta que todos los ratones hayan sido procesados. Cuando se complete el aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal, centrifugue el tubo a aproximadamente 300 ×g.Transfiera el tubo a una campana estéril de cultivo celular y retire el sobrenadante. Añada 500 microlitros de papaina DRG precalentada al tubo e incube en un baño de agua a 37 grados durante 10 minutos. Cuando la digestión con papaina esté completa, centrifugue y luego reemplace la solución de papaina.Con 500 microlitros de solución de colagenasa A, incubar a 37 grados durante 10 minutos. Repita el paso de centrifugación y sustituya la solución de colagenasa A por un mililitro de medio de cultivo DRGN. Después del paso final de centrifugación, agregue un mililitro de medio DRGN y, con una pipeta de Pasteur de vidrio pulida con llama, tri.Agite los ganglios lentamente al principio, luego con intensidad creciente a medida que el tejido comience a disociarse. Una vez que no sean visibles más trozos de tejido, transfiera la suspensión celular a una placa de Petri que contenga siete mililitros de medio DRGN. Incube la placa en un incubador a 37 grados a 8,5 % de CO2 durante una hora y un cuarto.Después de esta incubación, observe la placa de Petri. Bajo contraste de fases, las neuronas del ganglio dorsal se evidencian como células de cuerpo grande. Muchas células contaminantes deben estar firmemente adheridas a la placa de Petri.Transfiera el medio a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuague la placa con cuatro mililitros de medio DRGN para recoger cualquier neurona restante. Centrifugue el tubo cónico a 300 ×g durante cinco minutos. Re suspenda el botón resultante en 500 microlitros de medio DRGN.Cuente las células utilizando un citómetro HEO. Asegúrese de contar únicamente las neuronas del ganglio dorsal de la raíz; siembre entre 30 y 50.000 neuronas por laminilla recubierta de 12 milímetros en un mililitro de medio de cultivo DRGN. Incube las células en un incubador de cultivo de tejidos con 8,5 % de CO2.La mañana siguiente, realice un cambio completo del medio reemplazando el medio DRGN con medio OL suplementado con 10 micromolares de FUD R cada dos días. Posteriormente, realice un cambio de tres cuartas partes del medio con medio OL suplementado con FUD r. Cuando se examinan bajo el microscopio de contraste de fases al día uno, las neuronas han comenzado a extender algunos procesos. Al día tres, los procesos neuronales se han alargado.En el día seis, se ha desarrollado una red de neuritas compuesta por muchos procesos entrelazados. En el día nueve, esta red de neuritas ha aumentado en densidad y está lista para recibir oligodendrocitos a partir de cultivos cerebrales mixtos en crecimiento. Paralelamente a los cultivos de neuronas, las células precursoras de oligodendrocitos pueden purificarse en el día nueve de los cultivos neuronales.Luego pueden sembrarse sobre las camas de neuritas, agregando 50.000 células a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Al sexto día del cultivo conjunto, pueden observarse células semejantes a oligodendrocitos interactuando con las neuronas del ganglio dorsal de la raíz.Estas culturas ya pueden fijarse y procesarse para inmunocitoquímica. Cuando las culturas enriquecidas de oligodendrocitos se marcan con anticuerpos contra los marcadores de oligodendrocitos, se observan células inmunológicamente positivas para NG dos mag y MVP que muestran morfologías específicas según la etapa. Estas culturas se originan como una población de precursores de oligodendrocitos positivos para NG dos, y durante los seis días de diferenciación, producen oligodendrocitos maduros positivos para mag.Cuando se realiza una electroforesis SDS-PAGE en lisados obtenidos de cultivos enriquecidos en oligodendrocitos, puede observarse que los oligodendrocitos expresan CNPP y MVP a lo largo del curso temporal de seis días. Al examinar las neuronas de ganglios dorsales previo a la adición de oligodendrocitos, se evidencian en el día nueve lechos densos de neuritas positivas para Taj-1 y neurofilamentos. En el día seis del cultivo conjunto de oligodendrocitos y neuronas de ganglios dorsales, pueden observarse numerosos oligodendrocitos positivos para MBP interactuando con las neuritas neuronales a mayor aumento.Se observa que los oligodendrocitos envuelven estos neuritos con una membrana positiva para MBP que recuerda a la mielinización; una vista ampliada digitalmente muestra el grado de superposición de la membrana positiva para MVP sobre el proceso positivo para neurofilamentos. Hola, soy Scott Ryan, investigador posdoctoral en el Instituto de Investigación del Hospital de Ottawa. Estas técnicas proporcionan un método para generar sistemas de cultivo conjunto de ligamento, endocito y neuronas de ganglios dorsales a partir de ratones.Esta técnica es valiosa para estudiar modelos tanto inducidos experimentalmente como transgénicos de enfermedades mielinizantes. Asimismo, es eficaz para la selección de nuevos compuestos terapéuticos.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

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Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos (Video) | JoVE Journal

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