Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad del proteasoma en células vivas utilizando una proteína de fusión GFP-Deron. Primero clone los oligonucleótidos personalizados para Deron y el corrimiento del marco de lectura de Deron. Introduzca el vector P-E-G-F-P-C uno y continúe con los protocolos para el sistema Gateway en Vitrogen, luego produzca virus para cada construcción utilizando células HEK 293 FT. Después de determinar la titulación, transduzca las células con el virus y aplique la selección con antibiótico, luego amplifique las células estables resultantes que expresan GFP-Dron o GFP-Dron con corrimiento del marco de lectura.

Esta técnica facilita experimentos que monitorean las respuestas celulares a tratamientos determinados mediante mediciones de señales de fluorescencia. Por ejemplo, la actividad del proteasoma puede evaluarse fácilmente utilizando microscopía de fluorescencia epiescopia o citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como ensayos luminogénicos o fluorogénicos que utilizan ácidos de células completas, es que la actividad del proteasoma se mide en células vivas. Para la transfección, diluya 36 microlitros del reactivo lipo 2000 en 1,5 mililitros de DMEM; en otro tubo cónico de 15 mililitros, diluya las construcciones de ADN en 1,5 mililitros de DMEM.

Después de cinco minutos, combine ambos y incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora, sustituya el medio de un cultivo confluyente de células HEK 293 FT en un matraz T75 con siete mililitros de DMEM. A continuación, agregue la mezcla de ADN con liposomas al matraz y mezcle moviéndolo suavemente hacia adelante y hacia atrás.

Incubar el matraz durante toda la noche a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de CO2. Al día siguiente, reemplace el medio con 10 mililitros de DMEM. Después de 48 horas, recoger el sobrenadante. Filtrar el sobrenadante que contiene el virus a través de un filtro de PVDF de 0,45 micrómetros.

Para concentrar el virus, agregue un volumen de solución de PEG a cuatro volúmenes de sobrenadante e incube durante dos horas a cuatro grados Celsius con mezclas periódicas mediante inversión. Recupere el virus por centrifugación tras aspirar la SNA del precipitado blanco; centrifugue nuevamente para eliminar cualquier resto de solución de PEG. Re_suspenda el precipitado final en PBS mediante Peppe, luego vortexee enérgicamente durante 20 a 30 segundos.

Almacene alícuotas de 100 microlitros de virus a menos 80 grados centígrados. Siembre células U2 OS en placas de seis pocillos e incube durante la noche. Para la transfección, reemplace el medio de cultivo con un mililitro de DMEM que contenga ocho microgramos por mililitro. Poli cerebro reserve un pocillo como control positivo y pruebe una serie de concentraciones virales en los pocillos restantes.

Incubar durante la noche el día siguiente. Reemplazar el medio con dos mililitros de DMEM e incubar durante 24 horas. Iniciar la selección con 10 microgramos por mililitro de blasticina y continuar reemplazando el medio que contiene el antibiótico cada segundo día.

Aproximadamente entre seis y siete días después, verifique la muerte celular de los no transducidos. Luego lave las células tres veces con PBS para teñirlas. Cubra con violeta de cristal e incube de cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, luego aspire el colorante, enjuague la placa dos veces con agua doblemente destilada y seque la placa al aire.

Finalmente, cuente las colonias para calcular las unidades de transfección del virus por mililitro. Siembre fibroblastos diploides humanos en placas de seis pocillos con ocho microgramos por mililitro de polibreno como potenciador de la transducción.

Utilice una multiplicidad de infección de dos en un volumen total de un mililitro. Cambie el medio. Al día siguiente, cuando el cultivo tenga una confluencia del 70 al 80 %.

Comience la selección crónica con 10 microgramos por mililitro. Analice periódicamente durante varios días, monitoreando la muerte celular completa, lo que indica que la selección ha finalizado. Amplíe las células transducidas de manera estable para generar una línea celular estable que exprese las proteínas de fusión GFP DERON o GFP Deron con corrimiento del marco de lectura. Comience sembrando las células que portan ya sea GFP DRON o el corrimiento del marco de lectura de GFP DRON al día siguiente, tres horas antes de los hechos.

Trate las células de control con un inhibidor de protosoma. Lave dos veces con PBS y recolecte las células utilizando O 0.5 mililitros de tripsina. Para detener la tripsina.

Utilice 4,5 mililitros de medio de cultivo y transfiera las células a un tubo Falcon de 15 mililitros. Recoga las células por centrifugación. Después de un lavado con PBS, resuspenda el precipitado en 400 microlitros de tampón fax. Transfiera las células a tubos fax y colóquelos sobre hielo.

Ahora mida las muestras mediante citometría de flujo. La proteína de fusión GFP Deron lleva una secuencia que se dirige al proteasoma para su degradación inmediata. Por el contrario, el mutante por corrimiento del marco de lectura GFP Deron FS no es degradado por los proteasomas.

Por lo tanto, cuando se transducen con GFP Deron, los fibroblastos humanos jóvenes recién activados con una actividad proteasomal esperada alta muestran una señal fluorescente baja bajo fluorescencia epiluminiscente. Las mismas células transducidas con GFP Deron con corrimiento del marco de lectura muestran un 39,7 % de células positivas. El tratamiento de las células con el inhibidor del proteasoma ll y L provoca un aumento en las señales hasta un máximo de aproximadamente el 63 % en ambas líneas celulares, GFP dron y GFP Dron con corrimiento del marco de lectura.

Mediciones similares en fibroblastos dérmicos, aislados de donantes jóvenes, de mediana edad y mayores, revelan un aumento evidente en la señal GFP entre individuos jóvenes y donantes de mediana edad, lo que indica una disminución en la actividad del proteasoma en muestras obtenidas de donantes mayores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir partículas lentivirales, transfectar células y determinar la actividad del proteasoma en células vivas.