Name: La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a construir un sistema de axotomía láser de bajo costo para estudiar la regeneración de axones en C. elegans. Este método permite cortar axones con precisión y daño mínimo, siendo una herramienta valiosa para investigadores en neurociencia.

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Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias, el Fondo de Dotación McKnight para la Neurociencia, la Fundación Christopher y Dana Reeve y la Fundación Benéfica Amerisure.

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<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

Existen varias buenas discusiones sobre microcirugía láser con diferentes sistemas láser3,5-11. Los láseres de infrarrojo de femtosegundo son el "estándar de oro" para la ablación láser subcelular12 y son convenientes si se asocian con una instalación de imagen, pero a menudo son demasiado costosos para usuarios individuales. Si necesita un láser de infrarrojo de femtosegundo para obtener imágenes de su muestra debido a la profundidad de penetración, probablemente también lo necesitará para la axotomía láser. Los tejidos transparentes con axones diana situados a 30-50 µm de la superficie probablemente sean factibles con láseres pulsados azules y verdes en el rango de 20 µJ/pulso, dirigidos a través de un objetivo de inmersión de alta apertura numérica. Habrá más daño colateral con los láseres de nanosegundo y picosegundo en comparación con el láser de femtosegundo, especialmente a medida que aumenta la profundidad del axón diana. C. elegans es transparente y todos los axones se encuentran a menos de 20-30 µm de la superficie. Habitualmente cortamos axones motores que están a menos de 5 µm de la superficie. También hemos cortado fácilmente axones dentro del anillo nervioso que se encuentran aproximadamente a 20 µm de la superficie de la cutícula. Hemos encontrado que el límite para cortar axones es de aproximadamente 30-50 µm a través del diámetro de un gusano adulto. Es probable que el sistema de ablación láser descrito aquí funcione bien con muchas preparaciones diferentes que cumplan con los criterios de transparencia y profundidad de los axones diana. Aun así, resulta un poco sorprendente, dadas las ventajas teóricas de los láseres de infrarrojo de femtosegundo, que los láseres de nanosegundo y picosegundo de 355 nm y 532 nm funcionen tan bien en la axotomía láser en C. elegans6,13. No observamos diferencias en la regeneración axonal en respuesta a la axotomía láser realizada con láseres de nanosegundo de 440 nm, de nanosegundo de 532 nm y de infrarrojo de femtosegundo.
Los láseres ultravioleta (UV) de estado sólido de 355 nm tienen un costo similar al de los láseres de estado sólido bombeados por diodo y con conmutación pasiva Q a 532 nm, pero requieren potencias más altas o bien óptica que transmita eficientemente estas longitudes de onda más cortas. La mayoría de los componentes ópticos están diseñados para funcionar bien con luz visible de 400-700 nm. Los láseres de 355 nm ofrecerían algunas ventajas6, como un umbral de plasma reducido, un tamaño de punto más pequeño y un filtro dicróico de paso largo que dirigiría eficazmente el 100 % del láser de ablación hacia el objetivo, permitiendo al mismo tiempo la obtención de imágenes de GFP sin pérdida de señal de la muestra. Los láseres azules de 440 nm conservarían las ventajas de trabajar con un láser de luz visible (buen rendimiento con óptica estándar y mayor seguridad). Desafortunadamente, el costo de un láser de estado sólido DPP con conmutación Q a 440 nm es en la actualidad tres veces mayor que el de un láser de 355 nm o 532 nm de potencia similar. Si estuviéramos diseñando un sistema nuevo para C. elegans, donde la profundidad del objetivo es mínima, optaríamos por un objetivo transparente al UV (con un costo de aproximadamente 3.000 dólares para un objetivo de inmersión en aceite de 40X y 1,3 de apertura numérica, con una transmitancia del 50-70 % a 355 nm) y un láser de 355 nm que produzca de 5 a 10 uJ por pulso a una frecuencia de 1-20 kHz.
Se cree que la ablación de axones se debe a la formación de plasma. Pulsos más cortos producirán umbrales de plasma a menor potencia y los volúmenes de plasma serán más pequeños6. El objetivo consiste en generar el plasma más pequeño y de menor duración ajustando la energía del pulso a la potencia más baja posible. Los plasmas más grandes y duraderos generarán burbujas de cavitación que dañan las células circundantes. En general, hemos encontrado que la ablación utilizando aproximadamente entre 50 y 100 pulsos a la frecuencia más alta (es decir, 2,5 kHz) proporciona los mejores resultados. Esto sugiere que el daño puede integrarse progresivamente a lo largo de una serie de pulsos para controlar mejor el grado de daño. El sistema de ablación láser descrito aquí es muy tolerante si el haz se alinea y expande con precisión. Comenzamos a cortar axones en gusanos adultos con un 10 % de potencia láser (un promedio de 0,3 mW medido a 2500 Hz y una estimación de 1 uJ/pulso) y podemos realizar cortes con daño localizado limitado hasta un 14 % de potencia. Se pueden observar áreas de daño más extensas entre el 15 % y el 39 % de potencia láser, pero solo por encima del 40 % de potencia (aproximadamente 1 mW promedio medido a 2500 Hz) los gusanos explotan debido a grandes burbujas de cavitación y daño en la cutícula del gusano.
El artículo de Steinmeyer et al. 20102 es un excelente recurso para construir un sistema de ablación láser. Leon Avery también ofrece una descripción práctica muy útil de un sistema de ablación láser basado en un láser de gas N2 económico de 337 nm, y proporciona algunos consejos prácticos excelentes (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Al diseñar su propio sistema, primero debe hablar con el representante de su microscopio para determinar cómo dirigir el láser de ablación hacia el objetivo del microscopio. Su microscopio debe montarse sobre una mesa de aislamiento de vibraciones (Newport, TMI, Thor). Una superficie tipo placa de montaje óptico es óptima, aunque también puede utilizarse una superficie de acero macizo con posicionadores magnéticos. Un módulo intermedio dedicado en un microscopio vertical es conveniente porque todos los elementos ópticos pueden dejarse en su lugar. Sin embargo, puede resultar menos costoso y más práctico usar un puerto para cámara (invertido) o un «combinador» conectado a un puerto de epifluorescencia. Debe conocer el tamaño de la abertura posterior y la transmitancia (a la longitud de onda del láser de ablación) del objetivo que pretende utilizar. Una vez que haya elegido un láser (por ejemplo, Crylas, TEEM, Crystal o CRC), debe contactar a Thor o Newport para obtener ayuda en la selección de los elementos ópticos, hardware y equipo de seguridad adecuados. Optamos por un expansor de haz Galileano doble para ahorrar espacio, aunque también es posible usar un expansor Kepleriano más sencillo (f2/f1=factor de expansión). Un expansor de haz personalizado será el más económico, pero Newport, Thor y varios fabricantes de láseres ofrecen expansores de haz comerciales de excelente calidad. Algunos fabricantes de láseres también ofrecen atenuadores manuales y controlados electrónicamente que pueden ser rentables y ahorrar espacio, aunque no tan versátiles como el polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda. También deberá decidir cómo controlar el láser. Puede diseñar un controlador basado en LabView, usar un generador TTL comercial o el software proporcionado por la empresa fabricante del láser. Discuta las opciones con el fabricante específico del láser.
Hemos proporcionado una lista del hardware que hemos utilizado solo como una guía general. El sistema descrito aquí costó aproximadamente $15,000 cuando se incorporó a nuestro sistema de imágenes existente. Es probable que su departamento local de Física tenga alguien dispuesto a ofrecer una introducción práctica al trabajo seguro con láseres de haz libre.
Recientemente se han descrito métodos alternativos para la inmovilización y la obtención de imágenes de lapso de tiempo de C. elegans.14
Solución de problemas
El paso más difícil y crítico es la alineación del haz expandido y centrado con el eje óptico del microscopio. Una vez que tenga el haz centrado y expandido mediante las lentes galileanas, debe esforzarse por alinearlo a menos de 5 µm del eje óptico del microscopio ANTES de usar los espejos de orientación para el ajuste final al centro. El uso excesivo de los espejos de orientación para alinear el haz al microscopio lo desplazará fuera del eje a través del expansor de haz. CON EXTREMA PRECAUCIÓN, puede atenuar el haz láser con el filtro ND adecuado y observar directamente el perfil del haz láser sobre un objetivo reflectante (espejo de superficie frontal). Puede mover ligeramente el microscopio para centrar con precisión el haz en el campo de visión del objetivo de 60X (si no se puede centrar en el rango arriba/abajo, debe ajustar la altura del riel). El perfil del haz puede utilizarse para alinear con precisión el eje óptico del microscopio, obteniendo un haz centrado, circular y que "se abre" simétricamente. Un ensanchamiento asimétrico indica que el eje del microscopio no está perfectamente alineado (o que el riel no está nivelado). Finalmente, debe ajustar L3 y observar una expansión y contracción del haz uniforme y simétrica. Enfoque el microscopio con precisión sobre la superficie del objetivo y luego ajuste L3 para enfocar el haz láser en el punto más pequeño posible. Ahora debería encontrar que el haz láser está dentro de 5 µm del centro cuando se visualiza mediante un sistema LSCM o CCD, y que el punto de ablación está dentro de 1 µm del enfoque en Z.
Si observa que está "reventando" gusanos o generando consistentemente grandes burbujas de cavitación para cortar axones, es muy probable que el problema sea el alineado fino del láser de ablación. Asegúrese de que el punto de ablación mínimo (&lt;500nm) esté localizado en el enfoque Z (ajuste la convergencia con la lente L3) y en el punto fiducial XY (ajuste con el último espejo montado cinemáticamente).
Dirigirse a axones más cercanos a la superficie requerirá menos potencia láser. De manera similar, los animales más pequeños (L1 y L2) requerirán menos potencia láser para la axotomía en comparación con dirigirse a los mismos axones en adultos.
Si sus axones de tipo salvaje no se regeneran o si los axones se decoloran, debe intentar reducir la potencia del láser de imagen o disminuir la frecuencia de muestreo. Si sus gusanos mueren o presentan un estado de salud deficiente, intente reducir el porcentaje de agarosa en pasos del 1%. Asegúrese de no mover la laminilla después de montar los gusanos, ya que esto frecuentemente provoca su muerte cuando se utiliza agarosa de alto porcentaje y microesferas.
Si sus gusanos estallan o mueren durante una sesión de lapso de tiempo, se debe a: 1. El porcentaje de agarosa es demasiado alto. 2. Daño en la cutícula causado por el láser de ablación. 3. Movimiento del cubreobjetos después del montaje. Si el daño en la cutícula es la causa, solo se verán afectados los gusanos montados que hayan sido expuestos al láser de ablación.
Si su gusano se mueve demasiado durante una sesión de lapso de tiempo, intente aumentar el porcentaje de agarosa en incrementos de 0,5 %. Los axones sanos en gusanos sanos siempre son «activos» y muestran un nivel constante de fluorescencia. Si observa una disminución repentina en la fluorescencia o en la actividad, el gusano está muriendo o ya ha muerto. La presencia de múltiples axones con forma de cuentas o fragmentados es un signo seguro de que el gusano está muriendo o ha muerto.
Si tiene dificultades para mantener los axones en foco durante toda la sesión de lapso de tiempo, puede haber varios problemas diferentes. Primero, verifique la deriva de la platina realizando imágenes de una muestra inerte sobre un portaobjetos de vidrio durante 10 horas. Una deriva de algunas micras puede deberse a inestabilidad térmica, pero más de 5 µm probablemente se deba a problemas mecánicos con su microscopio. Los problemas con el montaje son más comunes. Permita que sus gusanos montados se equilibren con la platina del microscopio durante 30 minutos antes de comenzar su lapso de tiempo. Verifique que su sellado de vaselina no haya desarrollado fugas durante el transcurso de su sesión de lapso de tiempo.

<table><tbody><tr><td>Nombre del reactivo</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios (opcional)</td></tr><tr><td>Láser de 535 nm</td><td>Crylas</td><td>FDSS532Q3</td><td>(TEEM, Crystal y CRC también ofrecen láseres comparables)</td></tr><tr><td>Toda la óptica y hardware</td><td></td><td></td><td>(Thor ofrece óptica y hardware comparables)</td></tr><tr><td>Soporte óptico SUPREMA, diámetro de 1,0 pulgadas</td><td>Newport Corp.</td><td>SS100-F2KN</td><td>2</td></tr><tr><td>Varilla de 1&quot; de diámetro, 1&quot; de altura</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Horquilla para varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Lámina de onda acromática de orden cero, retardo de media onda &amp;frac12;, 400-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10RP52-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Etapa de rotación, apertura de 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>RSP-1T</td><td>1</td></tr><tr><td>Varilla de 1&quot; de diámetro, 1&quot; de altura</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Horquilla para varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Polarizador de calcita Glan-Láser, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10GL08AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Soporte de rotación para polarizador</td><td>Newport Corp.</td><td>RM25A</td><td>1</td></tr><tr><td>Espaciador de &amp;#188;&quot; para varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.25</td><td>1</td></tr><tr><td>Altura de &amp;frac12;&quot;, varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.5</td><td>1</td></tr><tr><td>Horquilla, varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Trampa de haz</td><td>Newport Corp.</td><td>PL15</td><td>1</td></tr><tr><td>Soporte para lente de objetivo de microscopio</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-OBJ1</td><td>1</td></tr><tr><td>Varilla de 1&quot; de diámetro, 1&quot; de altura</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Horquilla para varilla de 1&quot; de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Espejo láser de alta energía Nd:YAG, diámetro de 25,4 mm, 45&amp;#x00B0;, 532 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10Q20HE.2</td><td>4</td></tr><tr><td>Soporte óptico SUPREMA, diámetro de 1,0 pulgada, orificio de montaje con espacio libre</td><td>Newport Corp.</td><td>SN100C-F</td><td>2</td></tr><tr><td>Tornillo de ajuste de precisión alta, recorrido de 12,7 mm, 100 TPI</td><td>Newport Corp.</td><td>AJS100-0.5K</td><td>4</td></tr><tr><td>Adaptador de rosca, macho &amp;#188;-20, hembra 8-32</td><td>Newport Corp.</td><td>SS-1-B</td><td>2</td></tr><tr><td>Abrazadera de varilla para varilla de 1,5 pulgadas de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>340-RC</td><td>2</td></tr><tr><td>Varilla, 14 pulgadas (35,5 cm) de altura</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>1</td></tr><tr><td>Portarrail para X26, longitud cuadrada de 40 mm</td><td>Newport Corp.</td><td>CN26-40</td><td>4</td></tr><tr><td>Rail de acero, longitud de 384 mm (15&quot;)</td><td>Newport Corp.</td><td>X26-384</td><td>1</td></tr><tr><td>Plataforma de varilla para varilla de 1,5 pulgadas de diámetro</td><td>Newport Corp.</td><td>300-P</td><td>2</td></tr><tr><td>Varilla, 14 pulgadas (35,5 cm) de altura</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>2</td></tr><tr><td>Lente plano-cóncava, diámetro de 12,7 mm, distancia focal efectiva de -25 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPC025AR.14</td><td>2</td></tr><tr><td>Lente plano-convexa, diámetro de 25,4 mm, distancia focal efectiva de 50,2 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX082AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Lente plano-convexa, diámetro de 25,4 mm, distancia focal efectiva de 62,9 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX085AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Soporte fijo para lente, diámetro de 0,5&quot;, altura del eje de 1,0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-0.5</td><td>2</td></tr><tr><td>Soporte fijo para lente, diámetro de 1,0&quot;, altura del eje de 1,0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-1</td><td>2</td></tr><tr><td>Microesferas de 0,1 µm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td>Importa EEO</td></tr><tr><td>Muscimol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1523</td><td></td></tr></tbody></table>

la construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía sistema para el estudio de la regeneración de axones en c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

La axotomía con láser seguida de microscopía de lapso de tiempo es un ensayo sensible para fenotipos de regeneración axonal en C. elegans1. La principal dificultad de este ensayo es el costo percibido ($25-100K) y la experiencia técnica necesaria para implementar un sistema de ablación con láser2,3. Sin embargo, láseres de pulso de estado sólido de costos moderados (&lt;$10K) pueden ofrecer un rendimiento robusto para la ablación con láser en preparaciones transparentes donde los axones diana están "cerca" de la superficie del tejido. La construcción y alineación de un sistema pueden completarse en un día. La trayectoria óptica proporcionada por la luz del condensador enfocado hasta el láser de ablación ofrece una guía de alineación conveniente. Un módulo intermedio con todos los elementos ópticos removidos puede dedicarse al láser de ablación y asegura que ningún componente óptico deba moverse durante una sesión de ablación con láser. Un divisor dicróico en el módulo intermedio permite la imagen simultánea y la ablación con láser. Centrar el haz del láser con respecto al haz saliente del lente condensador del microscopio enfocado guía la alineación inicial del sistema. Se utilizan diversas lentes para acondicionar y expandir el haz del láser hasta llenar la abertura posterior del objetivo elegido. La alineación final y las pruebas se realizan con una lámina de vidrio con superficie frontal reflectante como blanco. La potencia del láser se ajusta para obtener un punto de ablación de tamaño mínimo (&lt;1um). El punto de ablación se centra mediante ajustes finos del último espejo montado cinemáticamente respecto a las marcas de alineación fijas en la ventana de imagen. La potencia del láser para la axotomía será aproximadamente 10 veces mayor que la necesaria para el punto de ablación mínimo en la lámina blanco (esto puede variar según el blanco utilizado). Los gusanos pueden inmovilizarse para la axotomía con láser y la microscopía de lapso de tiempo montándolos sobre almohadillas de agarosa (o en cámaras microfluídicas4). Las almohadillas de agarosa se preparan fácilmente con agarosa al 10 % en solución salina equilibrada, fundida en un microondas. Una gota de agarosa fundida se coloca sobre una lámina de vidrio y se aplana con otra lámina de vidrio hasta formar una almohadilla de aproximadamente 200 um de grosor (una capa única de cinta adhesiva en las láminas adyacentes se utiliza como espaciador). Se utiliza la tapa de un rotulador "Sharpie" para recortar una almohadilla circular de diámetro uniforme de 13 mm. Se añade anestésico (1 µl de muscimol 20 mM) y microesferas (comunicación personal de Chris Fang-Yen) (1 µl de poliestireno al 2,65 %, 0,1 µm en agua) al centro de la almohadilla, seguido de 3-5 gusanos orientados de forma que queden acostados sobre su lado izquierdo. Se coloca una cubreobjetos de vidrio y luego se utiliza vaselina para sellarla y prevenir la evaporación de la muestra.

La axotomía con láser seguida de imágenes de lapso de tiempo es una técnica sensible para evaluar los efectos de mutaciones en C. elegans sobre la regeneración de axones. Un sistema de ablación láser de alta calidad pero económico puede agregarse fácilmente a la mayoría de los microscopios. La adquisición de imágenes de lapso de tiempo durante 15 horas requiere una inmovilización cuidadosa del gusano.

La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans</em

La axotomía por láser seguida de microscopía de lapso de tiempo es un ensayo sensible para los fenotipos de regeneración axonal en C. elegans1. La principal dificultad de este ensayo...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo montar y alinear un sistema de ablación láser para estudiar la regeneración de axones en CL gans. Esto se logra primero montando un láser, la glándula láser, el polarizador Thompson, la placa de media onda, el espejo giratorio, el periscopio, el riel y el espejo del riel sobre una placa de montaje. El siguiente paso del procedimiento consiste en alinear el haz láser con el haz emergente del lente condensador del microscopio.Luego se montó, alineó y posicionó la lente del expansor del haz láser para centrar el haz y hacerlo con divergencia nula. El paso final del procedimiento consiste en hacer que el punto de ablación láser coincida con el enfoque de la imagen mediante ajustes finos. En última instancia, es posible cortar con precisión axones de medio micrómetro con daño mínimo en los tejidos colindantes utilizando un haz láser limitado por difracción cuando la alineación NC XY es imperfecta.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los láseres de femtosegundo es que es relativamente económica, con un costo de 15,000. Es prácticamente libre de mantenimiento y permite un corte muy preciso de axones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de axones en *C. elegans*, también puede aplicarse a otros sistemas, como moscas, pez cebra, ratón, sistema nervioso periférico y células *in vitro*.Básicamente, cualquier célula que se encuentre a entre 30 y 50 micrómetros de la superficie. Comience con los componentes colocados en la placa de pruebas y sujete con pernos el poste del periscopio láser y los soportes elevados del riel. Este sistema utiliza un láser de Clase tres B que puede dañar fácilmente los ojos, así que por favor tome muy en serio las medidas de seguridad con láser.Hable con alguien de su departamento local de física sobre cómo trabajar de forma segura con láseres de haz libre. Siempre durante el proceso de alineación, configure el láser a la potencia más baja. Cuando mire a través de los oculares, asegúrese de que el láser esté cerrado mecánicamente y de que esté apagado.Ahora, posicione primero el microscopio, alineándolo con el eje del riel. Segundo, alinéelo con el haz de luz transmitida procedente de la lente del condensador del microscopio. Tercero, alinee ambos extremos del riel con el haz del condensador utilizando una abertura ajustable o una lente fijada al riel.Utilice un nivel y gatos de laboratorio para ajustar la altura del riel antes de continuar. Asegúrese de que ambos extremos del riel estén alineados. Ahora, verifique que el haz láser atraviese la glándula, el polarizador de Thompson y la placa de media onda, y que no toque sus bordes durante la rotación.La placa intermedia ajustará la potencia del láser con todos los componentes fijados en la placa base. Encienda el láser, configure la frecuencia de pulso en modo continuo a 100 y reduzca la potencia al mínimo utilizando la placa intermedia. Utilice una nota adhesiva o papel para lentes para visualizar el haz del láser.Ahora, para elevar el haz láser desde la plataforma. Ajuste y fije los espejos montados cinemáticamente en secuencia, desde el láser, para dirigir el haz hacia el espejo que está montado en el extremo del riel elevado. Al finalizar, el haz láser debe estar alineado aproximadamente con el centro de los espejos, y los espejos deben estar orientados aproximadamente a 45 grados respecto al eje del haz láser antes de alinear el haz láser con el haz de luz transmitida del microscopio.Retire o abra todos los filtros ND y diafragmas en el módulo intermedio. Ahora comenzamos el paso más crítico para lograr un corte preciso de los axones sin daño colateral excesivo. Vamos a alinear el láser con precisión en los ejes x, y y z con la potencia láser más baja posible para obtener el punto de ablación más pequeño.El haz láser y los haces de luz transmitida pueden verse simultáneamente sobre un papel. Coloque el papel cerca del puerto del microscopio para comenzar. Ahora inicie el alineado del láser utilizando los ajustes gruesos del espejo en la parte superior del periscopio y del espejo en el extremo del riel.Coloque un papel entre la lente del condensador alineado y la torreta de objetivos abierta. Continúe utilizando los ajustes finos del espejo de riel para alinear el haz láser al centro del haz de luz transmitida más amplio. Ahora, fije el microscopio en su lugar con abrazaderas.Se pueden encontrar pasos adicionales sobre la evaluación del alineamiento del láser en el manuscrito escrito. Deben instalarse expandidores de haz galileanos duales para ampliar 33 veces el haz de láser de 300 micrones y llenar la apertura posterior del objetivo de 10 milímetros. Comience montando las cuatro lentes en sus portadores.Luego, fije las lentes al riel de manera que todas estén en el mismo eje óptico y exactamente ortogonales al haz láser. Encienda el láser y ajústelo a la potencia mínima y al modo continuo. Ajuste aproximadamente la alineación del haz a través de cada lente.Utilice papel para ver el haz. Ahora apague el láser. Coloque un obturador de seguridad en el láser y retire el microscopio del camino del haz láser.Encienda nuevamente el láser y visualícelo contra una pared cercana. Utilice el ajuste fino de las lentes para expandir el haz. Luego, ajuste los dos últimos espejos montados cinemáticamente para alinear el haz en un círculo de brillo uniforme en la posición estimada de la abertura trasera del objetivo.Observe el tamaño y la uniformidad del haz sobre el papel. Luego, ajuste el haz a convergencia cero observando cómo cambia el tamaño del haz al mover el papel más lejos de la lente. Apague el láser y active el obturador mecánico.Deslice el microscopio nuevamente hacia la trayectoria del haz láser utilizando las abrazaderas fijas para definir la alineación correcta. Coloque las abrazaderas en el lado libre del microscopio, pero no las apriete. Ahora encienda el láser.Retire el obturador de seguridad y gire la torreta de objetivos hacia una posición abierta utilizando papel en la platina; debe observarse un haz láser expandido y uniforme centrado sobre el haz de luz transmitida proveniente del condensador. Si los haces no están centrados, ajústelos aflojando las abrazaderas del microscopio y desplazando cuidadosamente el microscopio. Ahora active el obturador de seguridad y configure el láser en modo de disparo.Gire el objetivo de 60 aumentos en su lugar. Ahora, obtenga una imagen de los arañazos superficiales en una platina objetivo. Retire la cubierta de seguridad, active el láser de ablación y ajuste la potencia del láser para obtener el punto de ablación mínimo.El punto debe ser circular y estar dentro de cinco a 10 micrones del centro de la imagen, centro, el punto de ablación. Utilizando los ajustes finos del espejo de riel montado cinemáticamente para mantener el punto centrado y el perfil del haz uniforme, será necesario ajustar de forma iterativa el espejo montado en el riel y el espejo del periscopio superior. Evalúe el enfoque Z del láser moviendo el enfoque sistemáticamente hacia arriba y hacia abajo en pasos de un micrón, activando el láser de ablación en cada paso.Si el haz está correctamente expandido y alineado, y con la convergencia ajustada adecuadamente, entonces debería ablacionar de forma máxima en el foco de la imagen y débilmente o nada en absoluto, un micrómetro por encima o por debajo del foco. Si el punto máximo de ablación se encuentra por encima o por debajo del foco de la imagen, realice los ajustes finales al enfoque Z del haz expandido moviendo la lente L tres del telescopio galileano hasta que la ablación láser coincida con el foco de la imagen. Los nematodos se montaron en una portaobjetos personalizada y los axones se ablacionaron utilizando el sistema construido de laserexo somía, y la adquisición de imágenes por intervalos de la regeneración axonal fue muy robusta.Mediante el uso de una platina motorizada, fue posible cortar e imaginar rutinariamente cinco axones en cinco animales diferentes sobre un solo portaobjetos. El tiempo de adquisición de imágenes para los axones fue el factor limitante.Aproximadamente el 10 % de los experimentos produjeron películas de lapso de tiempo de alta calidad. Los experimentos restantes proporcionaron todos datos buenos, pero eran estéticamente menos atractivos debido a pequeños movimientos de temblor del gusano que generalmente comenzaban después de cinco a ocho horas de inmovilización. Al intentar este procedimiento, siempre es fundamental evaluar con precisión la alineación del láser en los ejes x, y y Z.El problema más común que tienen las personas al intentar cortar axones es el daño colateral o la imposibilidad total de cortarlos, y esto casi siempre se debe a un láser mal alineado. Este sistema de ablación láser y la técnica para visualizar la regeneración de axones en c Agains permitirán evaluar rutinariamente el efecto de cualquier mutación genética sobre la regeneración de axones. NCL Agains.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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