La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans
15 de noviembre de 2011
La axotomía láser seguida de imágenes de lapso de tiempo es una forma sensible de analizar los efectos de las mutaciones en C. elegans en la regeneración de axones. Un sistema de ablación láser de alta calidad, pero económico, se puede agregar fácilmente a la mayoría de los microscopios. Las imágenes de lapso de tiempo de más de 15 horas requieren una inmovilización cuidadosa del gusano.
El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo ensamblar y alinear un sistema de ablación láser para estudiar la regeneración de axones en CL gans. Esto se logra montando primero un polarizador de prensaestopas Thompson, un espejo giratorio de placa de media onda, un riel de periscopio y un espejo de riel en una placa de pruebas. El siguiente paso del procedimiento es alinear el rayo láser con el haz saliente de la lente del condensador del microscopio.
Luego, se monta, alinea y posiciona la lente del expansor del rayo láser para centrar el rayo láser y hacer que sea divergente cero. El paso final del procedimiento es hacer que el punto de ablación láser sea congruente con el enfoque de la imagen mediante ajustes finos. En última instancia, es posible cortar con precisión axones de media micra con un daño tisular colateral mínimo utilizando el rayo láser limitado por difracción cuando se trata de una alineación XY NC imperfecta.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los láseres Femto de segundo láser, es que es relativamente barata, con 15.000. Es relativamente libre de mantenimiento y proporciona un corte de axones muy preciso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de los axones del elgan marino, también se puede aplicar a otros sistemas como las moscas, el ratón pez cebra, el sistema nervioso periférico y las células in vitro.
Básicamente, cualquier célula que se encuentre a menos de 30 a 50 micrómetros de la superficie. Comience con los componentes colocados en la placa de pruebas y atornille el poste del periscopio láser y los soportes de rieles elevados. Este sistema utiliza un láser de clase tres B que puede dañar fácilmente sus ojos, así que tome en serio la seguridad de la seguridad del láser.
Hable con alguien de su departamento de física local sobre cómo trabajar con láseres de haz libre de forma segura. Siempre durante el proceso de alineación, ajuste el láser a la potencia más baja. Cuando mire a través de los oculares, asegúrese de que el láser esté obturado mecánicamente y que el láser esté apagado.
Ahora, coloque primero el microscopio, alinéelo con el eje del riel. En segundo lugar, alinéelo con el haz de luz transmitido por la lente del condensador del microscopio. En tercer lugar, alinee ambos extremos del riel con el haz del condensador usando una apertura ajustable o una lente fijada al riel.
Use un nivel y gatos de laboratorio para ajustar la altura del riel antes de continuar. Asegúrese de que ambos extremos del riel estén alineados. Ahora, asegúrese de que el rayo láser esté pasando a través de la glándula, el polarizador Thompson y la placa intermedia, y no esté golpeando sus bordes girando.
La placa intermedia ajustará la potencia del láser con todos los componentes asegurados a la placa de pruebas. Encienda el láser, ajuste la frecuencia de pulso al modo continuo 100 y reduzca la potencia al mínimo usando la placa intermedia. Use una nota adhesiva o papel de lente para visualizar el rayo láser.
Ahora para subir el rayo láser de la placa de pruebas. Ajuste y fije los espejos montados cinemáticamente en secuencia desde el láser para llevar el haz hasta el espejo que está montado en el extremo del riel elevado. Cuando termine, el rayo láser debe alinearse aproximadamente con el centro de los espejos, y los espejos deben orientarse aproximadamente 45 grados con respecto al eje del rayo láser antes de alinear el rayo láser con el haz de luz transmitido del microscopio.
Retire o abra los filtros ND y las aberturas del módulo intermedio. Ahora comenzamos el paso más crítico para dar un corte preciso de los axones sin daños colaterales excesivos. Vamos a alinear el láser con precisión en los ejes x, y y Z a la potencia láser más baja para obtener el punto de ablación más pequeño.
El láser y los haces de luz transmitidos se pueden ver simultáneamente contra el papel. Coloque el papel cerca del puerto del microscopio para comenzar. Ahora comience a alinear el láser usando los ajustes de curso en el espejo en la parte superior del periscopio y el espejo en el extremo del riel.
Coloque un papel entre la lente del condensador alineada y la torreta del objetivo abierta. Continúe usando los ajustes finos en el espejo de riel para alinear el rayo láser con el centro del haz de luz transmitido más grande. Ahora, fije el microscopio en su lugar con pinzas.
Los pasos adicionales para evaluar la alineación del láser se pueden encontrar en el manuscrito escrito. Se deben instalar expansores de haz galileano dual para expandir el rayo láser de 300 micras 33 veces para llenar la apertura posterior del objetivo de 10 milímetros. Comience montando los cuatro lentes en soportes.
A continuación, fije las lentes al riel de modo que todas estén en el mismo eje óptico y sean exactamente ortogonales al rayo láser. Encienda el láser y ajústelo a la potencia mínima y al modo continuo. Ajuste aproximadamente la alineación del haz a través de cada lente.
Usa papel para ver el rayo. Ahora apague el láser. Aplique un obturador de seguridad al láser y retire el microscopio de la trayectoria del rayo láser.
Vuelva a encender el láser y visualícelo contra una pared cercana. Utilice el ajuste fino de las lentes para expandir el haz. A continuación, ajuste los dos últimos espejos montados cinemáticamente para alinear el haz en un círculo de brillo uniforme en la posición estimada de la apertura trasera del objetivo.
Vea el tamaño y la uniformidad del haz contra el papel. A continuación, ajuste el haz a la convergencia cero observando cómo cambia el tamaño del haz a medida que el papel se aleja de la lente. Apague el láser y active el obturador mecánico.
Deslice el microscopio de nuevo en la trayectoria del rayo láser utilizando las pinzas fijas para definir la alineación correcta. Vuelva a colocar las pinzas en el lado libre del microscopio, pero no las apriete. Ahora encienda el láser.
Retire el obturador de seguridad y gire la torreta del objetivo a una posición abierta usando papel en el escenario y el rayo láser expandido y uniforme centrado en el haz de luz transmitido desde el condensador debe ser visible. Si no está centrado, centre los haces aflojando las abrazaderas del microscopio y empujando cuidadosamente el microscopio. Ahora active el obturador de seguridad y configure el láser en modo de disparo.
Gira el objetivo 60 veces en su lugar. Ahora la imagen de la superficie se raya en una diapositiva objetivo. Retire el obturador de seguridad, active el láser de ablación y ajuste la potencia del láser para obtener el punto mínimo de ablación.
La mancha debe ser circular y estar a una distancia de cinco a 10 micras del centro de la imagen, centro, la mancha de ablación. Usando los ajustes finos del espejo de riel montado cinemáticamente para mantener el punto centrado y el perfil del haz uniforme, será necesario ajustar iterativamente el espejo montado en riel y el espejo periscopio superior. Evalúe el enfoque Z del láser moviendo el foco hacia arriba y hacia abajo sistemáticamente en pasos de una micra para activar el láser de ablación en cada paso.
Si el haz está correctamente expandido y alineado y con una convergencia correctamente ajustada, entonces debería ablarse al máximo en el enfoque de la imagen y debilitarse o no aparecer en absoluto, una micra por encima o por debajo del foco. Si el punto máximo de ablación está por encima o por debajo del foco de la imagen, entonces haga los ajustes finales al foco Z del haz expandido moviendo la lente L tres del telescopio galileo hasta que la ablación láser sea congruente con el foco de la imagen. Los nematodos se montaron en un portaobjetos personalizado y los axones se ablacionaron utilizando el sistema construido con láser exo somy y las imágenes de lapso de tiempo de la regeneración de los axones fueron muy robustas.
Usando una platina motorizada, fue posible cortar y obtener imágenes de cinco axones en cinco animales diferentes de forma rutinaria y precisa. En una sola diapositiva. El tiempo de imagen de los axones fue el factor limitante.
Alrededor del 10% de los experimentos produjeron películas time-lapse de alta calidad. El resto de los experimentos proporcionaron buenos datos, pero fueron estéticamente menos atractivos debido a los pequeños movimientos de nerviosismo del gusano que generalmente comenzaban después de cinco a ocho horas de inmovilización. Al intentar este procedimiento, siempre es importante evaluar con precisión la alineación del láser en los ejes x, y y Z.
El problema más común que tienen las personas al tratar de cortar axones es el daño colateral o la incapacidad total de cortar axones, y esto casi siempre se debe a un láser desalineado. Este sistema de ablación láser y la técnica para visualizar la regeneración de axones en c Agains le permitirán analizar de forma rutinaria el efecto de cualquier mutación genética en la regeneración de axones. NCL en contra.
Descripción general
Este artículo describe un método para armar y alinear un sistema de ablación láser para estudiar la regeneración de axones en C. elegans. La técnica permite el corte preciso de axones con daño colateral mínimo, lo que la convierte en una herramienta valiosa para investigadores en neurociencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- Biología celular
Antecedentes
- La regeneración axonal es fundamental para comprender los mecanismos de reparación neural.
- Los métodos tradicionales de corte axonal pueden causar daños colaterales significativos.
- La ablación con láser ofrece una alternativa precisa para estudiar la regeneración.
- C. elegans sirve como organismo modelo para investigar estos procesos.
Objetivo del estudio
- Demostrar el montaje y alineación de un sistema de ablación láser.
- Proporcionar un protocolo para estudiar la regeneración de axones en C. elegans.
- Destacar las ventajas de este método frente a las técnicas existentes.
Métodos Utilizados
- Montaje de los componentes láser sobre una placa de pruebas.
- Alineación del haz láser con la trayectoria óptica del microscopio.
- Uso de un láser de Clase 3B para el corte preciso de axones.
- Adquisición de imágenes con lapso de tiempo para monitorear la regeneración axonal durante 15 horas.
Resultados principales
- El sistema de ablación con láser permite cortar axones con daño mínimo.
- El alineamiento preciso es fundamental para obtener resultados óptimos.
- El método puede adaptarse para su uso en diversos organismos modelo.
- La imagen con lapso de tiempo capta eficazmente el proceso de regeneración.
Conclusiones
- Esta técnica de ablación con láser es una herramienta rentable para la investigación en neurociencia.
- Proporciona información sobre los mecanismos de regeneración axonal.
- La adaptabilidad del método lo hace adecuado para una amplia gama de sistemas biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los sistemas económicos de axotomía con láser permiten el análisis cuantitativo y escalable de los mecanismos de regeneración axonal en organismos modelo transparentes. Este enfoque apoya la validación temprana de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista en carteras de neuroregeneración, al proporcionar modelos de lesión precisos y reproducibles. La accesibilidad económica y la adaptabilidad del sistema facilitan su adopción más amplia entre equipos de descubrimiento, acelerando la investigación basada en hipótesis en la reparación neural.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite lesionar axones de manera controlada para la validación funcional de vías de regeneración.
- Apoya la desestimación mecanicista al minimizar los efectos colaterales en los tejidos durante la axotomía.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis sobre intervenciones genéticas o farmacológicas en la reparación neural.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para cuantificar fenotipos de regeneración axonal.
- Ofrece ablación de alta precisión con variabilidad mínima, lo que permite flujos de trabajo robustos de cribado.
- Permite la integración de imágenes de lapso de tiempo, posibilitando la evaluación dinámica de las respuestas regenerativas.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Ofrece una plataforma adaptable a múltiples sistemas modelo, que apoya la continuidad traslacional.
- Permite estudios comparativos entre especies para la validación preclínica de dianas neuroregenerativas.
- Facilita la alineación de los resultados fenotípicos con modelos de lesión neural relevantes para la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este sistema de axotomía láser se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la preclínica, permitiendo estudios iterativos de validación de dianas y estudios mecanicistas antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nula y la interrogación de vías en la regeneración neural.
- Cribado Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles para el regrow de axones en diferentes condiciones experimentales.
- Análisis: Permite la medición precisa de los resultados regenerativos y la comparación estadística de intervenciones.
- Investigación traslacional Facilita la adaptación a diversos organismos modelo para la validación entre especies.
- Reutilización Empresarial: Proporciona una plataforma modular y rentable para uso repetido en neurobiología&D programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los objetivos de reparación neural al permitir modelos de lesión precisos y cuantitativos.
- Valor operativo: Reduce las barreras técnicas y financieras para estudios de regeneración axonal de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción mediante la estandarización de la evaluación del fenotipo regenerativo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos en neuroregeneración mediante una validación temprana robusta.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en alineación óptica y protocolos de seguridad con láser.
- Necesita acceso a infraestructura básica de microscopía y montaje sobre placa de pruebas.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para lograr condiciones de lesión e imagen reproducibles.
- Adaptable a diversos sistemas modelo transparentes ubicados a 30–50 micrones de la superficie del tejido.
- La precisión depende de un alineado meticuloso y una calibración regular para evitar daños colaterales.
