Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar una medida del efecto de los posibles reguladores de la invasión inducida por TGF beta en un entorno tridimensional. Esto se logra primero haciendo esferoides de las células. A continuación, los PHE se incrustan en el colágeno, lo que proporciona un entorno 3D.

A continuación, se cuantifica el área invasora. Con el fin de determinar el efecto del tratamiento sobre la invasión inducida por TGF beta, los resultados muestran que los moduladores de la vía TGF-beta afectan a la propiedad invasiva de los esteroides en una matriz de colágeno 3D. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el ensayo de scratch ass, es que recapitula mejor el entorno 3D.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del medidor T, como la identificación de nuevos genes implicados en la invasión inducida por la beta del profesor. Para preparar la solución de células de metilo para el ensayo de invasión inducida por TGF beta, comience por esterilizar en autoclave seis gramos de metilcelulosa en una botella de 500 mililitros que contenga un agitador magnético. Disuelva la metilcelulosa en 250 mililitros de D-M-E-M-F 12 precalentado sin suero durante 20 minutos, agregue 250 mililitros de D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente que contenga una mezcla de suero de caballo al 10% durante la noche a cuatro grados centígrados al día siguiente, aclare la solución por centrifugación a 5, 000 G durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Transfiera la solución transparente y altamente viscosa a un nuevo almacén de tubos a cuatro grados centígrados hasta su uso para cultivar phe. Prepare una solución de células de metilo al 20% utilizando 10 mililitros de la reserva de células de metilo preparada y 40 mililitros de crecimiento. Lavado medio de las pilas MCF 10 A dos veces con PBS.

Añadir 0,1% de tripsina e incubar las células a 37 grados centígrados hasta que se desprendan todas las células. Vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento de 10 mililitros y cuente las células con un contador de células. Prepare una suspensión de 10, 000 células por mililitro en 20% de celda de metilo.

Para cada condición de prueba, agregue 100 microlitros de la suspensión de celdas a 12 pocillos de una placa de suspensión inferior redonda de 96 pocillos. Incubar las células durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, compruebe la formación de esferoides.

Los esferoides estarán listos para su uso en un plazo de uno a tres días. Prepare en hielo una solución de ocho mililitros de colágeno, un mililitro de 10 XPBS, un mililitro de hidróxido de sodio normal al 0,1 y tres gotas de ácido clorhídrico al 0,1 normal. Comprueba que el pH de la solución sea de 7,4 detectándola en tiras indicadoras de pH.

Ajuste el pH si está fuera de rango. Agregue 50 microlitros de solución de colágeno neutralizado a los pocillos de una placa de 96 pocillos, incube a 37 grados centígrados durante unos 90 minutos o hasta que el colágeno se solidifique. Para cada ligando que se va a probar, prepare una solución de ligando de colágeno de células de metilo en hielo.

Comience con un mililitro de solución de colágeno por tratamiento y agregue 20 nanogramos de TGF beta para una concentración final de cinco nanogramos por mililitro mezclado por vórtice. Luego agregue un mililitro de solución de celdas de metilo para un volumen final de dos mililitros y vórtice. Nuevamente, para incrustar un esteroide, coloque una punta de pipeta de 200 microlitros, que tenía cinco milímetros o más de la punta cortada en una pipeta de 200 microlitros.

A continuación, tome un esferoide con la pipeta. Dispense con cuidado el medio en un plato vacío mientras se asegura de que el esferoide S permanezca dentro de la punta. No suelte el émbolo.

Tome 100 microlitros de la mezcla de células metílicas de colágeno y dispense la mezcla de colágeno esferoide S en un pocillo recubierto de colágeno de 96. La placa de pocillos, llene 12 pocillos para cada condición. Deje que el colágeno se solidifique al menos 30 minutos a 37 grados centígrados y elimine las burbujas de aire con una punta de 200 microlitros.

Prepare una solución de 40 micromolares del inhibidor beta del TGF SB 4 31 542 añadiendo cuatro microlitros de solución madre SB 4 31 542 a un mililitro de D-M-E-M-F 12 que contenga 1,6% de suero de caballo. Agregue 50 microlitros de medio con inhibidor a cada pocillo después de la difusión. La concentración final del inhibidor será de 10 micromolares.

Tome imágenes del esteroide bajo el microscopio con un aumento de 40x, luego incube en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de una incubación de dos días, vuelva a tomar fotografías y mida el área del esteroide invasor abriendo una imagen de esferoide en Adobe Photoshop. Extendido y seleccione la herramienta de selección rápida.

El puntero del ratón se convertirá en un círculo con un signo más mientras arrastra el cursor sobre el esferoide. El software reconocerá los bordes del esferoide. Si se selecciona un área fuera del esteroide, excluya el área presionando la tecla alt o utilizando la herramienta de selección negativa, que es un signo negativo en la barra de herramientas.

Arrastre el cursor sobre el área seleccionada incorrectamente y el software la eliminará de la selección. Si un área dentro del esferoide no está seleccionada, el área se puede volver a incluir arrastrando mientras se presiona la barra de mayúsculas. Para trabajar con mayor precisión, ajuste el tamaño del puntero del ratón cambiando el diámetro del pincel en la barra de herramientas.

Para calcular el área de todas las selecciones activas, seleccione Medida de análisis en la barra de menús. Aparecerá una ventana de registro de mediciones que muestra el nombre del archivo y el área de selección en píxeles. Si se miden varias selecciones dentro de un esferoide, la primera línea mostrará la suma de todas las áreas y las líneas siguientes.

Enumerará los valores de las selecciones individuales. Exporte los datos a un archivo de texto y ábralo en Excel. Aquí se muestra un ejemplo del ensayo de esferoides S con MCF 10 A uno, células epiteliales de mama normales, células MCF 10 A neo T transformadas y M dos derivadas de MCF 10 CA una A.

Las células M1 mostraron solo una invasión débil sin estimulación, pero invadieron significativamente mejor después de la estimulación con TGF beta. Por el contrario, los AR transformados en la derivada M1 M dos invadieron eficientemente sin la adición de estímulos, y esto se incrementó aún más de cuatro a cinco veces. Después del tratamiento con TGF beta, las células M 4 mostraron la invasión más fuerte tanto sin TGF Beta Edition como con TGF.

Una representación gráfica de los resultados de este experimento se obtuvo utilizando Photoshop y se muestra aquí en este ejemplo, SB 4 31 5 42 se agregó a los cultivos celulares SB 4 31 5 42 un análogo de TP A e inhibidor selectivo de la actividad quinasa de la quinasa del receptor beta uno de TGF uno, así como activo en el receptor tipo uno B y activo en el receptor como quinasa siete inhibida potentemente, la invasión inducida por TGF beta de las células M1, M dos y M cuatro células indica que la invasión inducida por TGF-beta es dependiente de la quinasa del receptor TGF-beta uno. Además, la invasión basal de la PHE fue fuertemente inhibida. Una representación gráfica de los resultados de este experimento se creó de nuevo con Photoshop y se muestra aquí.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento de ARN o el aislamiento de proteínas, para responder a preguntas adicionales como qué genes se expresan o qué proteínas se expresan. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encontrar nuevos moduladores de la invasión inducida por tavita.