Name: Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a medir la invasión inducida por TGF-β en esferoides de MCF10A embebidos en gel de colágeno tridimensional. Este ensayo cuantitativo permite evaluar moduladores de la vía de señalización y supera los métodos bidimensionales tradicionales.

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Damos las gracias a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, Nueva York, EE.UU.) para los reactivos y Fred Miller (Barbara Ann Intitute Cáncer Karmanos, en Detroit, EE.UU.) para las líneas celulares.

1. Preparación de la solución Methocel (500 ml) <ol><li> Autoclave de 6 g de metilcelulosa en una botella de 500 ml con agitador magnético. </li><li> Disolver la metilcelulosa en 250 ml de DMEM/F12 sin suero precalentado (60 ° C) durante 20 min. </li><li> Añadir 250 ml de DMEM/F12 (RT), que contiene 10% de suero de caballo. Mezcla durante la noche (4 ° C). </li><li> Clara la solución mediante centrifugación (5000 g, 2 h, 4 ° C). </li><li> Tome la solución clara de alta viscosidad a un nuevo tubo (aproximadamente el 90-95% de la solución madre). </li><li> Almacena a 4 º C hasta su uso. </li></ol> 2. Cultura esferoide <ol><li> Prepare una solución al 20% metocel (10 ml metocel y 40 ml de medio de crecimiento). </li><li> Lavar las células dos veces con PBS, añadir tripsina al 0,1% y las células se incuban a 37 ° C </li><li> Resuspender las células en medio de crecimiento y el recuento de las células. </li><li> Preparar una suspensión de 10 000 células por ml en el 20% metocel. </li><li> Añadir la suspensión celular a la s 96 de fondo redondo yplacas USPENSIÓN (100 l por pocillo). </li><li> Al día siguiente, consulte la formación esferoide en las placas de suspensión. Esferoides estará listo para su uso después de 1-3 días. </li></ol> 3. Preparación de colágeno <ol><li> Prepare en el hielo una solución de colágeno de 8 ml, 1 ml de PBS 10x, 1 ml de NaOH 0,1 N y 3 gotas de HCl 0,1 N. Compruebe si el pH es de 7.4 por manchar algo de la solución en las tiras indicadoras del pH. Ajustar el pH si fuera de rango. </li><li> Añadir 50 l de solución de colágeno neutralizado en los pocillos de una placa de 96 pocillos </li><li> Se incuba a 37 ° C hasta que el colágeno se solidifica (90 min). </li><li> Prepare metocel-ligando colágeno soluciones en el hielo: para cada pipeta ligando una parte de la solución de colágeno. Agregar 20 ng por ml de TGF-β colágeno. Después de la dilución con metocel y difusión sobre las diferentes capas, la concentración final de TGF-β será de 5 ng / ml Mezclar por agitación. Añadir una parte de metocel solución. Mezclar mediante agitación. </li></ol> 4. Esferoide incrustarding <ol><li> Coloque una punta de 200 l que tiene aproximadamente 5 mm de la punta cortada, en una pipeta de 200 microlitros. Chupar un esferoide, con la pipeta y cuidadosamente dispensar el medio en un plato vacío. Ver si el esferoide se mantiene dentro de la punta. El esferoide es visible como un punto blanco. Sin soltar el émbolo, absorben 100 l colágeno metocel mezcla y vierta el esferoide en la mezcla de colágeno en el colágeno recubiertas de 96. Haga esto durante 12 esferoides para cada condición. </li><li> Deje que el colágeno se solidifican al menos 30 minutos a 37 ° C </li><li> Eliminar las burbujas de aire con una punta de 200 microlitros. </li><li> Añadir 50 l de medio con el 1,6% de suero y los inhibidores disueltos en DMSO. Para SB-431542 añadir 4 l de solución madre (10 mm) a 1 ml de medio. Después de la difusión, la concentración final de inhibidor de la será de 10 micras. TGF-β y los inhibidores mantendrá el curso del experimento. Tome fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x. </li><li> Después de 48h de la estimulación con TGF-β y / o inhibidores, tomar fotos de los esferoides en el microscopio con aumento de 40x. </li><li> Medir el área de los esferoides invasores después de 2 días y restar la zona de salida. La medición de la superficie de un esferoide: Abrir la imagen del esferoide en Adobe Photoshop Extended (figura 2A) y seleccionar la herramienta de selección rápida (Figura 2B). El puntero del ratón se transforma en un círculo con un 'plus' signo (+) (figura 2c). Mientras arrastra el cursor sobre el esferoide, Photoshop se reconocen las fronteras del esferoide. Si un área fuera del esferoide se selecciona, esta región puede ser excluido de la selección pulsando la tecla Alt o mediante el uso de la herramienta de selección negativa que se indica mediante un signo - en la barra de herramientas (). El cursor se convierte en un círculo con un "menos" signo (-) y arrastrando el cursor sobre el área seleccionada erróneamente, esta zona se retira de la selección (figura 2D). Si las regiones es necesario, pueden seleccionar múltiples pulsando el Shbotón ift. Para trabajar con mayor precisión, el tamaño del puntero del ratón se puede ajustar cambiando el diámetro del cepillo en la barra de herramientas (Figura 2E). Cuando el esferoide se selecciona todo el área de la selección se calcula a través de análisis, medida en la barra de menú, o pulsando Ctrl + Mayús + M (figura 2F). La ventana de grabación de medición aparecerá mostrando el nombre del archivo y el área de la selección en píxeles, así como otros datos (figura 2G). Si se miden varias selecciones, la primera línea muestra la suma de todas las áreas. Las medidas de las selecciones individuales se presentan en las líneas de abajo. Los datos de todas las mediciones se pueden exportar a un archivo de texto y se abre en Excel. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de la prueba esferoide con MCF10A1 (M1), las células epiteliales de mama normales, H-RAS transformó MCF10AneoT (M2) y las células derivadas de MCF10CA1a M2 (M4) se da en la figura 3. Células M1 mostró sólo la invasión débil sinestimulación, pero invadido significativamente mejor a la estimulación por TGF-β. En contraste, el RAS-transforma M1-M2 derivados invadido ya de manera eficiente sin la adición de estímulos, lo que aumentó aún más a 4.5 veces el TGF-β tratamiento. Células M4 mostraron la mayor invasión, con y sin TGF-β además. A continuación, examinó si se podría interferir con el TGF-β inducida por la invasión de este modelo esferoide el uso de inhibidores químicos. Para ello se utiliza el SB-431542, un análogo de la ATP y el inhibidor selectivo de la actividad quinasa de TβRI, así como la activina tipo IB receptor (ActRIB) y activin receptor de tipo quinasa (ALK) 7 12. Como era de esperar, SB-431542 potentemente inhibida TGF-β inducida por invasión de M1, M2 y M4 células (Fig. 4), lo que indica que el TGF-β invasión inducida es TβRI-quinasa dependiente. Además, la invasión basal de los esferoides también fue fuertemente inhibida, lo que sugiere que la invasión basal es también deindependiente de TGF-β. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo esferoide 3D. En primer lugar, las células se colocan en condiciones de no adherentes en forma de U placas suspensiones. Células aggregrate en esferoides multcellular y puede ser embebido en una matriz de colágeno. Dentro de esta matriz de colágeno, que son capaces de invadir. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cuantificación de la zona de los esferoides con Adobe Photoshop Extended. (A) La imagen del esferoide se abre en Adobe Photoshop Extendend (B) Selección de la herramienta de selección rápida (C) Al arrastrar el cursor sobre el esferoide para seleccionar el área de la esferoidal (D) La eliminación de un área wongly incluyó el uso de la negativo herramienta de selección rápida (E) Ajuste de el tamaño del pincel de la herramienta de selección rápida para seleccionar con mayor precisión la zona (F) La selección de lamedición de comando que desea grabar (G) Ejemplo de un registro de medición. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. TGF-β inducida por invasión de esferoides de forma espontánea inmortalizada MCF10A1 (M1) (A), RAS-transforma MCF10AneoT (M2 (B) y sus derivados MCF10CA1a metastásico (M4) (C). M1, M2 y M4 esferoides incrustado en colágeno fueron tratados con 5ng/ml de TGF-β durante 48 horas como se indica. AC imágenes representativas tomadas en el día de la incorporación y dos días después. invasión D relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar Adaptado de 13. <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4a"> <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4b"> Figura 4. Invasión esferoide basal y TGF-β inducida se inhibe la by SB-431542. Esferoides M1, M2 y M4 fueron incorporados en el colágeno y tratados con TGF-β 5ng/ml y / o 10 M SB-431542, como se indica. Imágenes representativas tomadas después de 2 días (A). Invasión relativa se cuantificó como la diferencia de área en el día 2 menos el día 0 (B). Los resultados se expresan como media ± DE Adaptado de 13.

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</ol>

No hay conflictos de interés.

Hemos establecido un modelo esferoide en el que MCF10A1 células y sus derivados malignos invaden en una matriz de colágeno de manera TGF-β-dependiente. En primer lugar, esferoides se forman en 96 pozos de placas de suspensión de fondo redondo, con la presencia de metilcelulosa. Por supuesto, también en forma de U poli-HEMA placas recubiertas se pueden utilizar para este propósito. La metilcelulosa es absolutamente necesario en este paso, ya que las células se mueren en la ausencia de metilcelulosa. TGF-β se añade direct...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Metil celulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Avanzada Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> tiras indicadoras del pH </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96 y la suspensión placas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC y la adhesión placas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo esferoide para medir tgf-β inducida por invasión

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β ha opuesto papel en la progresión del cáncer de mama al actuar como un supresor tumoral en la fase inicial, pero estimulando la invasión y metástasis en 1,2 más adelante. Por otra parte, el TGF-β es frecuentemente sobreexpresado en el cáncer de mama y su expresión se correlaciona con mal pronóstico y la metástasis 3,4. Los mecanismos por los que el TGF-β induce la invasión no se comprenden bien. TGF-β induce la respuesta celular a través del tipo II de TGF-β (TβRII) y el tipo I (TβRI) receptores. TGF-β sobre la inducida por la formación de complejos heteroméricos, TβRII fosforila la TβRI. El TβRI activado inicia su vía de señalización intracelular canónico por la fosforilación de Smads receptor (R-Smads), es decir, Smad2 y Smad3. Estas activa R-Smads formar complejos con heteroméricos Smad4, que se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana 5. Además de los anteriores described vía Smad, los resultados de la activación del receptor en la activación de varias otras organizaciones no Smad vías de señalización, por ejemplo la proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK) vías 6. Para estudiar el papel del TGF-β en las diferentes etapas del cáncer de mama, hemos hecho uso del sistema de células MCF10A. Este sistema se compone de manera espontánea inmortalizado células de la mama MCF10A1 (M1) del epitelio 7, el H-RAS transformó M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produce lesiones premalignas en ratones 8, y el MCF10CA1a M2 derivados (M4), que se estableció a partir xenoinjertos M2 y formas de alta carcinomas de grado con la posibilidad de metástasis en el pulmón 9. Esta serie MCF10A ofrece la posibilidad de estudiar las respuestas de las células con diferentes grados de malignidad que no están sesgados por una base genética diferente. Para el análisis de TGF-β inducida por la invasión, se generó homotípicos MCF10A células esferoide embe culturasñadido en una matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Estos modelos se parecen mucho a los tumores humanos in vivo mediante el establecimiento de un gradiente de oxígeno y nutrientes, lo que resulta en células activas y las operaciones en el exterior y las células en reposo o incluso necrosis en el interior del esferoide 10. Esferoide ensayos basados ​​también han demostrado una mejor resistencia a los medicamentos que recapitular monocapas 11. Este sistema MCF10 modelo 3D nos permitió investigar el impacto de TGF-β señalización en las propiedades de las células de mama invasivo en las diferentes etapas de malignidad.

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

El TGF-β tiene funciones opuestas en la progresión del cáncer de mama, actuando como supresor tumoral en la fase inicial, pero estimulando la invasión y la metástasis...

El objetivo general del siguiente experimento es medir el efecto de posibles reguladores de la invasión inducida por TGF beta en un entorno tridimensional. Esto se logra primero formando esferoides de las células. Luego, las EHP se incrustan en colágeno, lo que proporciona un entorno 3D.A continuación, se cuantifica el área invasiva. Con el fin de determinar el efecto del tratamiento sobre la invasión inducida por TGF beta, los resultados muestran que los moduladores de la vía TGF-beta afectan la propiedad invasiva de los esteroides en una matriz tridimensional de colágeno. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ensayo de rasgado, es que reproduce mejor el entorno tridimensional.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de T meter, como la identificación de genes novedosos implicados en la invasión inducida por teacher beta. Para preparar la solución de metilcelulosa para el ensayo de invasión inducida por TGF beta, comience por autoclavar seis gramos de metilcelulosa en un frasco de 500 mililitros que contenga un agitador magnético. Disuelva la metilcelulosa en 250 mililitros de D-M-E-M-F 12 precalentado sin suero durante 20 minutos, agregue 250 mililitros de D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente que contenga 10% de suero de caballo y mezcle durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, aclare la solución mediante centrifugación a 5.000 ×g durante dos horas a cuatro grados Celsius.Transfiera la solución clara y altamente viscosa a un nuevo tubo y almacénela a cuatro grados Celsius hasta su uso para el cultivo de phe. Prepare una solución de células al 20% metílica utilizando 10 mililitros del stock de células metílicas preparado y 40 mililitros de medio de crecimiento. Lave las células MCF 10 A dos veces con PBS.Añada tripsina al 0,1 % e incube las células a 37 grados Celsius hasta que todas las células se desprendan. Reuspenda las células en 10 mililitros de medio de crecimiento y cuente las células utilizando un contador de células. Prepare una suspensión de 10.000 células por mililitro en célula al 20 % de metilo.Para cada condición de prueba, agregue 100 microlitros de la suspensión celular a 12 pocillos de una placa de suspensión redonda de 96 pocillos. Incube las células durante la noche en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente, verifique la formación de esferoides.Los esferoides estarán listos para su uso en uno a tres días. Prepare en hielo una solución de ocho mililitros de colágeno, un mililitro de PBS 10X, un mililitro de hidróxido de sodio 0,1 N y tres gotas de ácido clorhídrico 0,1 N. Verifique que el pH de la solución sea 7,4 aplicándola sobre tiras indicadoras de pH.Ajuste el pH si está fuera del rango. Añada 50 microlitros de solución de colágeno neutralizada a los pocillos de una placa de 96 pocillos e incube a 37 grados Celsius durante aproximadamente 90 minutos o hasta que el colágeno se solidifique. Para cada ligando que se vaya a probar, prepare una solución de ligando de colágeno en metilcelulosa sobre hielo.Comience con un mililitro de solución de colágeno por tratamiento, y agregue 20 nanogramos de TGF beta para obtener una concentración final de cinco nanogramos por mililitro, mezclando mediante vortex. Luego, agregue un mililitro de solución de metilcel para obtener un volumen final de dos mililitros y mezcle con vortex. Nuevamente, para incorporar un esteroide, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros a la cual se le haya cortado cinco milímetros o más de la punta, colocándola en una pipeta de 200 microlitros.Luego aspire un sferoide S con la pipeta. Dispense cuidadosamente el medio en una placa vacía asegurándose de que el sferoide S permanezca dentro de la punta. No suelte el émbolo.Tomar 100 microlitros de la mezcla de células con colágeno metilado y dispensar la mezcla de esferoides S con colágeno en un pocillo recubierto con colágeno de una placa de 96 pocillos. Llenar 12 pocillos para cada condición. Dejar solidificar el colágeno durante al menos 30 minutos a 37 grados Celsius y eliminar las burbujas de aire con una punta de 200 microlitros.Prepare una solución de 40 micromolares del inhibidor de TGF beta SB 4 31 542 añadiendo cuatro microlitros de la solución stock de SB 4 31 542 a un mililitro de D-M-E-M-F 12 que contenga 1,6% de suero de caballo. Añada 50 microlitros de medio con inhibidor a cada pocillo tras la difusión. La concentración final del inhibidor será de 10 micromolares.Tome fotograf&iacute;as del esteroide bajo el microscopio utilizando un aumento de 40 x, luego incube en un incubador humedecido a 37 grados Celsius y 5% de di&oacute;xido de carbono. Despu&eacute;s de una incubaci&oacute;n de dos d&iacute;as, tome nuevamente fotograf&iacute;as y mida el &aacute;rea del esteroide invasivo abriendo una imagen del esferoide en Adobe Photoshop. Ampl&iacute;e y seleccione la herramienta de selecci&oacute;n r&aacute;pida.El puntero del ratón cambiará a un círculo con un signo más mientras arrastra el cursor sobre el esferoide. El software reconocerá los bordes del esferoide. Si se selecciona un área fuera del esferoide, excluya dicha área presionando la tecla alt o utilizando la herramienta de selección negativa, que es un signo negativo en la barra de herramientas.Arrastre el cursor sobre el área seleccionada incorrectamente y el software la eliminará de la selección. Si se deselecciona un área dentro del esferoide, se puede volver a incluir arrastrando mientras se mantiene presionada la barra de mayúsculas. Para trabajar con mayor precisión, ajuste el tamaño del puntero del ratón cambiando el diámetro del pincel en la barra de herramientas.Para calcular el área de todas las selecciones activas, elija análisis medir en la barra de menú. Aparecerá una ventana de registro de mediciones que mostrará el nombre del archivo y el área de la selección en píxeles. Si se miden múltiples selecciones dentro de un solo esferoide, la primera línea mostrará la suma de todas las áreas y las líneas siguientes.Se enumerarán los valores de las selecciones individuales. Exporte los datos a un archivo de texto y ábralo en Excel. A continuación se muestra un ejemplo del ensayo de esferoides S con MCF 10 A uno, células epiteliales normales de mama, células MCF 10 A neo T transformadas y M dos derivado de MCF 10 CA uno A.Las células M1 mostraron una invasión solo débil sin estimulación, pero invadieron significativamente mejor tras la estimulación con TGF beta. En contraste, el derivado M1 transformado por RA, M dos, invadió eficientemente sin la adición de estímulos, y esto aumentó aún más de cuatro a cinco veces. Tras el tratamiento con TGF beta, las células M cuatro mostraron la mayor invasión tanto sin como con la adición de TGF beta.Se obtuvo una representación gráfica de los resultados de este experimento utilizando Photoshop y se muestra aquí en este ejemplo, SB 4 31 5 42, un análogo de ATP y un inhibidor selectivo de la actividad quinasa del receptor tipo uno de TGF-beta, así como activo en el receptor tipo uno B y en la quinasa tipo receptor siete, que se añadió a los cultivos celulares. SB 4 31 5 42 inhibió potente la invasión inducida por TGF-beta en células M1, M2 y M4, lo que indica que la invasión inducida por TGF-beta depende de la quinasa del receptor tipo uno de TGF-beta. Además, se inhibió fuertemente la invasión basal de las PHE. Una representación gráfica de los resultados de este experimento fue nuevamente creada utilizando Photoshop y se muestra aquí.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento de ARN o el aislamiento de proteínas para responder preguntas adicionales, como qué genes se expresan o qué proteínas se expresan. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo encontrar nuevos moduladores de la invasión inducida por tavita.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Aquí, describimos un protocolo rápido y flexible para la formación de esferoides celulares 3D a través de la agregación celular. Se adapta fácilmente a múltiples tipos de células y es adecuado para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos los ensayos de migración celular, invasión o anoikis, y para obtener imágenes y cuantificar las interacciones célula-matriz.

Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.

Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la interacción de macrófagos primarios derivados de monocitos humanos con un esferoide tumoral en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I, con la posibilidad de comparar el impacto de las propiedades solubles y físicas del microambiente en la invasión celular.

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Aprenda a medir la invasión inducida por TGF-β en esferoides de MCF10A embebidos en gel de colágeno tridimensional. Este ensayo cuantitativo permite evaluar moduladores de la vía de señalización y supera los métodos bidimensionales tradicionales.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

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