Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca ^{2 +} Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de retina embebidos en agar para el estudio de los microcircuitos localizados en las terminales nerviosas de las células bipolares presinápticas. Esto se logra obteniendo primero la retina de un ojo de pez dorado oscuro adaptado y cortando una pequeña pieza rectangular de esta retina. A continuación, la pieza de retina se sumerge en una solución de agar transparente y de bajo punto de fusión, que luego se solidifica en una agradable solución de corte frío.

El siguiente paso es cortar el bloque sólido de agar que contiene la pieza rectangular de retina con un vibrador. El paso final es visualizar, identificar y parchear. Pinza de un terminal nervioso de células bipolares.

En última instancia, los resultados muestran la corriente de calcio presináptica y la exocitosis física sináptica con mediciones de capacitancia de membrana a partir de terminales de células bipolares atomizadas e intactas. Hola, mi nombre es Han Kim. Soy postdoc en PCO de laboratorio en Burham Institute.

Hoy voy a presentar la preparación de corte incrustado AGA de retina facial fría y demostraré la medición de capacitancia de abrazadera de parche en una sola tubería. Para comenzar este procedimiento, haga hemis en cada ojo de un pez dorado cortando uniformemente alrededor de la parte frontal del ojo con un par de tijeras de resorte. A continuación, coloque las copas de los ojos en una solución de rodajas fría sin calcio.

Si es necesario, retire la lente con pinzas. A continuación, retire el epitelio pigmentario adherido a la retina despegando la retina de la copa del ojo con un par de pinzas finas con punta en ángulo de 45 grados. Después de eso, corte el nervio óptico con un par de pinzas finas o unas tijeras de resorte.

A continuación, aplique la succión con una pipeta de pasta modificada o una pipeta de transferencia de punta grande. Para extirpar la retina, retira suavemente el resto del epitelio pigmentario adherido a la retina. La superficie de la retina limpia y sana debe parecer lisa.

A continuación, trate la retina aislada con un IDE aproximadamente un 0,03% más alto durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar el humor vítreo, tenga en cuenta que el procedimiento debe realizarse con poca luz. En el siguiente paso, corte un trozo rectangular de retina de aproximadamente dos por dos milímetros, que contiene todo el grosor de la retina eliminando los bordes curvos con una hoja de afeitar.

Luego, transfiera la pieza de retina a un recipiente pequeño lleno de solución de agar y trate de minimizar la cantidad de solución alrededor de la retina a medida que se coloca en el agar líquido. A continuación, sumerja la retina con el agar directamente en la solución de rodajas helada para solidificar el agar. A continuación, corta el bloque sólido de agar que contiene la pieza rectangular de retina en un cubo de uno por uno por un centímetro.

Pegue el bloque a la superficie de la placa de corte en la cámara de corte preco. A continuación, corte el bloque en rodajas con un grosor de 200 a 250 micras en la solución de rodajas helada. Usando un vibrato, se pueden obtener un total de cinco a 10 rebanadas, que son viables durante unas cinco a seis horas.

Después de eso, transfiera una de las rebanadas a la cámara de grabación. Coloque un marco de platino en forma de U con una rejilla de hilos de nailon en la parte superior de la rebanada. Perfundir la rebanada continuamente a razón de uno a dos mililitros por minuto con una solución de registro burbujeada con carbógeno.

En este paso, utilice una jeringa con una punta de filtro de 0,2 micras para llenar la pipeta de parche de vidrio con solución interna hasta un nivel de uno a dos centímetros de la parte posterior de la pipeta. A continuación, retire las burbujas de aire de la punta. Asegure la pipeta en el soporte.

Aplique presión positiva a la pipeta y muévala hacia el terminal objetivo con un micromanipulador mientras mueve la punta hacia abajo a través de la rebanada. Mueva la pipeta en una dirección de barrido lateral para asegurarse de que la rebanada no se arrastra junto con la punta. A continuación, mueva la punta de la pipeta alrededor del terminal para limpiar la superficie de la membrana.

Empuje la punta hacia abajo contra el borde del terminal para crear un hoyuelo y liberar la presión positiva. Si no se forma un sello de giga ohmios, aplique inmediatamente una ligera presión negativa a la pipeta. Una vez que se forma un sello de giga ohmios, cambie el amplificador de pinza de parche E PC nine al modo de grabación onsell y cambie el potencial de retención a menos 60 o menos 70 milivoltios.

Aplique la corrección rápida de capacitancia y espere a que el sello se estabilice entre cinco y 10 giga ohmios. A continuación, rompa la membrana con una succión aguda y suave. Para establecer la configuración de grabación de celda completa.

También puede usar succión bucal en lugar de una jeringa. Después de que se haya establecido toda la configuración de la celda en un terminal MB atomizado, aplique una despolarización de paso de 200 milisegundos de menos 70 a cero milivoltios. Recuerde que se aplica una onda sinusoidal de dos kilohercios en modo de pinza de voltaje antes y después de esta despolarización Para medir la capacitancia de la membrana, la despolarización permite la medición directa de las corrientes de calcio internas activadas por la apertura de canales de calcio tipo L dependientes de voltaje con una solución interna a base de cesio.

Paralelamente, se puede controlar el salto de capacitancia causado por la exocitosis dependiente del calcio de las vesículas sinápticas, lo que aumenta el área de superficie de la membrana. Si una célula bipolar MB intacta se conecta con la pipeta en el terminal sináptico, no se observarán corrientes de calcio discernibles debido a las grandes corrientes de fuga debidas al acoplamiento de la unión de brecha en los derechos de las células bipolares MB. Lo que se observa es una gran fuga hacia afuera como una corriente.

Sin embargo, todavía se puede monitorear el salto de capacitancia con un estímulo sinusoidal de alta frecuencia activado antes y después del paso de despolarización mostrado. Aquí están los ejemplos de I-R-D-I-C, imágenes de terminales de células bipolares M. Es más probable que los terminales intactos parezcan elípticos, como se muestra en A y B, mientras que C muestra el terminal mizado, que parece redondo y circular.

El método de llenado de tinte también se puede utilizar para clasificar los terminales de las celdas. Aquí están los ejemplos de las imágenes de fluorescencia de terminales de células bipolares MBI con un axón intacto en D, un axón parcialmente cortado en e y un axón completamente eliminado en F. Sus terias están indicadas por las flechas azules. Aquí se muestran las mediciones directas de las señales de imagen de calcio, exocitosis y retroalimentación inhibitoria.

En un terminal de célula bipolar MB, un aumento transitorio de la concentración de calcio en la teleria de un terminal MB se activó mediante una despolarización escalonada de pinza de voltaje en un La imagen de fluorescencia correspondiente de la teleria MB se puede ver en B.Ejemplos de depresión sináptica a corto plazo de la liberación de neurotransmisores se muestran en C.Al intentar este procedimiento, Es importante recordar que se debe minimizar la cantidad de solución alrededor de la retina a medida que se coloca en el agar del kit. Esto mejorará la unión de los latinizados del bloque de agar.