Name: Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a preparar rebanadas de retina embebidas en agar para estudiar microcircuitos en terminales nerviosos presinápticos de células bipolares. Este método permite realizar registros de patch-clamp directos en sinapsis de tipo ribbon.

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Agradecemos al Dr. Fred Rieke por su explicación del tipo de agar-integrado rebanada preparación retina cuando empezamos a usar el protocolo en nuestro laboratorio. También queremos agradecer a Lori Vaskalis de la ilustración esquemática de la visión y los Dres. Veeramuthu Balakrishnan y Cho Soyoun por sus valiosos comentarios sobre el texto y vídeo. Este trabajo fue apoyado por una beca de NEI-NIH RO1, y también fue parcialmente financiado por una beca de la Fundación de Investigación Corea financiado por el Gobierno de Corea [KRF-2008-357-E00032].

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<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
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</ol>

Nosotros no tenemos intereses opuestos a revelar.

Un paso crítico y difícil en nuestro protocolo es la transferencia de la pieza de la retina en la solución de agar (protocolo 3.4). Es necesario retirar cuidadosamente el humor vítreo y la solución de parte residual de la pieza de la retina y la transferencia sin la distorsión o curvatura. Para lograr esto, utilizamos una pequeña espátula (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta doblada para formar un ángulo de 90 °, junto con unas pinzas punta angulada (11251-35, Herramientas de Ciencias Artes), a la po...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Baja la temperatura de gelificación-agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarosa Tipo VII-A </td></tr><tr><td> Parche pipeta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 1B150F-4 </td><td> De paredes gruesas (1,5 mm de diámetro exterior) de vidrio de borosilicato </td></tr><tr><td> Extractor vertical </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Para improntas dentales </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Primavera tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> Ángulo de 45 ° pinzas de punta fina </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Hoja de afeitar </td><td> Personna </td><td></td><td> De doble filo, se limpiaron con etanol al 70% y H 2 O </td></tr><tr><td> Tubo cilíndrico </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Frascos de polietileno de 2,5 ml de muestra </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome cortadora </td><td> Leica </td><td> VT1000S o VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x de inmersión en agua objetiva </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara de control </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;monitor en blanco y negro </td></tr><tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 m </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter instrumento </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificadores disponen de emulación de software </td></tr><tr><td> Disco giratorio microscopio láser confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imágenes de células vivas después de la grabación de patch clamp de células enteras </td></tr><tr><td> Slidebook software </td><td> Inteligente de imágenes Instruments (3i) </td><td></td><td> Imágenes de adquisición de datos y análisis </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Solución tampón fosfato </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost diapositivas </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Portaobjetos de vidrio </td></tr><tr><td> Anti-fading agentes </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Láser confocal de barrido microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Imágenes de tejidos fijados </td></tr><tr><td> Espátula </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel cortadora vertical, </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorante fluorescente sensible </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A 20501MP- </td><td> Colorante fluorescente </td></tr></tbody></table>

patch-clamp mediciones de capacitancia y ca 2 + imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Los estímulos visuales se detectan y se transmite en un amplio rango dinámico de la intensidad de la luz y los cambios de frecuencia por las neuronas especializadas en la retina de los vertebrados. Dos clases de neuronas de la retina, los fotorreceptores y las células bipolares, lograr esto mediante el uso de cinta de las zonas de tipo activo, que permiten la liberación de neurotransmisores sostenido y de alto rendimiento durante largos periodos de tiempo. ON-tipo mixto de células bipolares (Mb) terminales de la retina peces de colores, que despolarizar a los estímulos luminosos y recibir caña mezclado y la entrada del cono fotorreceptores, son adecuados para el estudio de la cinta de tipo sinapsis debido a su gran tamaño (~ 10-12 m de diámetro) y de sus numerosas conexiones sinápticas lateral y recíproca con las dendritas de células amacrinas. Acceso directo a las terminales Mb células bipolares en la retina rebanadas de peces de colores con la técnica de patch-clamp permite la medición de la presináptica Ca 2 + corrientes, cambios de membrana de la capacitancia, y la inhibición recíproca retroalimentación sináptica mediada por GABA &lt;sub&gt; A y los receptores GABA C, expresada en los terminales. Presináptica mediciones de la capacitancia de la membrana de la exocitosis permitir un estudio de la plasticidad a corto plazo de la liberación de neurotransmisores excitatorios 14,15. Además, la plasticidad a corto plazo y largo plazo de la liberación de neurotransmisores inhibitorios de las células amacrinas también pueden ser investigados por las grabaciones de la inhibición por retroalimentación recíproca de llegar a la terminal Mb 21. En períodos cortos de tiempo (por ejemplo, ~ 10 s), la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca de las células amacrinas se somete a dos a dos pulsos a través de la depresión el agotamiento del pool de vesículas del GABA 11. La dinámica sináptica de microcircuitos de la retina en la capa plexiforme interna de la retina por lo tanto puede ser estudiado directamente. La técnica de corte cerebral se introdujo más de 40 años, pero sigue siendo muy útil para la investigación de las propiedades eléctricas de las neuronas, tanto en el soma celular único, dendrita o axón único, y microcircuit sináptica nivel 19. Los tejidos que son demasiado pequeños para ser pegado directamente en la cámara de corte son a menudo primero incrustado en agar (o coloca en un papel de filtro) y luego en rodajas 20, 23, 18, ​​9. En este video, que emplean la técnica de agar antes de la incorporación de la retina con peces de colores. Algunos de los terminales de células gigantes bipolar en nuestra retina rebanadas de peces de colores son axotomized (axón de corte) durante el procedimiento de corte. Esto nos permite aislar una sola entrada presináptica terminales nerviosas, porque la grabación de las terminales axotomized excluye las señales del compartimiento de la soma-dendríticas. Por otra parte, también se puede grabar desde intacta Mb células bipolares, mediante el registro de los terminales conectados a los axones que no se han reducido durante el procedimiento de corte. En general, el uso de este protocolo experimental que ayuda en los estudios de la fisiología de la retina sináptica, el análisis de microcircuitos funcionales, y la transmisión sináptica en las sinapsis de la cinta.

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Los estímulos visuales son detectados y transmitidos a través de un amplio rango dinámico de intensidades lumínicas y cambios de frecuencia por neuronas especializadas en el vertebrado...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de retina incrustados en agar para el estudio de los microcircuitos ubicados en las terminales nerviosas presinápticas de las células bipolares. Esto se logra primero obteniendo la retina de un ojo de pez dorado adaptado a la oscuridad y cortando un pequeño fragmento rectangular de esta retina. Luego, el fragmento de retina se sumerge en una solución transparente de agar de bajo punto de fusión, la cual se solidifica posteriormente en una agradable solución fría para cortes.El siguiente paso consiste en cortar el bloque sólido de agar que contiene el fragmento rectangular de retina utilizando un vibrátomo. El paso final es visualizar, identificar y realizar el registro. Fije el terminal nervioso de una célula bipolar. En última instancia, los resultados muestran la corriente de calcio pre-sináptica y la exocitosis física sináptica mediante mediciones de la capacitancia de la membrana en terminales de células bipolares atomizadas e intactas. Hola, me llamo Han Kim. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio de PCO del Instituto Burham.Hoy voy a presentar la preparación de cortes incluidos en AGA de retina fría facial y

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

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Investigación

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Neurociencia

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Este video muestra una técnica de patch-clamp de celda completa para el registro electrofisiológico de la retina de un ratón de montaje plano. Se utiliza una pipeta de vidrio delgada con un electrodo para acercarse a las células amacrinas (SAC) dentro de la retina. Después de formar un sello, se aplica succión para romper la membrana y formar la configuración de abrazadera de parche de celda completa. Finalmente, se mide el flujo de iones a través de los receptores sinápticos SAC utilizando la...

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de una retina de ratón de montaje plano

Este video muestra el procedimiento para mapear las conexiones sinápticas asegurando un corte de cerebro, colocando pipetas para lograr configuraciones de células completas y estimulando las neuronas presinápticas para registrar respuestas postsinápticas, dilucidando así la conectividad neuronal.

Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.

Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para&gt; 24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Se presenta un método que combina grabaciones de celulares-abrazadera del remiendo y la proyección de la imagen de dos fotones para registrar a transitorios de Ca2 + en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro agudo.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.

Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

Aprenda a preparar rebanadas de retina embebidas en agar para estudiar microcircuitos en terminales nerviosos presinápticos de células bipolares. Este método permite realizar registros de patch-clamp directos en sinapsis de tipo ribbon.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca^{2 +} Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

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