Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca ^{2 +} Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

El objetivo general de este procedimiento es preparar cortes de retina incrustados en agar para el estudio de los microcircuitos ubicados en las terminales nerviosas presinápticas de las células bipolares. Esto se logra primero obteniendo la retina de un ojo de pez dorado adaptado a la oscuridad y cortando un pequeño trozo rectangular de esta retina. Luego, el fragmento de retina se sumerge en una solución transparente de agar con bajo punto de fusión, la cual se solidifica posteriormente en una agradable solución fría para cortes.

El siguiente paso consiste en cortar el bloque sólido de agar que contiene el fragmento rectangular de retina utilizando un vibrátomo. El paso final es visualizar, identificar y realizar el registro. Fije el terminal nervioso de una célula bipolar.

En última instancia, los resultados muestran la corriente de calcio pre-sináptica y la exocitosis física sináptica mediante mediciones de la capacitancia de la membrana en terminales de células bipolares atomizadas e intactas. Hola, me llamo Han Kim. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio de PCO del Instituto Burham.

Hoy voy a presentar la preparación de cortes incluidos en AGA de retina fría facial y demostrar la medición de capacitancia mediante parche en un solo canal. Para comenzar este procedimiento, secciona cada ojo de un pez dorado cortando uniformemente alrededor de la parte frontal del ojo con unas tijeras de resorte. Luego coloca las copas oculares en solución fría para cortes sin calcio.

Si es necesario, retire la lente con pinzas. A continuación, retire el epitelio pigmentario adherido a la retina separando la retina del vaso ocular con una pinza fina de punta angulada a 45 grados. Después, corte el nervio óptico con una pinza fina o con tijeras de resorte.

Luego, aplique succión con una pipeta para pasta modificada o una pipeta de transferencia con punta grande. Para retirar la retina, retire suavemente el resto del epitelio pigmentario adherido a la retina. La superficie de la retina limpia y sana debe verse lisa.

Luego, trate la retina aislada con aproximadamente 0,03 % de IDE más alta durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar el humor vítreo, tenga en cuenta que el procedimiento debe realizarse con poca luz. En el siguiente paso, corte un fragmento rectangular de retina de aproximadamente dos por dos milímetros, que contenga el espesor completo de la retina, eliminando los bordes curvos con una cuchilla de afeitar.

Luego, transfiera el fragmento de retina a un recipiente pequeño lleno de solución de agar y trate de minimizar la cantidad de solución alrededor de la retina al colocarla en el agar líquido. Posteriormente, sumerja la retina con el agar directamente en la solución fría con hielo para cortar secciones, con el fin de solidificar el agar. A continuación, corte el bloque de agar sólido que contiene el fragmento rectangular de retina en un cubo de un centímetro por un centímetro por un centímetro.

Coloque el bloque sobre la superficie de la placa de corte en la cámara de corte previamente enfriada. Luego, corte el bloque en secciones de 200 a 250 micrones de grosor en la solución fría con hielo. Utilizando un vibrátomo, se pueden obtener un total de cinco a 10 secciones, que permanecen viables durante aproximadamente cinco a seis horas.

Después de eso, transfiera una de las secciones a la cámara de registro. Coloque un marco de platino en forma de U con una rejilla de hilos de nailon encima de la sección. Perfunda la sección continuamente a una velocidad de uno a dos mililitros por minuto con solución de registro burbujeada con carbógeno.

En este paso, utilice una jeringa con una punta de filtro de 0,2 micrones para llenar la pipeta de vidrio para parche con la solución interna hasta un nivel de uno a dos centímetros desde la parte posterior de la pipeta. Luego, elimine las burbujas de aire de la punta posteriormente. Fije la pipeta en el soporte.

Aplique presión positiva a la pipeta y muévala hacia el terminal objetivo utilizando un micromanipulador, al mismo tiempo que desplaza la punta hacia abajo a través del corte. Mueva la pipeta en una dirección lateral barrida para asegurarse de que el corte no se desplace junto con la punta. A continuación, mueva la punta de la pipeta alrededor del terminal para limpiar la superficie de la membrana.

Presione la punta hacia abajo contra el borde del terminal para crear un hundimiento y liberar la presión positiva. Si no se forma inmediatamente un sello de gigaohmio, aplique una ligera presión negativa a la pipeta. Una vez formado el sello de gigaohmio, cambie el amplificador de parche de bloqueo de corriente E PC nine al modo de grabación en célula íntegra y ajuste el potencial de mantenimiento a menos 60 o menos 70 milivoltios.

Aplique la corrección rápida de capacitancia y espere a que el sello se estabilice entre cinco y diez gigaohmios. Luego rompa la membrana con una succión brusca pero suave. Para establecer la configuración de registro en modo de célula completa.

También puede utilizarse succión bucal en lugar de una jeringa. Una vez establecida la configuración de célula completa sobre un terminal de MB atomizado, aplique un paso de despolarización de 200 milisegundos desde menos 70 hasta cero milivoltios. Recuerde que se aplica una onda senoidal de dos kilohercios en modo de bloqueo de voltaje antes y después de esta despolarización para medir la capacitancia de la membrana; la despolarización permite la medición directa de las corrientes de calcio entrantes activadas por la apertura de canales de calcio de tipo L activados por voltaje, utilizando una solución interna basada en cesio.

Paralelamente, es posible monitorear el salto de capacitancia causado por la exocitosis dependiente de calcio de las vesículas sinápticas, lo cual aumenta el área de superficie de la membrana. Si se realiza un parche en una célula bipolar MB intacta con la pipeta colocada sobre el terminal sináptico, no se observarán corrientes de calcio discernibles debido a las grandes corrientes de fuga provocadas por el acoplamiento de uniones en hendidura en los do derechos de las células bipolares MB. Lo que se observa es una corriente de fuga hacia afuera de gran magnitud.

Sin embargo, aún es posible monitorear el salto de capacitancia con un estímulo sinusoidal de alta frecuencia activado antes y después del paso despolarizante mostrado. A continuación se presentan ejemplos de I-R-D-I-C, imágenes de terminales de células bipolares M. Los terminales intactos tienen mayor probabilidad de presentar una forma elíptica como se muestra en A y B, mientras que C muestra el terminal mixto, que aparece redondo y circular.

El método de relleno con colorante también puede utilizarse para clasificar los terminales celulares. A continuación se muestran ejemplos de imágenes de fluorescencia de terminales de células bipolares MBI con un axón intacto en D, un axón parcialmente cortado en e y un axón completamente eliminado en F. Sus terminales están indicados por las flechas azules. Aquí se muestran mediciones directas de las señales de imagen de calcio, exocitosis y retroalimentación inhibitoria.

En un terminal de célula bipolar MB, una concentración transitoria creciente de calcio en las telerias de un terminal MB fue activada mediante un paso de despolarización por clamp de voltaje; la correspondiente imagen de fluorescencia de las telerias MB puede observarse en B. Ejemplos de depresión sináptica a corto plazo en la liberación de neurotransmisores se muestran en C. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar la cantidad de solución alrededor de la retina cuando se coloca en el agar del kit. Esto mejorará la fijación de la retina desde el bloque de agar.