Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro

El objetivo general de este procedimiento es generar cortes organotípicos a partir del mesencéfalo embrionario de neuronas en E 12.5 para el análisis de neuronas dopaminérgicas en desarrollo. Esto se logra primero diseccionando el cerebro embrionario. Luego, el cerebro se incluye en agarosa de bajo punto de fusión.

El tercer paso consiste en seccionar las fetas del cerebro utilizando un vibrátomo. El paso final es seleccionar la feta cerebral adecuada para el cultivo y la obtención de imágenes de lapso de tiempo. En última instancia, se utilizan la obtención de imágenes de lapso de tiempo y la microscopía de inmunofluorescencia para mostrar los primeros pasos de los neuronas dopaminérgicos, su comportamiento migratorio y su diferenciación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del neurodesarrollo, como seguir el comportamiento neuronal y migratorio durante el desarrollo del cerebro ventral. Un día antes de la disección, prepare un tampón de Krebs X y el medio de cultivo según el manuscrito adjunto, aproximadamente dos horas antes de la disección. Prepare 100 mililitros de agarosa de bajo punto de fusión al 4% en tampón de Krebs calentando la solución en el microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.

Luego coloque los aros en un baño de agua a 45 grados Celsius. A continuación, llene la bandeja de tampón Vibram con tampón Krebs frío con hielo. Encienda el elemento de enfriamiento y manténgalo a cuatro grados Celsius.

Después de eso, fije una cuchilla de afeitar en el portacuchillas. Prepare un escalpelo, un pincel fino y una cucharilla mini perforada para recoger las secciones en el área del vibrátomo para su posterior corte. Luego, agregue tampón de Krebs a las placas de Petri estériles y manténgalas sobre hielo.

En el área de disección, prepare tres placas de Petri estériles grandes para la disección y dos placas de Petri estériles pequeñas para acomodar un par de tijeras pequeñas, dos pares de pinzas finas, una cucharilla perforada miniatura, una pipeta de Pasteur de vidrio con la punta redondeada y cerrada por fusión, y un litro de tampón de Krebs sobre hielo. Limpie todas las herramientas de disección con etanol al 70%. A continuación, agregue medio de cultivo a los pocillos de una placa de seis pocillos y colóquela a incubar a 37 grados Celsius durante dos horas.

A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón de Krebs con penicilina estreptomicina a cada pocillo de otra placa de seis pocillos en condiciones estériles. Coloque insertos de membrana MilliCell en los pocillos. Coloque la placa de seis pocillos junto al vibrátomo para que las secciones cerebrales puedan transferirse sobre las membranas de filtro.

Inmediatamente después del corte, sacrifique una hembra de ratón preñada con embriones en la etapa E 12.5 y extraiga el útero levantándolo con un par de pinzas. Luego, utilice otro par de pinzas para separar el miometrio del útero. A continuación, coloque el útero en tampón de Krebs frío con hielo bajo el microscopio.

Utilice un par de pinzas finas para separar la pared muscular del útero, la membrana de Reichert y la vesícula vitelina visceral del embrión. A continuación, retire los embriones del útero y transfiera el embrión a una placa de Petri separada con tampón Krebs estéril. Luego, corte la cabeza de cada uno de los embriones.

Fije la cabeza perforándola a la altura del ojo con un par de pinzas finas. Utilice otro par de pinzas para retirar cuidadosamente la piel y el cráneo. Luego, levante con cuidado el cerebro y transfiéralo a una placa de Petri con tampón Krebs estéril.

Después de eso, lave los cerebros en agarosa al 4 % de punto de fusión baja. Incruste dos o tres cerebros a la vez en agarosa fresca al 4 % de punto de fusión baja, utilizando una pipeta de Pasteur con extremo redondeado pulido con llama.

Luego, coloque los recipientes de inclusión sobre hielo de la manera más uniforme posible. A continuación, levante los cerebros hasta que la base del aros se haya solidificado, para que los cerebros se asienten uniformemente y queden paralelos al fondo del bloque de aros. Cuando el aros se haya solidificado completamente, recorte el aros que rodea los cerebros.

Después de eso, pegue el bloque de aros en la platina del vibrátomo. Al pegar el bloque, asegúrese de que el lado ventral del cerebro esté paralelo a la plataforma. Seccione cortes horizontales de 300 micrones de grosor a una frecuencia de 50 hercios, con una amplitud de la hoja de 1,1 milímetros y una velocidad de 25 milímetros por segundo.

Recolecte las secciones cerebrales utilizando un pincel fino para empujar la sección hacia una cucharilla perforada miniatura. Luego, transfiéralas a un recipiente con tampón de Krebs frío estéril bajo el microscopio. Seleccione la sección que contenga tejido del mesencéfalo ventral.

En este paso, utilice una cucharilla miniatura perforada y un pincel fino para transferir las secciones del cerebro a insertos de membrana Millicell en una placa de seis pocillos con tampón de Krebs que se preparó previamente. A continuación, transfiera las membranas con las secciones a otra placa de seis pocillos con medio de cultivo, manteniendo la parte superior de las membranas seca para que las secciones cerebrales reciban el medio desde abajo y el aire desde arriba.

Coloque las secciones en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Es muy importante que las secciones se coloquen en el incubador dentro de las dos horas posteriores al primer paso de la disección. Estas secciones pueden mantenerse in vitro durante tres a cuatro días.

Después de cuatro a cinco horas de recuperación, las secciones pueden utilizarse en imágenes de lapso de tiempo justo antes de la adquisición de imágenes. Añada 1,5 microlitros de ácido ascórbico 200 milimolar al recipiente para proteger las secciones contra la fototoxicidad.

Incubar las secciones en una cámara ambiental a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Aquí se muestra una sección aguda que revela la ubicación normal de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo ventral, en la cual las proyecciones hacia el prosencéfalo aún no se han desarrollado. Después de un día en cultivo, comienzan a formarse las proyecciones hacia los prosencéfalos, como indica la flecha amarilla.

La punta de flecha blanca indica la ubicación de los cuerpos celulares mostrados con mayor magnificación en los recuadros. Aquí se observa la raíz migratoria de las neuronas marcadas con YFP. En un corte horizontal agudo, la posición inicial de las células se marca con una punta de flecha roja.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes genotípicos del mesencéfalo embrionario de ratón a E12.5 para obtener cortes viables e intactos. Es importante realizar la disección del cerebro embrionario con cuidado y, tras el corte con vibrátomo, elegir el corte cerebral adecuado para el cultivo y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.