Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro

El objetivo general de este procedimiento es generar cortes organotípicos del mesencéfalo embrionario de la neurona E 12.5 para el análisis de neuronas dopaminérgicas en desarrollo. Esto se logra diseccionando primero el cerebro embrionario. Luego, el cerebro se incrusta en aeros de bajo derretimiento.

El tercer paso es seccionar las rebanadas de cerebro con un vibrador. El paso final es elegir el trozo de cerebro adecuado para el cultivo y la obtención de imágenes de lapso de tiempo. En última instancia, las imágenes de lapso de tiempo y la microscopía de inmunofluorescencia se utilizan para mostrar los primeros pasos de las neuronas dopaminérgicas, el comportamiento migratorio y la diferenciación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del neurodesarrollo, como el seguimiento neuronal y el comportamiento migratorio durante el desarrollo ventral del cerebro. Un día antes de la disección, prepare un tampón X Krebs y el medio de cultivo de acuerdo con el manuscrito adjunto unas dos horas antes de la disección. Prepare 100 mililitros de aros de bajo punto de fusión al 4% en tampón Krebs calentando la solución en el microondas hasta que el aros se disuelva por completo.

Luego coloque los aros en un baño de agua a 45 grados centígrados. A continuación, llene la bandeja tampón Vibram con tampón Krebs helado. Encienda el elemento de enfriamiento y manténgalo a cuatro grados centígrados.

Después de eso, fije una hoja de afeitar en el portacuchillas. Prepara un bisturí, un pincel fino y una mini cuchara perforada para recoger las rodajas en la zona del vibrador para su posterior seccionado. A continuación, añada el tampón Krebs a las placas de Petri estériles y manténgalas en hielo.

En el área de disección, prepare tres placas de Petri estériles grandes para la disección y dos placas de Petri estériles pequeñas para incrustar un par de tijeras pequeñas, dos pares de pinzas finas, una mini cuchara perforada, una pipeta de pasto de vidrio pulida al fuego con una punta redonda cerrada y un litro de tampón Krebs en hielo. Limpie todas las herramientas de disección con etanol al 70%. A continuación, agregue medio de cultivo a los pocillos de una placa de seis pocillos e incube a 37 grados centígrados durante dos horas.

A continuación, agregue 1,5 mililitros de tampón Krebs con estreptomicina de penicilina a cada pocillo de otra placa de seis pocillos en condiciones estériles. Coloque insertos de membrana de milicélulas en los pocillos. Coloque la placa de seis pocillos junto al vibrato para que las rebanadas de cerebro puedan transferirse a las membranas del filtro.

Inmediatamente después del corte, sacrifique una rata hembra embarazada con embriones en la etapa E 12.5 y extraiga el útero levantándolo con un par de pinzas. Luego, use otro par de fórceps para separar el miometrio del útero. Después de eso, coloque el útero en un tampón Krebs helado bajo el microscopio.

Use un par de pinzas finas para separar la pared muscular del útero, la membrana de Riker y el saco vitelino visceral del embrión. A continuación, extraiga los embriones del útero y traslade el embrión a una placa de Petri separada con tampón Krebs estéril. A continuación, corta la cabeza de cada uno de los embriones.

Fija la cabeza perforándola a la altura de los ojos con un par de pinzas finas. Use otro par de pinzas para quitar cuidadosamente la piel y el cráneo. Luego, levante con cuidado el cerebro y transfiéralo a una placa de Petri con tampón Krebs estéril.

Después de eso, lavar los cerebros en 4%Aros de bajo punto de fusión. Incruste de dos a tres cerebros a la vez en aros frescos al 4% y de bajo punto de fusión. Usando una pipeta Pasteur con punta redonda pulida al fuego.

A continuación, coloque los platos de incrustación en hielo lo más uniformes posible. A continuación, levante los cerebros hasta que la parte inferior del aros se solidifique, para que los cerebros puedan asentarse uniformemente y estar paralelos a la parte inferior del bloque de aros. Cuando el aros se haya solidificado completamente, recorte el aros que rodea el cerebro.

Después de ese pegamento, los aros se bloquean en la etapa de muestra del vibrador. Al pegar el bloque, asegúrese de que el lado ventral del cerebro esté paralelo a la plataforma. Sección: Cortes horizontales de 300 micras de espesor a una frecuencia de 50 hercios, amplitud de hoja de 1,1 milímetros y una velocidad de 25 milímetros por segundo.

Recoja las rodajas de cerebro usando el pincel fino para empujar la rebanada a una mini cuchara perforada. Luego transfiéralos a un plato con tampón Krebs estéril y helado bajo el microscopio. Elija el corte que contenga tejido ventral del mesencéfalo.

En este paso, use una mini cuchara perforada y un pincel fino para transferir las rodajas de cerebro a insertos de membrana de células mili en una placa de seis pocillos con tampón Krebs que se preparó anteriormente. A continuación, transfiera las membranas con las rodajas a otras seis. Placa de pozo con medio de cultivo, mantenga la parte superior de las membranas secas para que las rodajas de cerebro reciban medio desde abajo y aire desde arriba.

Coloque las rodajas en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Es muy importante que las rodajas se coloquen en la incubadora dentro de las dos horas posteriores al paso inicial de la disección. Estos cortes se pueden mantener in vitro durante tres o cuatro días.

Después de cuatro a cinco horas de recuperación. Los cortes se pueden utilizar en imágenes de lapso de tiempo justo antes de la obtención de imágenes. Agregue 1,5 microlitros, 200 milimolares de ácido ascórbico al plato para proteger las rodajas contra la fototoxicidad.

Incubar las rodajas en una cámara ambiental a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante la toma de imágenes de lapso de tiempo. Aquí hay un corte agudo que muestra la ubicación normal de las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo ventral en el que las proyecciones al prosencéfalo aún no se han desarrollado. Después de un día en cultivo, las proyecciones hacia el cerebro anterior comienzan a formarse como lo indica la flecha amarilla.

La punta de flecha blanca indica la ubicación de los cuerpos celulares que se muestran con mayor aumento en los recuadros. Aquí está la raíz migratoria de las neuronas marcadas con YFP. En un corte horizontal agudo, la posición inicial de las células se marca con una punta de flecha roja.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cortes genotípicos del mesencéfalo embrionario marino E 12.5 para obtener cortes viables e intactos. Es importante realizar la disección del cerebro embrionario con cuidado y después del corte de vibrato para elegir el corte de cerebro correcto para el cultivo y la obtención de imágenes TimeLapse.