Name: A raíz de la celda de destino en E. coli Después de la infección por fagos Lambda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende a preparar bacteriófagos lambda fluorescentes para infectar E. coli y observar en tiempo real el destino celular mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite distinguir vías líticas y lisogénicas.

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Damos las gracias a Michael y Jean Feiss Sippy para la orientación en la creación de fagos y purificación. Damos las gracias a Michael Elowitz para proporcionar el software de reconocimiento celular, Schnitzcell. El trabajo en el laboratorio de Golding es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (R01GM082837), la National Science Foundation (082.265, PFC: Centro para la Física de las células vivas), la Fundación Welch (Grant Q-1759) y Ciencia Human Frontier Programa (PRG 70/2008).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Cepas bacterianas, fagos y plásmidos: La cepa LE392 es supF. Fue elegida para suprimir la mutación SAM7 en el genoma del fago (véase la Tabla 1 para detalles). Por lo tanto, lisógenos inducidos finalmente lisis y libera partículas de fagos, como células infectadas que han optado por la vía lítica. Células lisogénicas se cultivan a 30 ° C debido a la presencia de la temperatura cI sensible alelo 857 en el genoma del fago. Después de la inducción de calor, GPD-EYFP y de tipo salvaje grupo D se co-expresan a partir del genoma de λ LZ1 y la pPlate plásmido * D respectivamente. Como resultado, la cápside de la recién creada LZ2 fago λ contiene una mezcla de GPD-EYFP y proteínas GPD. Este fago mosaico es estructuralmente estable y fluorescente suficientemente para permitir la detección de fagos individuales 5. pP RE - mCherry es un plásmido utilizado para detectar elección de la pathwa lisogénicoy. El RE promotor P se activa por CII durante el establecimiento de la lisogenia 1,11. pP RE - mCherry 5 se deriva de pE-gfp 11 mediante la sustitución de las buenas prácticas agrarias con mCherry 12. Para más detalles vea nuestro trabajo anterior 5. Parámetros de Crecimiento Estado: Durante la inducción lisógeno (Sección 1), agitación suave a 180 rpm da un rendimiento bueno virus 13. El uso de la glucosa en el medio de crecimiento debe ser evitado como metabolismo de la glucosa genera productos metabólicos ácidos, y partículas maduras lambda son inestables a pH ácido 13. La adición de MgSO 4 está dirigido a la estabilización de la cápside del fago 3. Para los fagos portadores de tipo salvaje cI (en lugar de cI 857), el lisógeno puede ser inducida mediante el C daña el ADN Mitomicina agente 3. En el paso 1.3, la incubación a 37 ° C no debe ser superior a 90 minutos. Es USEF<html> ul para comprobar la densidad celular por OD 600 cada 30 min. Por un lisado buena, OD 600 cae a alrededor de 0,2 o menos, y el restante OD 600 es un resultado de los restos celulares. Incubando durante demasiado tiempo puede resultar en un rendimiento inferior fago desde el fago recién creada puede comenzar a inyectar su ADN en los restos celulares. Para obtener una banda de fago visible (por lo menos 1 x 10 11 partículas de fago) en los pasos 2,11 y 2,13, crecer al menos 500 ml de cultivo en el paso 1,2. La adición de 0,2% de maltosa en el medio de crecimiento en los Pasos 5,1 y 5,2 está dirigido a inducir la expresión de cordero, el receptor para el fago lambda adsorción 3,14. La dilución de 1000 veces en lugar de 100 veces en el paso 5.2 está dirigida a reducir el nivel de fondo de la mCherry RE reportero plásmido pP - mCherry. En el paso 5,5 para la inyección de ADN de fago de activación, 35 ° C se elige para evitar la inducción del alelo cI857 sensible a la temperatura. Fago Purificación: jove_content &quot;&gt; Las etapas de purificación de fagos (Pasos 2,1 a través de 2,11) se puede reemplazar con otros protocolos de purificación 5, pero el final a través de ultracentrifugación en gradiente de equilibrio de CsCl (Pasos 2,12 y 2,13) ​​es inevitable. Rotores basculantes son necesarios en los pasos 2,10 y 2,12 a asegurar afilados bandas de fagos visibles. Obtención de un stock de fago puro puede tardar hasta una semana, por lo que es necesario comprobar el título del fago en el camino para asegurarse de que nada va mal durante los pasos intermedios. Fago Manipulación: Durante todos los procedimientos de purificación en la Sección 2, que es crítico para manejar fago lisado suavemente para evitar la cizalladura colas de fago a partir de cabezas de fagos. Durante la infección de células en la Sección 5 (por ejemplo, a través de los pasos 5,5 5,7), también es crítica para evitar el cizallamiento de las partículas de fagos de la célula infectada. Tenga en cuenta que si el fago se cizalla de la célula infectada después de inyectar su ADN, el resultado es un &quot;oscuro&quot; infección, es decir, en lafection resultado se observó en el experimento pero el fago infecta no. Para minimizar tales problemas, se usa una punta de pipeta de ancho cuando el manejo de los fagos o de la mezcla fago / células. DAPI Pruebas: La tinción de los stock de fago con DAPI (Sección 4) es un método rápido y eficiente para comprobar la pureza de la población de fagos. También se puede utilizar para comprobar la posible degradación de un stock de fago existente en el tiempo. Para una acción pura, la co-localización de las señales de YFP y DAPI bajo el microscopio de fluorescencia debe ser cercana a 100%. Nos típicamente observar que menos del 1% de los puntos YFP no contienen DAPI (representando cápsidas sin el genoma viral), lo que indica que estas partículas no con éxito empaquetar el ADN viral o había inyectado ya su ADN en otro lugar. Menos del 1% de los puntos DAPI no contienen YFP (correspondiente a los fagos no fluorescentes). Si este no es el caso, a través de los pasos 2,12 2,14 necesidad a repetirse en OrDer para purificar de nuevo. Con respecto a los parámetros de imagen, la configuración de microscopio en el Paso 4,3 no es tan crítica como en la Sección 5 porque no a largo plazo de células vivas de imágenes se requiere aquí. Sin embargo, mantener la configuración de microscopía mismos como en la sección 5 es útil si se quiere calibrar la intensidad de fluorescencia de una partícula de fago único. Si la losa de PBS-agarosa no está muy limpio, o demasiado DAPI colorante se utiliza, algunos puntos correspondientes a DAPI ADN del fago puede estar rodeado de un &quot;halo&quot;. Si tinte DAPI se usa demasiado poco, la señal del canal de DAPI puede ser muy débil. Microscopio Sistema: Para la formación de imágenes en la sección 6, se utiliza un microscopio de epifluorescencia invertida comercial (Eclipse TE2000-E, Nikon) con un objetivo de 100x (Plan Fluo, apertura numérica 1,40, aceite de inmersión) y conjuntos de filtros estándar (Nikon). La fuente de luz fluorescente es una lámpara de arco con control de intensidad de luz. Las siguientes funciones están controladas por ordenador: x, y y z poción, campo claro y fluorescencia persianas y selección de filtro de fluorescencia. Una función de enfoque automático se requiere. De lo contrario, el enfoque puede fácilmente desviarse durante la película de lapso de tiempo (normalmente de 4 horas de duración). La capacidad de adquirir múltiples posiciones (x, y) en cada punto de tiempo es útil, ya que permite a los acontecimientos múltiples de infección en paralelo. Por lo general adquieren 8 posiciones de escena en cada película, después de un máximo de 100 eventos de infección. La cámara que utilizamos es una solución enfriada CCD con 512x512 píxeles de la cámara de 16x16 micras con un rango dinámico de 16 bits (Cascade512, Fotometría). La adquisición se realizó utilizando el software Metamorph (Molecular Devices). El microscopio debe ser colocado en una habitación con temperatura controlada, como alternativa, la platina del microscopio debe ser rodeado por una cámara de temperatura controlada. Adquisición de imágenes: En vivo imágenes de células, es fundamental para evitar la exposición innecesaria de la muestra, lo que podría conducir a la decoloración y phototoxicity. Por lo tanto, es mejor para caracterizar primero el sistema para encontrar una exposición óptima de la luz que permite la detección de fluorescencia, mientras que no conduce a un crecimiento celular excesivo blanqueamiento o inhibición. Para obtener una imagen de fluorescencia bueno, jugar con la intensidad de la luz excitante, tiempo de exposición y ganancia de la cámara. En los pasos 6.2-6.3, el intervalo de 10 min marco se elige con el fin de minimizar la exposición de la luz. En cada trama, sólo un único foco en-imagen que se necesita en contraste de fase (para el reconocimiento de células) y los canales fluorescentes (para determinar el destino de células). En el primer punto de tiempo, sin embargo, múltiples posición z imágenes a través del canal de YFP son necesarios para capturar todos los fagos que infectan en la superficie celular. El tiempo de exposición YFP en el marco inicial también puede necesitar ser mayor que el utilizado para la película de lapso de tiempo en los marcos de tiempo posteriores. Análisis de imagen: Muy cuidadosamente contar partículas de fago alrededor de la superficie de la célula en el paso 7,1. Comose señaló anteriormente, tomamos una serie de z-pilas a través del canal YFP en el Paso 6.2. Sin embargo, esto puede hacer que algunas partículas de fago fluorescentes fuera de foco, que pone a prueba el recuento. La longitud de la célula en el período de tiempo inicial se mide utilizando el software Metamorph. La longitud de la célula también se puede medir por ImageJ o otras herramientas de software. Adicionalmente, un hogar automatizado construido programa Matlab puede ser muy útil en la obtención de información tales como el cambio de fluorescencia con el tiempo a lo largo de los linajes celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNasa </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> Tampón SM </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Aguja </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Diálisis casete </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Portaobjetos del microscopio </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-transparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-transparente tubo </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refractómetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Microscopio de epifluorescencia </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipo.

a raíz de la celda de destino en<em&gt; e. coli</em&gt; después de la infección por fagos lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

El sistema comprende bacteriófago (fago) lambda y la bacteria E. coli ha servido durante mucho tiempo como un paradigma para el 1,2 determinación de la celda de destino. Después de la infección simultánea de la célula por un número de fagos, una de las dos vías se elige: lítico (virulento) o lisogénico (inactivo) 3,4. Recientemente hemos desarrollado un método para fluorescentemente etiquetado fagos individuales, y fueron capaces de examinar la decisión después de la infección en tiempo real bajo el microscopio, en el nivel de fagos individuales y las células 5. A continuación, se describe el procedimiento completo para realizar los experimentos de infección descritos en nuestro anterior trabajo 5. Esto incluye la creación de fagos fluorescentes, infección de las células, formación de imágenes en el microscopio y el análisis de datos. El fago fluorescente es un &quot;híbrido&quot;, co-expresan versiones de tipo salvaje y YFP fusión de la proteína de la cápside GPD. Un lisado de fago en bruto se obtuvo por primera vez mediante la inducción de un lisógeno de la (GPD-EYFP Enhbrado Yellow Fluorescent Protein) de fagos, que alberga un plásmido que expresa salvaje grupo D tipo. Una serie de pasos de purificación se realiza a continuación, seguido por DAPI-etiquetado y la formación de imágenes en el microscopio. Esto se hace con el fin de verificar la uniformidad, la eficacia de empaquetamiento del ADN, la señal de fluorescencia y la estabilidad estructural del stock de fago. La adsorción inicial de fagos a las bacterias se realizaron en hielo, a continuación, seguido por una breve incubación a 35 ° C para provocar la inyección de ADN viral 6. El fago / mezcla de bacterias se mueve entonces a la superficie de una losa delgada de agar nutriente, cubierto con un cubreobjetos y fotografiado bajo un microscopio de epifluorescencia. El proceso de post-infección se siguió durante 4 horas, a intervalos de 10 min. Múltiples posiciones de fase se realiza un seguimiento de tal manera que ~ 100 infecciones de células se puede rastrear en un solo experimento. En cada punto de posición y el tiempo, las imágenes se adquieren en el contraste de fase y canales fluorescentes rojas y verdes. La imagen de contraste de fase se utiliza posteriormente para la automatización cell reconocimiento, mientras que los canales fluorescentes se utilizan para caracterizar la infección por resultado: la producción de nuevos fagos fluorescente (verde) seguido por la lisis celular, o la expresión de los factores de lisogenia (rojo) seguido por el crecimiento celular y la división se reanuda. Los adquiridos time-lapse películas se procesan utilizando una combinación de métodos manuales y automatizados. Resultados Los datos de análisis en la identificación de los parámetros de infección para cada evento infección (por ejemplo, número y posiciones de infectar a los fagos), así como resultado la infección (lisis / lisogenia). Los parámetros adicionales se puede extraer si se desea.

Este artículo describe el procedimiento para la preparación de una versión marcado fluorescentemente de bacteriófago lambda, la infección de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias, tras el resultado infección bajo el microscopio, y el análisis de los resultados de la infección.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

El sistema compuesto por el bacteriófago (fago) lambda y la bacteria E. coli ha servido durante mucho tiempo como paradigma para la determinación del destino celular1,2. Tras el...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un microscopio de fluorescencia para seguir en tiempo real el sulfato en Escherichia coli tras la infección por el fago lambda. Comience creando un lisado crudo del fago lambda. Luego, purifique el fago e infecte Escherichia coli con el fago lambda en un tubo.Continúe siguiendo la evolución celular bacteriana bajo el microscopio. En última instancia, los resultados pueden mostrar en tiempo real diferentes destinos celulares en E. coli mediante la expresión de distintas proteínas fluorescentes asociadas al crecimiento o muerte celular. En general, un paso clave de este método consiste en la creación de un frente purificado y un stock etiquetado de FI.Para evitar el intercambio de plásmidos durante la preparación y purificación, optimice también los parámetros de imagen en el microscopio para permitir un crecimiento celular saludable. Inocule un cultivo nocturno de E 3 92 Lambda LZ uno PPL estrella D en medio LBM con una densidad celular de OD 600 aproximadamente 0,6 e induzca la lisis en un baño de agua a 42 grados Celsius con agitación.Continúe incubando a 37 grados Celsius hasta que sea evidente la lisis. El cultivo se vuelve transparente. Ahora agregue cloroformo al 2% y luego incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.A continuación, transfiera el lisado de fagos a botellas de 250 mililitros y centrifugue la cultura. Luego recupere el sobrenadante que contiene las partículas de fago y realice una segunda centrifugación para eliminar los residuos visibles siguiendo protocolos estándar de titulación de fagos. Mida la concentración de fago, purifíquelo mediante un gradiente de cloruro de cesio y ensaye la actividad con DPI para la preparación de placas aro.Limpie seis portaobjetos con etanol al 70%. Coloque cinco portaobjetos como se muestra y sujételos con cinta. A continuación, vierta una solución de aros al 1,5% en medio sobre los portaobjetos sujetos.Coloque la última portaobjetos encima, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. Coloque un peso encima y deje que AROS se enfríe durante aproximadamente 30 minutos. Retire las cuatro portaobjetos laterales y envuelva el bloque de portaobjetos con film transparente.Utilizando una cultivo nocturno de bacterias transformadas como inóculo, crezca un cultivo en LBMM, pelletice un mililitro de bacterias y resuspenda. Suspenda las células en 20 microlitros de LBMM frío con hielo utilizando una punta de pipeta ancha.Añada 20 microlitros de fagos purificados. Mezcle suavemente e incube primero en hielo durante 30 minutos para permitir la absorción de los fagos. Luego, incube en un baño de agua a 35 grados Celsius durante cinco minutos.Para inducir la inyección del ADN del fago, separe los agregados celulares mezclando. Diluya la mezcla de uno a diez en LBMM. Ahora coloque una placa de agaro LBM.En un cubreobjetos, agregue un microlitro de la mezcla de células y fagos. Una vez absorbido, coloque suavemente otro cubreobjetos encima. Comience adquiriendo un conjunto de imágenes a través del canal YFP para el marco temporal inicial.Tome una serie de 15 imágenes con intervalos de 200 nanómetros en el eje Z. Además, tome una única imagen enfocada a través de los canales de contraste de fase y m-cherry. Luego, adquiera una película de lapsos de tiempo del destino celular postinfección.Para minimizar el blanqueo y la fototoxicidad durante la película lapse, utilice una sola imagen en posición Z por canal por punto temporal, tomando la muestra en los canales de contraste de fase, YFP y mCherry a intervalos de 10 minutos durante aproximadamente cuatro horas. Comience el análisis de las imágenes con un recuento manual de fagos, y también registre la ubicación de los fagos y la longitud celular. En el marco temporal inicial, registre los destinos celulares como lítico, lisogénico o no infectado.También registre el tiempo de lisis y cualquier otra información deseada reproduciendo la película de lapso de tiempo, y obtenga más información cuantitativa, como el nivel de fluorescencia a lo largo del tiempo en células individuales, mediante el uso de algoritmos automatizados de reconocimiento celular y trazado de linajes. Por lo general, las placas de los fagos marcados con fluorescencia son significativamente más pequeñas que las del tipo silvestre, y las señales de YFP y DAPI de un fago purificado con éxito se colocalizan. Estos datos combinan conjuntos de imágenes de los canales de contraste de fase, YFP y mCherry, y las imágenes superpuestas correspondientes de una película de lapso de tiempo.Los fagos individuales son claramente visibles en el marco temporal inicial. Aquí se observan dos células, cada una infectada por un solo fago, y una célula infectada por tres fagos. Típicamente, se observa un número de fagos en la superficie celular, mientras que otros fagos permanecen no absorbidos.Con el tiempo, el resultado de la infección se vuelve distinguible. 80 minutos después, las dos células infectadas por fagos individuales han entrado cada una en la vía lítica. Con la producción intracelular de nuevos fagos, la célula infectada por tres fagos ha entrado en la vía lisogénica, marcada por la producción de mCherry a partir del pre-motor.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un stock purificado de fagos para infectar bacterias E. coli mediante el fago lambda, y realizar imágenes del estilo de vida en el microscopio en tiempo real.

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Investigación

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Immunology and Infection

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