A raíz de la celda de destino en

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un microscopio de fluorescencia para seguir en tiempo real el sulfato en Escherichia coli tras la infección por el fago lambda. Comience creando un lisado crudo del fago lambda. Luego, purifique el fago e infecte Escherichia coli con el fago lambda en un tubo.

Continúe siguiendo la evolución celular bacteriana bajo el microscopio. En última instancia, los resultados pueden mostrar en tiempo real diferentes destinos celulares en E. coli mediante la expresión de distintas proteínas fluorescentes asociadas al crecimiento o muerte celular. En general, un paso clave de este método consiste en la creación de un frente purificado y un stock etiquetado de FI.

Para evitar el intercambio de plásmidos durante la preparación y purificación, optimice también los parámetros de imagen en el microscopio para permitir un crecimiento celular saludable. Inocule un cultivo nocturno de E 3 92 Lambda LZ uno PPL estrella D en medio LBM con una densidad celular de OD 600 aproximadamente 0,6 e induzca la lisis en un baño de agua a 42 grados Celsius con agitación.

Continúe incubando a 37 grados Celsius hasta que sea evidente la lisis. El cultivo se vuelve transparente. Ahora agregue cloroformo al 2% y luego incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera el lisado de fagos a botellas de 250 mililitros y centrifugue la cultura. Luego recupere el sobrenadante que contiene las partículas de fago y realice una segunda centrifugación para eliminar los residuos visibles siguiendo protocolos estándar de titulación de fagos. Mida la concentración de fago, purifíquelo mediante un gradiente de cloruro de cesio y ensaye la actividad con DPI para la preparación de placas aro.

Limpie seis portaobjetos con etanol al 70%. Coloque cinco portaobjetos como se muestra y sujételos con cinta. A continuación, vierta una solución de aros al 1,5% en medio sobre los portaobjetos sujetos.

Coloque la última portaobjetos encima, teniendo cuidado de evitar burbujas de aire. Coloque un peso encima y deje que AROS se enfríe durante aproximadamente 30 minutos. Retire las cuatro portaobjetos laterales y envuelva el bloque de portaobjetos con film transparente.

Utilizando una cultivo nocturno de bacterias transformadas como inóculo, crezca un cultivo en LBMM, pelletice un mililitro de bacterias y resuspenda. Suspenda las células en 20 microlitros de LBMM frío con hielo utilizando una punta de pipeta ancha.

Añada 20 microlitros de fagos purificados. Mezcle suavemente e incube primero en hielo durante 30 minutos para permitir la absorción de los fagos. Luego, incube en un baño de agua a 35 grados Celsius durante cinco minutos.

Para inducir la inyección del ADN del fago, separe los agregados celulares mezclando. Diluya la mezcla de uno a diez en LBMM. Ahora coloque una placa de agaro LBM.

En un cubreobjetos, agregue un microlitro de la mezcla de células y fagos. Una vez absorbido, coloque suavemente otro cubreobjetos encima. Comience adquiriendo un conjunto de imágenes a través del canal YFP para el marco temporal inicial.

Tome una serie de 15 imágenes con intervalos de 200 nanómetros en el eje Z. Además, tome una única imagen enfocada a través de los canales de contraste de fase y m-cherry. Luego, adquiera una película de lapsos de tiempo del destino celular postinfección.

Para minimizar el blanqueo y la fototoxicidad durante la película lapse, utilice una sola imagen en posición Z por canal por punto temporal, tomando la muestra en los canales de contraste de fase, YFP y mCherry a intervalos de 10 minutos durante aproximadamente cuatro horas. Comience el análisis de las imágenes con un recuento manual de fagos, y también registre la ubicación de los fagos y la longitud celular. En el marco temporal inicial, registre los destinos celulares como lítico, lisogénico o no infectado.

También registre el tiempo de lisis y cualquier otra información deseada reproduciendo la película de lapso de tiempo, y obtenga más información cuantitativa, como el nivel de fluorescencia a lo largo del tiempo en células individuales, mediante el uso de algoritmos automatizados de reconocimiento celular y trazado de linajes. Por lo general, las placas de los fagos marcados con fluorescencia son significativamente más pequeñas que las del tipo silvestre, y las señales de YFP y DAPI de un fago purificado con éxito se colocalizan. Estos datos combinan conjuntos de imágenes de los canales de contraste de fase, YFP y mCherry, y las imágenes superpuestas correspondientes de una película de lapso de tiempo.

Los fagos individuales son claramente visibles en el marco temporal inicial. Aquí se observan dos células, cada una infectada por un solo fago, y una célula infectada por tres fagos. Típicamente, se observa un número de fagos en la superficie celular, mientras que otros fagos permanecen no absorbidos.

Con el tiempo, el resultado de la infección se vuelve distinguible. 80 minutos después, las dos células infectadas por fagos individuales han entrado cada una en la vía lítica. Con la producción intracelular de nuevos fagos, la célula infectada por tres fagos ha entrado en la vía lisogénica, marcada por la producción de mCherry a partir del pre-motor.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear un stock purificado de fagos para infectar bacterias E. coli mediante el fago lambda, y realizar imágenes del estilo de vida en el microscopio en tiempo real.