Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es crear constructos de tejido tridimensionales a partir de células agregadas y matriz derivada de células que puedan utilizarse para análisis funcional. Esto se logra primero mediante el fresado de un molde de policarbonato para crear pozos anulares con fondo redondeado. A continuación, se vierte poli(dimetilsiloxano) o PDMS sobre el molde de policarbonato para crear una plantilla.

Luego, la plantilla de PDMS se utiliza para formar pozos aros. El paso final consiste en sembrar células en los pozos aros para permitir que se agreguen y formen anillos de tejido cohesivos. En última instancia, este método puede emplearse para lograr la autoensamblaje celular e ingeniería de tejidos utilizando diferentes tipos celulares, y permite el análisis de la contribución de las células y de la matriz extracelular derivada de las células a la estructura y función del tejido.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros enfoques de ingeniería de tejidos es que podemos generar constructos tisulares completamente a partir de células y de la matriz extracelular que producen, más rápidamente de lo informado previamente y en un formato adecuado para el análisis mecánico. Comience fresando una pieza de policarbonato de medio pulgada de espesor para crear 15 pozos anulares con fondo redondeado y un poste central de dos milímetros de diámetro. Limpie el molde de policarbonato para eliminar cualquier residuo plástico generado durante el proceso de fresado y deje secar el molde. A continuación, mezcle PDMS en una proporción de 10 a 1 de base y agente de curado. Desgasifique la solución para eliminar todas las burbujas de aire y luego viértala en el molde de policarbonato.

Luego, desgasifique la mezcla sobre el molde nuevamente para eliminar cualquier burbuja de aire residual y cure el PDMS en un horno a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Mientras el PDMS se está curando, disuelva el 2% AROS en DMEM. Una vez curado, retire cuidadosamente la plantilla de PDMS desprendiéndola lentamente del policarbonato, luego lave el PDMS con agua y jabón y autóclavelo junto con la solución de AROS en DMEM. Ahora coloque la plantilla de PDMS autóclavada sobre una superficie nivelada y llénela con AROS fundido primero pipeteando AROS en cada uno de los moldes de los postes centrales, y luego pipeteando AROS en el espacio que los rodea.

Deje que los aros se solidifiquen durante aproximadamente 15 minutos. Luego, invierta el molde para liberar los aros del PDMS. Corte los aros excedentes alrededor de cada pozo y coloque un pozo con aro en cada pozo de una placa de 12 pozos ahora.

Agregue medio de cultivo celular alrededor del exterior del pocillo aros sin cubrir la parte superior del pocillo. Luego coloque las placas en el incubador para permitir que se equilibren mientras se preparan las células. En un 90 % de confluencia, tripsinice las células de músculo liso aórtico de rata y resuspenda.

Suspenda las células a una concentración de cinco veces 10 a la seis células por mililitro. Luego, pipetee 100 microlitros de la suspensión celular reconstituida en cada uno de los pozos de aros equilibrados. Utilice un movimiento circular para aplicar las células en cada uno de los pozos.

Coloque las placas en el incubador para que reposen sin perturbaciones durante 24 horas. Cambie el medio cada dos días aspirando el medio de alrededor del pocillo y luego rellenando cada pocillo hasta que el molde de aros esté completamente sumergido. Al finalizar el cultivo, llene una pequeña placa de Petri con PBS.

Retire cada anillo de su molde de aros deslizándolo por la parte superior del poste central. Coloque los anillos en las placas de Petri con PBS Center, colocando un anillo bajo el sistema de imágenes digitales. Utilice un software de detección de bordes para medir el grosor del anillo en cuatro posiciones: arriba, abajo, izquierda y derecha alrededor de su circunferencia.

Para realizar el ensayo de tracción uniaxial, monte una muestra anular en dos pinzas de alambre delgado. Extienda las pinzas hasta que se aplique una carga de desgarro de cinco milinewtons al anillo.

Luego ingrese el área de la sección transversal calculada a partir de las mediciones de espesor y registre la longitud de referencia. Someta el anillo a ocho ciclos previos entre la carga de desgarro y 50 kilopascales. Aplique tensión a una velocidad de 10 milímetros por minuto después del octavo ciclo previo, hasta la falla a 10 milímetros por minuto.

Para cada anillo, mida el esfuerzo último de tracción y la deformación de ruptura, y calcule el módulo tangente máximo a partir de los datos obtenidos. Además de los estudios funcionales in vitro, estos anillos de células vivas también pueden fusionarse para formar tubos de tejido. Utilice tijeras quirúrgicas para cortar los extremos de los tubos de silicona en ángulo y así crear bordes biselados, y luego autóclave los tubos de silicona mientras se están autoclavando.

Llene una placa de Petri con medio, transfiera estérilmente los soportes personalizados de tubos de silicona a una cabina de seguridad biológica y colóquelos en una placa de Petri vacía. A continuación, retire los anillos de los pozos de aros y colóquelos en la placa de Petri llena con medio. Coloque los tubos de silicona en la misma placa de Petri para humedecerlos antes de su uso.

Utilice pinzas para colocar la punta de un tubo de silicona en el centro de un anillo y deslice suavemente el anillo sobre el tubo de silicona. Deslice los anillos hasta que hagan contacto entre sí, empujándolos sucesivamente en ambas direcciones a lo largo del tubo. Una vez montados los anillos, alinee los tubos de silicona dentro de los soportes de policarbonato y atornille las dos partes del soporte entre sí.

Añada 55 mililitros de medio al plato de Petri. Cambie el medio cada tres días durante toda la duración del cultivo para eliminar los tubos de tejido. Primero, llene un plato de Petri con PBS.

Luego, libere los tubos de silicona del soporte de policarbonato y use pinzas para deslizar los tubos de tejido fuera del tubo de silicona y colocarlos en el recipiente. Cuando se realiza correctamente, las células se asientan en el fondo de los pocillos de los aros y se contraen dentro de las 24 horas posteriores al asentamiento, generando un anillo de tejido alrededor del poste central en el pocillo de Agarro. Este es un gráfico representativo de una curva de tensión-deformación obtenida a partir de una prueba de tracción uniaxial de un anillo de tejido de dos milímetros generado a partir de células musculares lisas de rata. La resistencia máxima a la tracción, el módulo máximo de tracción y los valores de deformación en la ruptura se utilizan luego para comparar las propiedades mecánicas de muestras de anillos de tejido cultivadas bajo diferentes parámetros de cultivo.

Las propiedades mecánicas de los anillos de tejido pueden controlarse modificando los parámetros de cultivo, incluyendo el número de células sembradas, la duración del cultivo, el medio de cultivo y el tipo celular utilizado. Además de las células musculares lisas de rata, las células humanas primarias de músculo liso forman anillos de tejido con resistencia a la tracción similar.

Las células madre mesenquimatosas humanas también se agregan para formar anillos, pero no fueron lo suficientemente resistentes para pruebas mecánicas. Nuestro sistema permite la fabricación de construcciones de tejido ingenierizado completamente a partir de células, simplemente sembrando células en nuestros pozos aros personalizados. Una vez que el molde inicial de policarbonato ha sido mecanizado, podemos fabricar un número ilimitado de plantillas de PDMS que luego pueden usarse para hacer los moldes, por lo que no se requiere equipo adicional.

El sistema es versátil en el sentido de que hemos utilizado varios tipos celulares diferentes en el sistema para fabricar anillos de tejido, por lo que este sistema podría emplearse potencialmente tanto en aplicaciones de ingeniería de tejidos como en estudios in vitro sobre las contribuciones de las células y la matriz extracelular a la estructura y función del tejido.