Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es crear construcciones de tejido en 3D a partir de células agregadas y matrices derivadas de células que se puedan utilizar para el análisis funcional. Esto se logra moliendo primero un molde de policarbonato para crear pozos anulares de fondo redondo. A continuación, se funde polidimetil Sloane o PDMS en el molde de policarbonato para crear una plantilla.

A continuación, se utiliza la plantilla PDMS para formar pozos de aros. El paso final es sembrar las células en pozos aros para permitir que se agreguen y formen anillos de tejido cohesivos. En última instancia, este método se puede utilizar para lograr el autoensamblaje celular y la ingeniería de tejidos utilizando diferentes tipos de células, y permite analizar la contribución de las células y la matriz extracelular derivada de células a la estructura y función de los tejidos.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros enfoques de ingeniería de tejidos es que podemos generar construcciones de tejido completamente a partir de células y la matriz extracelular que producen más rápidamente de lo que se informó anteriormente, y en un formato que es propicio para el análisis mecánico, Comience por fresar una pieza de policarbonato de media pulgada de espesor para crear 15 pozos anulares de fondo redondo con un diámetro de poste central de dos milímetros. Limpie el molde de policarbonato para eliminar cualquier residuo de plástico generado por el proceso de molienda y deje que el molde se seque. A continuación, mezcle PDMS en una proporción de 10 a uno de agente de curado base: desgasifique la solución para eliminar todas las burbujas de aire y luego viértala en el molde de policarbonato.

A continuación, desgasifique la mezcla en el molde de nuevo para eliminar las burbujas de aire restantes y cure el PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante cuatro horas mientras se disuelve el PDMS. 2%AROS en DMEM, una vez curado, retire cuidadosamente la plantilla de PDMS despegándola lentamente del policarbonato, luego lave el PDMS con agua y jabón y ámelo en autoclave junto con la solución DMEM AROS. Ahora coloque la plantilla PDMS del autoclave sobre una superficie nivelada y llénela con aros fundidos pipeteando primero los aros en cada uno de los moldes de los postes centrales y luego pipeteándolos en el espacio que los rodea.

Deje que los aros se solidifiquen durante unos 15 minutos. A continuación, invierta el molde para liberar los aros del PDMS. Corte el exceso de aros alrededor de cada uno de los pocillos y luego coloque un pozo de aros en cada pozo de una placa de 12 pocillos. Ahora.

Agregue medios de cultivo celular alrededor del exterior del pocillo aros sin cubrir la parte superior del pocillo. A continuación, coloque las placas en la incubadora para permitir que se equilibren mientras se preparan las células. Al 90% de confluencia de tripsina, células del músculo liso aórtico de rata y resus.

Suspenda las células a una concentración de cinco veces 10 a las seis células por mililitro. A continuación, pipetee 100 microlitros de la suspensión celular resuspendida en cada uno de los pocillos de aros equilibrados. Usando un movimiento circular para aplicar las celdas a cada uno de los pocillos.

Coloque las placas en la incubadora para que permanezcan inalteradas durante 24 horas. Cambie el medio cada dos días aspirando el medio alrededor del pocillo y luego vuelva a llenar cada pocillo hasta que el molde aros esté completamente sumergido. Y al final del cultivo, llene una pequeña placa de Petri con PBS.

Retire cada anillo de su molde de aros deslizándolo sobre la parte superior del poste central. Coloque los anillos en las placas de Petri con PBS Center, un anillo debajo del sistema de imágenes digitales. Utilice un software de detección de bordes para medir el grosor del anillo en cuatro posiciones, superior, inferior, izquierda y derecha alrededor de su circunferencia.

Para realizar ensayos de tracción uniaxial. Monte una muestra de anillo en dos mordazas de alambre delgado. Extienda las empuñaduras hasta que se aplique una carga de desgarro de cinco mili Newton al anillo.

A continuación, introduzca el área de la sección transversal calculada a partir de las mediciones de espesor y registre la longitud del calibre. Precicle el anillo ocho veces entre la carga de desgarro y el pascal de 50 kilos. La tensión a una velocidad de 10 milímetros por minuto después del octavo preciclo llegó al fallo a 10 milímetros por minuto.

Para cada anillo, mida la tensión de tracción final y la deformación por falla y calcule el módulo de tangente máximo a partir de los datos adquiridos. Además de los estudios funcionales in vitro, estos anillos de células vivas también pueden fusionarse para formar tubos de tejido. Use tijeras quirúrgicas para cortar los extremos de los tubos de silicona en ángulo para crear bordes biselados y luego autoclave los tubos de silicona mientras los tubos se esterilizan en autoclave.

Llene una placa de Petri con soportes de tubo de silicona personalizados esterilizados por transferencia de medios a un gabinete de bioseguridad y colóquelo en una placa de Petri vacía. A continuación, retire los anillos de los pozos de aros y colóquelos en la placa de Petri llena de medios. Coloque los tubos de silicona en la misma placa de Petri para humedecerlos antes de usarlos.

Use pinzas para colocar la punta de un tubo de silicona en el centro de un anillo y deslice suavemente el anillo sobre el tubo de silicona. Deslice los anillos para que entren en contacto entre sí empujándolos suavemente en ambas direcciones a lo largo del tubo. Una vez que se hayan montado los anillos, alinee los tubos de silicona dentro de los soportes de policarbonato y atornille las dos partes del soporte juntas.

Agregue 55 mililitros de medio a la placa de Petri. Cambie el medio cada tres días durante el cultivo para retirar los tubos de tejido. Primero, llene una placa de Petri con PBS.

A continuación, suelte los tubos de silicona del soporte de policarbonato y utilice unas pinzas para deslizar los tubos de tejido fuera del tubo de silicona y dentro del plato. Cuando se realiza correctamente, las células se asientan en el fondo de los pozos aros y se contraen dentro de las 24 horas posteriores al asiento para generar un anillo de tejido alrededor del poste central en el pozo de Agarro, este es un gráfico representativo de una curva de deformación por tensión obtenida de una prueba de tracción uniaxial de un anillo de tejido de dos milímetros generado a partir de células de músculo liso de rata. A continuación, se utilizan la resistencia a la tracción final, el módulo de tracción máximo y los valores de deformación por falla para comparar las propiedades mecánicas de las muestras de anillos de tejido cultivadas bajo diferentes parámetros de cultivo.

Las propiedades mecánicas de los anillos de tejido se pueden controlar alterando los parámetros del cultivo, incluido el número de asientos de las células, la duración del cultivo, el medio de cultivo y el tipo de célula utilizado. Además de las células musculares lisas de rata. Las células musculares lisas primarias humanas forman anillos de tejido con una resistencia a la tracción similar.

Las células madre mesenquimales humanas también se agregan para formar anillos, pero no eran lo suficientemente fuertes para las pruebas mecánicas. Nuestro sistema permite la fabricación de construcciones de tejido de ingeniería completamente a partir de células simplemente sembrando células en nuestros pozos de aros personalizados. Una vez que se ha mecanizado el molde de policarbonato inicial, podemos hacer un número ilimitado de plantillas de PDMS que luego se pueden usar para hacer los moldes, por lo que no se requiere equipo adicional.

El sistema es versátil en el sentido de que hemos utilizado varios tipos de células diferentes en el sistema para hacer anillos de tejido, por lo que este sistema podría usarse potencialmente tanto para aplicaciones de ingeniería de tejidos como para estudios in vitro de las contribuciones de las células y la matriz extracelular a la estructura y función de los tejidos.