Name: Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a crear anillos de tejido tridimensionales mediante autoensamblaje celular en pozos de agarosa. Este método permite analizar las propiedades mecánicas de células de músculo liso y su matriz extracelular en ingeniería de tejidos.

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Los autores agradecen a Neil Whitehouse (WPI, Tienda Higgins de la máquina) por su ayuda con el mecanizado CNC. Además, nos gustaría agradecer a Adriana Hera (WPI Informática y el Centro de Comunicaciones) por su ayuda en MATLAB de programación, así como bebidas Kate y José Cotnoir (WPI Académico del Centro de Tecnología) para obtener ayuda con Camtasia. Sophie Burke y Becker Jacleen (WPI Académico del Centro de Tecnología) proporciona imágenes de vídeo adicional. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R15 HL097332), la Universidad de Massachusetts Medical School-IPM iniciativa piloto de investigación, la American Heart Association (beca de investigación de pregrado a JZH), y el Instituto Politécnico de Worcester (Becas de Verano de Investigación de Pregrado a JZH e institucional la puesta en marcha de fondos para MWR).

1. La siembra de células de fabricación de moldes Comience por el fresado de una 1 / 2 "pedazo grueso de policarbonato para crear 15, de fondo redondo, pozos anular con un diámetro de poste central de 2 mm. Los canales de fresado de 6 mm de profundidad y 3,75 mm de ancho. Limpie y seque el molde de policarbonato eliminar los residuos plásticos del proceso de molienda. Mezcla de polidimetilsiloxano (PDMS) en una proporción de 10:1 (w / w) de la base de que el agente de curado, desgasificar para eliminar todas las burbujas de aire, y se vierte en el molde de policarbonato. Degas de nuevo para eliminar las burbujas restantes, y la curación en el horno a 60 ° C durante 4 horas. Una vez curado, retire con cuidado la plantilla de PDMS lentamente separándola de la de policarbonato, lavar con agua y jabón, y autoclave. También autoclave una solución de agarosa dos por ciento (w / v) disuelto en medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM). Coloque la plantilla de PDMS sobre una superficie plana y se llenan de líquido aga aumentó en un primero de agarosa pipetear en cada uno de los moldes centro de mensaje, a continuación, poniendo en el vaso espacio a su alrededor. Deje que la agarosa a solidificar (15 minutos), luego invierta el molde para liberar la agarosa de PDMS. Corte el exceso de agarosa de todo cada uno de los pozos, y el lugar de los pozos de agarosa en placas de 12 pocillos. 2. Cultivo de células y la siembra de anillo Añadir celular medios de cultivo (DMEM con FBS al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina) en el exterior del molde de agarosa, sin cubrir la parte superior de los moldes. Coloque las placas en la incubadora y les permite equilibrar durante aproximadamente 15 minutos mientras prepara las células. A 90% de confluencia, trypsinize células del músculo liso de aorta de rata (CMRE) y volver a suspender a una concentración de 5x10 6 células / ml. Pipetear 100 L de la suspensión celular en cada uno de los pozos de agarosa al anular, mediante un movimiento circular para aplicar las células a cada pocillo. contenido "&gt; Asegúrese de que los estantes incubadora están al mismo nivel, a continuación, colocar las placas en la incubadora y les permite sentarse en reposo durante 24 horas. Cambio de medio cada dos días después por aspiración de los medios de comunicación de todo el bien, y volver a llenar y cada uno hasta que el agarosa y está completamente sumergida. 3. Tejido de cosecha del anillo y la medición de espesores Al término de la cultura, retirar el anillo del molde de agarosa al deslizar sobre la parte superior del poste central. Coloque el anillo en una pequeña placa de Petri con tampón fosfato salino (PBS), el centro de la muestra, y adquirir una imagen utilizando un sistema de imagen digital. Use un programa de análisis de imágenes para la detección de bordes y medir el grosor del anillo en 4 posiciones (superior, inferior, izquierdo y derecho) alrededor de su circunferencia. Calcular el valor de grosor medio (t) para cada anillo individual, y utilizar este valor para calcular el área de sección transversal(2π (t / 2) 2). 4. Las pruebas mecánicas de los anillos Configure la máquina de tracción (Instron EPS 1000) en la posición horizontal. Adjunte una célula de carga ± 1N 1mN y la costumbre apretones de alambre delgado (creado por la flexión de alambre de acero inoxidable). Montar la muestra de anillo en las dos asas de alambre delgado. Se extienden las garras hasta que un 5 mN carga de tara se aplica a la muestra. Entrar en el área de sección transversal (calculado a partir de las mediciones de espesor) y registrar la longitud de referencia. Pre-ciclo de los anillos de 8 veces entre la carga de tara y 50 kPa tensión a una velocidad de 10 mm / min. Después de la octava pre-ciclo, tirar al fracaso a los 10 mm / min. Si no se observa como una disminución de la fuerza en un 40% de una medición a la siguiente. Para cada muestra, el anillo, medir la carga última (UTS) y la tensión y la falta calcular el máximo módulo tangente (MTM) de los datos adquiridos. 5. Tejidos como el anilloAsamblea para la fabricación de tubos de tejido Los titulares de costumbre están fabricadas en tubo de discos redondos de 5 cm de policarbonato con cortes rectangulares (2 cm x 3 cm). Perforar los agujeros roscados a través de estos discos para permitir que dos titulares que se atornillan. Autoclave de los titulares de tubo de costumbre, y luego se transfieren a la cabina de bioseguridad y el lugar en un vacío placa de Petri. Use tijeras quirúrgicas para cortar los extremos de 1,9 mm de diámetro, los tubos de silicona en un ángulo para crear bordes biselados, autoclave y luego los tubos de silicona. Mientras que los tubos están en autoclave, llenar una caja de Petri con medios de comunicación. Quitar los anillos de los pozos de agarosa y se colocan en la placa de Petri con medios de comunicación. Lugar autoclave tubos de silicona en la misma placa de Petri para humedecerlos antes de su uso. Use unas pinzas para colocar un extremo biselado de un tubo de silicona en el centro de un anillo y deslice suavemente el anillo en el tubo de silicona. Repita el procedimiento con el número deseado de riNGS. Deslice los anillos en contacto unos con otros con suavidad empujando sucesivamente en ambas direcciones a lo largo del tubo. Este método puede ser utilizado para los anillos de cosecha en un solo día en la cultura. Una vez que los anillos se montan, alinear los tubos de silicona dentro de los titulares de policarbonato y el tornillo de las dos partes del titular juntos. Coloque el soporte en una placa de Petri de 100 mm y agregar 55 ml de medio. Intercambio de los medios de comunicación cada 3 días durante la duración de la cultura. Para quitar los tubos de los tejidos, la liberación de los tubos de silicona de la titular de policarbonato y el uso de fórceps para deslizar los tubos de tejido del tubo de silicona y en una placa de Petri llena de PBS. 6. Los resultados representativos: Cuando el protocolo se realiza correctamente, las células se agregan para formar los anillos de tejido con un diámetro interior igual al diámetro del molde correspondiente mensaje dentro de las 24 horas. Los bordes del anillo son generalmente lisas y en apariencia (si es culturalmenteed en una superficie plana), son uniformes en espesor en toda la circunferencia. Los anillos de los tejidos son fáciles de manejar y pueden ser removidos de sus pozos para su posterior análisis histológico y mecánica (ver en Gwyther et al., 2011 8). Morfología de los tejidos del anillo, composición de la matriz, y las propiedades mecánicas varían en función del número y tipo de células sembradas. Los resultados representativos de los anillos de tejido a partir de diferentes tipos de células, las condiciones de siembra, y la longitud de la cultura se muestran en la Tabla 1. Dos anillos mm de diámetro creado a partir de 5x10 5 CMRE exhibió una UTS superiores a los anillos creados a partir de nuestra publicado anteriormente dos anillos mm (a partir de 6.6x10 5 CMRE). Al igual que las células de rata, las células del músculo liso (hSMC) 8 fácilmente agregados para formar tejidos anillos, que contenía una gran cantidad de colágeno después de sólo 14 días de cultivo (datos no mostrados). Las células madre mesenquimales (hMSC) también agregan y forman anillos de cohesión, pero lacked fuerza mecánica y se rompió durante las fases iniciales de las pruebas de precycling tracción uniaxial. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> El número de células </td><td> Espesor (mm) </td><td> Duración de la cultura (días) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Si no la tensión (mm / mm) </td></tr><tr><td> CMRE de los anillos </td><td> 6 </td><td> 660000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> CMRE de los anillos </td><td> 4 </td><td> 500000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> hSMC anillos </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC anillos </td><td> 3 </td><td> 750000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La tabla muestra los parámetros de la cultura y las propiedades mecánicas de dos anillos mm generados a partir de diferentes tipos de células, las concentraciones de la siembra, y la duración de la cultura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. (A) Esquema del proceso de generación de tejido del anillo. (B) Personal de policarbonato molde con fresado anular los pozos. Diámetro central de correos de 2 mm. (C) PDMS plantilla después de que se despega del molde de policarbonato. (D) anillo de tejido agregado cultivadas en un molde de agarosa con un puesto de 2 mm. (E) de diámetro Dos mm anillo de tejido en PBS. Las barras de escala = 6 mm (B, C) y 2 mm (D, E). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Trama Representante de la curva de productores de tensión-deformaciónced de ensayo de tracción uniaxial.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Recientemente, ha habido un creciente interés en la base de células o &quot;andamio-menos&quot; los métodos de la ingeniería de tejidos para hacer frente a algunas de las limitaciones de los enfoques basados ​​en los andamios de ingeniería de tejidos. Dado que células derivadas de tejidos creados a partir de las células y la matriz que producen, que sí contienen mucho mayor densidad de células, no contienen materiales exógenos, y se puede hacer todo a partir de células humanas y de las proteínas. Injertos vasculares a partir de células humanas pueden alcanzar una resistencia mecánica considerable en la ausencia de andamios exógenos (por ejemplo, la presión de ruptura 3400 mmHg en comparación con 1600 mm de Hg para la vena safena humana) 12. Aunque basadas en células tejidos vasculares muestran mejoría en la densidad celular y la resistencia mecánica, métodos de fabricación más reciente (como &quot;hoja de ingeniería con sede en&quot; 3,4,12 o &quot;bioprinting&quot; 5,13) requieren largos períodos de cultivo (&gt; 3 meses) o equipos especializados para la construcción de tejido 3D. El derivado de las células del tejido del anillo de metanfetaminaod descrito aquí permite una rápida celular de auto-ensamblaje para formar sólidas construcciones de tejido en 3D en un plazo corto de tiempo y sin el uso de equipo especializado. Este protocolo se detalla el procedimiento que hemos desarrollado la creación de 2 mm de células derivadas de diámetro interior rata anillos de músculo liso de tejidos. En el presente ejemplo, los anillos de los tejidos se cultivaron durante 7 días (luego cultivaron durante 7 días adicionales para la fusión del anillo y la formación del tubo). Sin embargo, dos ratas mm (y humanos) de las células musculares lisas anillos pueden ser retirados de los pozos y son lo suficientemente coherente para el manejo (por ejemplo, transferir a tubos de silicona) tan pronto como un día después de la siembra de células. Además, los anillos de tejido sólido con distintos diámetros interiores (2, 4 y 6 mm) se pueden crear con este método, simplemente cambiando el diámetro del poste de la original del molde de policarbonato. 8 Recientemente también modificó el diseño de moldes de policarbonato para permitir que cinco de 2 pozos mm de sembrar para ser emitidos en una sola cámara multi-y agarosa, queutiliza menos PDMS y agarosa, y cabe en un pocillo de una placa de 6 pocillos (datos no mostrados). Los cambios en el diámetro del poste, el ancho de la siembra, así, el radio de curvatura de la parte inferior redondeada, el número de pozos de la siembra, o la profundidad de los pozos de siembra pueden ser modificados con sólo cambiar las especificaciones en el archivo de CAD para el CNC mecanizado del molde de policarbonato. Finalmente, un solo molde de policarbonato puede ser utilizado para fabricar un número ilimitado de plantillas de PDMS y PDMS cada plantilla se puede limpiar, autoclave y reutilizado docenas de veces. Además de cambiar el tamaño de los anillos de tejido, hemos hecho los anillos de muchos tipos de células diferentes, incluyendo: SMC primarios de rata (aplicaciones de células, R354-05), principal SMC humanos la arteria coronaria (Lonza, CC-2583), la enseñanza primaria humanos fibroblastos dérmicos 11 (generoso regalo del doctor George Pines, WPI Departamento de Ingeniería Biomédica), fibroblastos de pulmón de rata (RFL-6, ATCC CCL-192), y las células madre mesenquimales (Lonza, PT-2501). Cada uno de estos tipos de células agregados y contratos de todo el centro de mensajes para formar anillos de tejido, aunque la organización celular, la composición de ECM, y las propiedades mecánicas de las construcciones varían para cada tipo de célula. Los parámetros de siembra para cada tipo de célula debe ser determinada empíricamente en función del tamaño de las células y su capacidad de agregar. Por lo tanto, si bien este sistema de creación de células derivadas de los anillos de tejido es extremadamente versátil, el protocolo puede necesitar pequeños ajustes para la formación de tejido óptima con diferentes tipos de células. La geometría del tejido del anillo facilita una fácil carga y evaluación de las propiedades de los materiales de tejido de ensayo de tracción uniaxial, como se describe. También hay precedentes importantes para el uso de sangre de segmentos de anillos vaso para medir la contracción vascular y la función fisiológica. Estudios preliminares indican que células derivadas de los anillos de tejido puede ser montado en un dispositivo de miografía de alambre para la medición de la respuesta farmacológica ygeneración de la fuerza contráctil (datos no mostrados). En total, la capacidad de fabricar rápidamente auto-ensamblado de anillos de células para el análisis histológico, mecánicos, fisiológicos, bioquímicos y sugiere una nueva y poderosa herramienta que puede ser útil para el modelado de la estructura del tejido vascular y la función de la salud y la enfermedad.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th></tr><tr><td> Polidimetilsiloxano (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15 a 017 CV </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Mediatech </td><td> 30 a 002-CI </td></tr><tr><td> Sistema de imagen digital </td><td> TVP Corporación </td><td> Modelo 630 </td></tr><tr><td> Máquina de ensayo uniaxial </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Software de detección de bordes </td><td> TVP Corporación </td><td> Marco 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de biomecánica e ingeniería de tejidos

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Cada año, cientos de miles de pacientes se someten a cirugía de revascularización coronaria en los Estados Unidos. 1 Aproximadamente un tercio de estos pacientes no han adecuado los buques cedentes autólogo debido a la progresión de la enfermedad o de la cosecha anterior. El objetivo de la ingeniería de tejidos vasculares es desarrollar una fuente alternativa adecuada para estos injertos. Además, la ingeniería tisular vascular pueden resultar útiles como modelos vivos vascular para estudiar las enfermedades cardiovasculares. Varios enfoques prometedores para los vasos sanguíneos de ingeniería han sido exploradas, con muchos estudios recientes centrados en el desarrollo y el análisis de los métodos basados ​​en células. 2-5 Aquí, presentamos un método para rápidamente se auto-ensamblan las células en los anillos de tejido 3D que se pueden utilizar en modelo in vitro para los tejidos vasculares. Para ello, las suspensiones de células de músculo liso se siembran en pocillos de fondo redondo anular agarosa. Las propiedades no adhesivo de la agarosa permitir ªlas células e para resolver, agregar y contrato de alrededor de un poste en el centro del pozo para formar un anillo de tejido cohesionado 6,7. Estos anillos pueden ser cultivadas durante varios días antes de la cosecha para la mecánica, el análisis fisiológicos, bioquímicos o histológicos. Hemos demostrado que estos anillos de tejidos derivados de células rendimiento a 100-500 kPa fuerza a la tracción 8, que excede el valor reportado para otras construcciones de ingeniería tisular vascular cultivadas por períodos similares (&lt;30 kPa). 9,10 Nuestros resultados demuestran que la célula robusta derivados de la generación de tejido vascular del anillo se puede lograr en un corto período de tiempo, y ofrece la oportunidad para la evaluación directa y cuantitativa de los aportes de las células y la matriz de células derivadas de Desarrollo Limpio (MDL) de la estructura del tejido vascular y la función.

Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Cada año, cientos de miles de pacientes se someten a una cirugía de derivación de la arteria coronaria en los Estados Unidos.1 Aproximadamente un tercio de estos pacientes...

El objetivo general de este procedimiento es crear constructos de tejido tridimensionales a partir de células agregadas y matriz derivada de células que puedan utilizarse para análisis funcional. Esto se logra primero mediante el fresado de un molde de policarbonato para crear pozos anulares con fondo redondeado. A continuación, se vierte poli(dimetilsiloxano) o PDMS sobre el molde de policarbonato para crear una plantilla.Luego, la plantilla de PDMS se utiliza para formar pozos aros. El paso final consiste en sembrar células en los pozos aros para permitir que se agreguen y formen anillos de tejido cohesivos. En última instancia, este método puede emplearse para lograr la autoensamblaje celular e ingeniería de tejidos utilizando diferentes tipos celulares, y permite el análisis de la contribución de las células y de la matriz extracelular derivada de las células a la estructura y función del tejido.La principal ventaja de esta técnica frente a otros enfoques de ingeniería de tejidos es que podemos generar constructos tisulares completamente a partir de células y de la matriz extracelular que producen, más rápidamente de lo informado previamente y en un formato adecuado para el análisis mecánico. Comience fresando una pieza de policarbonato de medio pulgada de espesor para crear 15 pozos anulares con fondo redondeado y un diámetro del poste central de dos milímetros. Limpie el molde de policarbonato para eliminar cualquier residuo plástico generado durante el proceso de fresado y deje secar el molde. A continuación, mezcle PDMS en una proporción de 10 a 1 de base agente de curado. Desgasifique la solución para eliminar todas las burbujas de aire y luego viértala en el molde de policarbonato.Luego, desgasifique la mezcla sobre el molde nuevamente para eliminar cualquier burbuja de aire residual y cure el PDMS en un horno a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Mientras el PDMS se está curando, disuelva el 2 %AROS en DMEM. Una vez curado, retire cuidadosamente la plantilla de PDMS desprendiéndola lentamente del policarbonato, luego lave el PDMS con agua y jabón y autóclavelo junto con la solución de DMEM con AROS. Ahora coloque la plantilla de PDMS autoclavada sobre una superficie nivelada y llénela con AROS fundido primero pipeteando AROS en cada uno de los moldes de los postes centrales, y luego pipeteando AROS en el espacio que los rodea.Deje que los aros se solidifiquen durante aproximadamente 15 minutos. Luego, invierta el molde para liberar los aros del PDMS. Corte los aros excedentes alrededor de cada pocillo y coloque un pocillo de aro en cada pocillo de una placa de 12 pocillos ahora.Agregue medio de cultivo celular alrededor del exterior del pocillo aros sin cubrir la parte superior del pocillo. Luego coloque las placas en el incubador para permitir su equilibrio mientras se preparan las células. En un 90 % de confluencia, tripsinice las células de músculo liso aórtico de rata y resuspenda.Suspenda las células a una concentración de cinco veces 10 a la seis células por mililitro. Luego, pipetee 100 microlitros de la suspensión celular reconstituida en cada uno de los pozos de las placas equilibradas. Utilice un movimiento circular para aplicar las células en cada uno de los pozos.Coloque las placas en el incubador para que reposen sin perturbaciones durante 24 horas. Cambie el medio cada dos días aspirando el medio de alrededor del pocillo y luego rellenando cada pocillo hasta que el molde de aros quede completamente sumergido. Al finalizar el cultivo, llene una pequeña placa de Petri con PBS.Retire cada anillo de su molde de aros deslizándolo por la parte superior del poste central. Coloque los anillos en las placas de Petri con PBS Center, colocando un anillo bajo el sistema de imágenes digitales. Utilice un software de detección de bordes para medir el grosor del anillo en cuatro posiciones: arriba, abajo, izquierda y derecha alrededor de su circunferencia.Para realizar un ensayo de tracción uniaxial. Monte una muestra anular en dos pinzas de alambre delgado. Extienda las pinzas hasta que se aplique una carga de desgarro de cinco milinewtons al anillo.Luego ingrese el área de la sección transversal calculada a partir de las mediciones de espesor y registre la longitud de referencia. Precicle el anillo ocho veces entre la carga de desgarro y 50 kilopascales. Aplique tensión a una velocidad de 10 milímetros por minuto después del octavo preciclo, hasta la falla a 10 milímetros por minuto.Para cada anillo, mida el esfuerzo último a la tracción y la deformación de ruptura, y calcule el módulo tangente máximo a partir de los datos obtenidos. Además de los estudios funcionales in vitro, estos anillos con células vivas también pueden fusionarse para formar tubos de tejido. Utilice tijeras quirúrgicas para cortar los extremos de los tubos de silicona en ángulo y así crear bordes biselados, y luego autoclave los tubos de silicona mientras se están autoclavando.Llene una placa de Petri con medio, transfiera estérilmente los soportes personalizados de tubos de silicona a una cabina de seguridad biológica y colóquelos en una placa de Petri vacía. A continuación, retire los anillos de los pozos de aros y colóquelos en la placa de Petri llena con medio. Coloque los tubos de silicona en la misma placa de Petri para humedecerlos antes de su uso.Utilice pinzas para colocar la punta de un tubo de silicona en el centro de un anillo y deslice suavemente el anillo sobre el tubo de silicona. Deslice los anillos hasta que hagan contacto entre sí, empujándolos sucesivamente en ambas direcciones a lo largo del tubo. Una vez montados los anillos, alinee los tubos de silicona dentro de los soportes de policarbonato y atornille las dos partes del soporte entre sí.Añada 55 mililitros de medio al plato de Petri. Cambie el medio cada tres días durante toda la duración del cultivo para eliminar los tubos de tejido. Primero, llene un plato de Petri con PBS.Luego, suelte los tubos de silicona del soporte de policarbonato y use pinzas para deslizar los tubos de tejido fuera del tubo de silicona y colocarlos en el recipiente. Cuando se realiza correctamente, las células se asientan en el fondo de los pocillos de los aros y se contraen dentro de las 24 horas posteriores al asentamiento, generando un anillo de tejido alrededor del poste central en el pocillo de Agarro. Este es un gráfico representativo de una curva de tensión-deformación obtenida a partir de una prueba de tracción uniaxial de un anillo de tejido de dos milímetros generado a partir de células de músculo liso de rata. La resistencia máxima a la tracción, el módulo máximo de tracción y los valores de deformación en la ruptura se utilizan luego para comparar las propiedades mecánicas de muestras de anillos de tejido cultivadas bajo diferentes parámetros de cultivo.Las propiedades mecánicas de los anillos de tejido pueden controlarse modificando los parámetros de cultivo, incluyendo el número de células sembradas, la duración del cultivo, el medio de cultivo y el tipo celular utilizado. Además de las células musculares lisas de rata, las células humanas primarias de músculo liso forman anillos de tejido con una resistencia a la tracción similar.Las células madre mesenquimatosas humanas también se agregan para formar anillos, pero no fueron lo suficientemente resistentes para pruebas mecánicas. Nuestro sistema permite la fabricación de construcciones de tejido ingenierizado completamente a partir de células, simplemente sembrando células en nuestros pozos aros personalizados. Una vez que el molde inicial de policarbonato ha sido mecanizado, podemos fabricar un número ilimitado de plantillas de PDMS que luego pueden usarse para hacer los moldes, por lo que no se requiere equipo adicional.El sistema es versátil en el sentido de que hemos utilizado varios tipos celulares diferentes en el sistema para fabricar anillos de tejido, por lo que este sistema podría utilizarse potencialmente tanto para aplicaciones de ingeniería de tejidos como para estudios in vitro de las contribuciones de las células y la matriz extracelular a la estructura y función del tejido.

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Este protocolo describe una metodología de bioimpresión que utiliza un sistema de depósito robótico automatizado que incorpora señales de guía topográficas grabadas con la deposición de precisión de una célula que contiene biotinta de hidrogel. Las células impresas se entregan directamente a las características grabadas y son capaces de detectar y orientarse con ellas.

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

vasos sanguíneos de ingeniería escalables mejorarían aplicabilidad clínica. El uso de guías fácilmente considerables 3D-impreso, anillos de músculo liso vascular se crearon y se apilan en una forma tubular, formando un injerto vascular. Los injertos pueden ser de un tamaño para cubrir la gama de dimensiones de las arterias coronarias humanas, simplemente cambiando el tamaño de la guía de 3D-impreso.

El escalado de Engineered injertos vasculares Usando 3D Impreso guías y el método de anillo de apilamiento

Este protocolo describe una plataforma para la fabricación de anillos de tejido automático montado en tamaños variables utilizando un molde de plástico modificado para requisitos particulares impresa en 3D. Negativos PDMS se curan en el molde impreso en 3D; agarosa se echa entonces en los negativos PDMS curados. Las células se siembran en los pozos de agarosa resultante donde agregan en anillos de tejido.

Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D

Aquí presentamos un método rápido, fácil y de bajo costo para la fabricación de moldes de polidimetilsiloxano personalizadas que pueden utilizarse para la producción de tejidos de ingeniería base de hidrogel con geometrías complejas. Asimismo, se describen los resultados de evaluaciones mecánicas e histológicos realizadas en ingeniería tejidos cardiacos producidos mediante esta técnica.

Custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser

Demostrar un método novedoso para la construcción de un conjunto de (3D) 3 dimensiones basadas en celdas individuales sin un andamio artificial.

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Aquí se presenta un protocolo para generar tejidos conectivos diseñados para un cultivo paralelo de 48 tejidos en una placa de múltiples pocillos con polos dobles, adecuado para estudios mecanicistas, modelado de enfermedades y aplicaciones de detección. El protocolo es compatible con fibroblastos de diferentes órganos y especies y se ejemplifica aquí con fibroblastos cardíacos primarios humanos.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Aquí, demostramos un modelo de organoide de tres pasos (expansión bidimensional [2D], estimulación 2D, maduración tridimensional [3D]) que ofrece una herramienta prometedora para la investigación fundamental de tendones y un posible método sin andamios para la ingeniería de tejidos tendinosos.

Demostración de cultivo de láminas celulares autoensambladas y generación manual de un organoide similar a un tendón/ligamento en 3D mediante el uso de fibroblastos dérmicos humanos

Aprende a crear anillos de tejido tridimensionales mediante autoensamblaje celular en pozos de agarosa. Este método permite analizar las propiedades mecánicas de células de músculo liso y su matriz extracelular en ingeniería de tejidos.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

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