Name: Los análisis morfométricos de las Secciones de retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Aprenda a realizar análisis morfométricos de la retina, incluyendo el grosor de la capa nuclear interna y la cuantificación de células ganglionares. Estas técnicas facilitan el estudio de patologías retinianas y neurodegenerativas.

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El trabajo en la investigación del ojo en este laboratorio con el apoyo de la Fundación Panamericana de la Salud Auxiliar, Azalea (1972) Fondo de Dotación y el Fondo de Pequeños Proyectos HKU (20097176185).

1. Instrumentos Microscopio, Nikon Investigador de música, MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc. 2. Preparación <ol><li> Antes de trabajar en cualquier análisis morfométricos, cada muestra de retina es seccionadas a 4 micras de espesor y se somete a la tinción H &amp; E. </li><li> La sección de la retina se divide en 4 regiones: región periférica superior, la región central superior, la región periférica inferior, y la región central inferior. </li><li> Después de definir las regiones, una imagen de cada región se adquiere en las ampliaciones 10x40 bajo el microscopio de haz brillante de Nikon. </li><li> Ahora, estamos listos para analizar la morfometría de la retina. </li></ol> 3. Medición de espesor INL <ol><li> Cuatro mediciones del espesor del INL en cada región se midieron. Cuatro líneas se extraerán perpendicularmente desde la línea de base del contorno de la frontera exterior de la INL. </li><li>Abra el software llamado Investigador estéreo y elegir el lente de 40x de la barra de herramientas principal. </li><li> Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar. </li><li> Elija el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal y pulse el botón "Mover automático". </li><li> Haga clic derecho en la ventana de localización, y seleccione "Simple Haga clic en localización". </li><li> Dibuje la curva de nivel a lo largo del borde interior de la INL. </li><li> Cuando el dibujo se hace, haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Contorno Open End". </li><li> Seleccione un marcador en la barra de herramientas de marcadores y añadir marcadores en los puntos de unión. </li><li> Después de añadir todos los marcadores, deseleccionar el icono de marcador en la barra de herramientas de marcadores. </li><li> Coloque un cursor en el centro de uno de los marcadores. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"><ol start="11"><li> Seleccione "QuickMedir ángulo "en la pestaña" Herramientas ". </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"><ol start="12"><li> Haga clic derecho en la ventana de localización y anular la selección del "continuo" opción. </li><li> Medir un ángulo por primera haciendo clic en el centro de un marcador, que es adyacente al marcador seleccionado para un extremo del segmento de línea. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"><ol start="14"><li> A continuación, mueva el ratón hacia el centro de la marca en cuestión y haga clic de nuevo. </li><li> Extender la línea de banda de goma de la frontera exterior de la INL. </li><li> Ajuste el ángulo de hasta 90 ° se alcanza. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"><ol start="17"><li> Clic izquierdo en la posición deseada. Un cuadro de diálogo que muestra una medición de ángulo aparecerá justo después del clic. </li><li> Pulse el botónTecla "Enter" mientras se mantiene el ratón todavía. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"><ol start="19"><li> Haz clic izquierdo en la ventana de localización de manera que se dibuja una línea desde un extremo hasta el final elegido nuevo. </li><li> Haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Contorno Open End". </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3377/3377fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"><ol start="21"><li> Dibujar las otras líneas en las posiciones diferentes en la misma forma como se ha descrito antes. </li><li> Después de dibujar todas las líneas, seleccionar el modo de edición y cambiar el nombre de los 4 segmentos de línea en consecuencia. </li><li> Cuatro mediciones se puede obtener pulsando el botón "Medición de contorno" botón. </li><li> Seleccione estas 4 medidas y pegarlos en una hoja de cálculo haciendo clic en "Copiar al portapapeles". </li><li> Seleccione "Guardar como" en la pestaña "Archivo". Los datos de seguimiento se pueden guardar como un archivo de datos. </li></ol><ol><li> Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar. </li><li> Elija el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal. </li><li> Dibuja una línea de contorno a lo largo de la frontera de la capa de fibras nerviosas (NFL). </li><li> Poner fin a la búsqueda en la "Contorno Open End" opción. </li><li> En cada extremo, añadir un marcador en la punta de la línea y otro en la posición cerca de la punta. </li><li> Desactive el icono de marcador en la barra de herramientas de marcadores. </li><li> Coloque un cursor en el centro de los marcadores en la punta. </li><li> Seleccione "Ángulo Medida rápida" en la pestaña "Herramientas". </li><li> Haga clic derecho en la ventana de localización y anular la selección del "continuo" opción. </li><li> Ajuste las líneas de banda de goma y medir un ángulo de 90 °. </li><li> Pulse la tecla "Enter" después de un cuadro de diálogo está elevado. </li><li> Izquierda haga clic en tél rastreo ventana de modo que una nueva línea puede ser extendido perpendicularmente desde la punta. </li><li> Dibuje otra línea nueva en la misma manera en el otro extremo. </li><li> Dos límites son creados dentro de la cual el número de CGR se cuenta. </li><li> Elija una frontera como una línea de exclusión que los toques de células no se cuenta. </li><li> Seleccione un tipo de marcador y colocar uno a cada célula viva. </li><li> Seleccione otro tipo de marcador de las células muertas. </li><li> El número de cada tipo de marcadores colocados se mostrará junto al icono de marcador en consecuencia en la barra de herramientas de marcadores. </li><li> Seleccione el modo de edición y recoger la línea de base del contorno. Haga clic derecho en la ventana de localización y cambiar el nombre de la línea. </li><li> La longitud de la línea de base del contorno puede ser obtenido mediante prensado "Medida del contorno" botón. </li><li> El número de las células pueden ser expresados ​​por mm de la longitud. </li><li> Seleccione "Guardar como" en la pestaña "Archivo". Lala localización y los datos de marcadores se pueden guardar como un archivo de datos. </li></ol> 5. La medición del tamaño de la celda de una celda CGR <ol><li> Seleccione "Abrir imagen" en la pestaña "Archivo". Elija una imagen de una región que desee la retina que le gustaría analizar. </li><li> Ampliar en una célula viva y elegir el tipo de línea de contorno del cuadro de lista desplegable de la barra de herramientas principal. </li><li> Dibujar una línea de contorno a lo largo de la circunferencia de la célula. </li><li> Casi al final, haga clic derecho en la ventana de localización y seleccionar "End contorno de cerca". </li><li> El área de la celda se muestra con el tema del área en el cuadro de diálogo de medición Contour. </li></ol>

<ol><li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-D-Aspartate+%28NMDA%29%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9CInduced+Apoptosis+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)â€“Induced Apoptosis in Rat Retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40, 2391-2397 (1999).</li>
<li>Lam, T. T., Abler, A. S., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+caspases+after+ischemia-reperfusion+injury+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and caspases after ischemia-reperfusion injury in rat retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 967-975 (1999).</li>
<li>Luo, X. G., Chiu, K., Lau, H. S., Lee, V. W. H., Yung, K. K. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Selective+Vulnerability+of+Retinal+Ganglion+Cells+in+Rat+Chronic+Ocular+Hypertension+Model+at+Early+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Selective Vulnerability of Retinal Ganglion Cells in Rat Chronic Ocular Hypertension Model at Early Phase.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (8), 1143-1151 (2009).</li>
<li>Han, Y. S., Chung, I. Y., Park, J. M., Yu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+citicoline+on+retinal+cell+damage+induced+by+kainic+acid+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of citicoline on retinal cell damage induced by kainic acid in rats.</a> Korean J. Ophthalmol. 19, 219-226 (2005).</li>
<li>Hernandez, M., Urcola, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+neuroprotection+in+a+rat+model+of+glaucoma+following+brimonidine%2C+latanoprost+or+combined+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell neuroprotection in a rat model of glaucoma following brimonidine, latanoprost or combined treatments.</a> Exp. Eye Res. 86, 798-806 (2008).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

1. Cómo obtener una medición de espesores más precisa? Puede ampliar la imagen haciendo clic en "Zoom" y la izquierda haga clic en la ventana de seguimiento. El borde INL puede verse claramente. Si la punta de la línea no está en la frontera exterior de la INL, podemos ajustar la línea en el modo de edición. Después de recoger la línea en cuestión, haga clic derecho en la ventana de la búsqueda y elegir la opción "Punto de inserción en el contorno seleccionado". Un punto se puede añadir en el b...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3377">Morphometric Analyses of Retinal Sections</a>. There was an error with an author's name.

Erratum: Morphometric Analyses of Retinal Sections

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Investigador estéreo </td><td> MBF Software de Análisis de Biociencias </td><td> Campo MicroBright </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olympus BX51 </td><td> Olympus Corporation </td><td> BX51 </td></tr></tbody></table>

los análisis morfométricos de las secciones de retina

Morphometric Analyses of Retinal Sections

El análisis morfométrico de secciones de retina se han utilizado en el examen de enfermedades de la retina. Por ejemplos, las células neuronales se perdieron significativamente en la capa de células ganglionares de retina (RGCL) en modelos de ratas con N-metil-D-aspartato (NMDA)-inducido excitotoxicidad 1, la retina isquemia-reperfusión 2 y 3 del glaucoma. Reducción de la capa plexiforme INL e interior (IPL) de espesor se revirtieron con el tratamiento con citicolina en los ojos de las ratas sometidas a la excitotoxicidad del glutamato kaínico mediada por el ácido 4. La alteración de la densidad de CGR y los tamaños de soma se observaron con los tratamientos farmacológicos diferentes en los ojos con presión intraocular elevada 3,5,6. Por lo tanto, con métodos objetivos de análisis de los morfometría retinianos pueden ser de gran importancia en la evaluación de patologías de la retina y la eficacia de las estrategias terapéuticas. La estructura de la retina es multi-capas y diferentes tipos de neuronas exiº en la retina. Los parámetros morfométricos de la retina, tales como el número de células, tamaño de la celda y el espesor de las capas diferentes son más complejos que el sistema de cultivo celular. Al principio, estos parámetros pueden ser detectados utilizando otro software de imagen comercial. Los valores son normalmente de valor relativo, y cambiando el valor exacto puede ser necesario el cálculo más exacto. Además, el trazado del tamaño celular y la morfología no puede ser precisa y suficientemente sensible como para el análisis estadístico, especialmente en el modelo de glaucoma crónico. Las medidas utilizadas en este protocolo siempre de una manera más precisa y fácil. Y la longitud absoluta de la línea y el tamaño de la celda se puede informar directamente y fácil de ser copiado en otros archivos. Por ejemplo, se trazó el margen de los núcleos más interior y exterior en el INL y formó una línea a continuación, utilizando el software para dibujar un ángulo de 90 grados para medir el espesor. Aunque sin la ayuda del software, la línea oblicua tal y el cambio de espesor de la retina puedeno ser repetible entre los observadores individuales. Además, el número y la densidad de CGR también puede ser cuantificado. Este protocolo con éxito disminuye la variabilidad en la cuantificación de las características de la retina, aumenta la sensibilidad en la detección de cambios mínimos. Este vídeo se muestran tres tipos de análisis morfométricos de las secciones de la retina. Estas incluyen la medición del espesor de la INL, que cuantifica el número de las células y medir el tamaño de las CGR en valor absoluto. Estos tres análisis se llevan a cabo con el investigador estéreo (MBF Bioscience - MicroBrightField, Inc.). La técnica puede ofrecer una plataforma sencilla pero científica de análisis morfométricos.

Este video muestra tres tipos de análisis morfométricos de la retina, que incluyen la medición del espesor de la capa interna nuclear, cuantificar el número de células ganglionares de la retina (CGR) y la medición de los tamaños de las CGR. La técnica puede ofrecer una plataforma sencilla pero científica de análisis morfométricos.

Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Los análisis morfométricos de secciones retinianas se han utilizado para examinar enfermedades de la retina. Por ejemplo, se produjo una pérdida significativa de células neuronales en el...

Hola, soy Regina del laboratorio de Enfermedades Neurodegenerativas del Departamento de Anatomía de la Universidad de Hong Kong. Hoy les mostraré cómo realizar el análisis de progresión de la sesión retinal. Comencemos. Antes de realizar cualquier análisis, una muestra retinal debe ser recolectada y cuatro muestras de MyFitness deben ser sometidas a tinción con hematoxilina y eosina.Después de eso, la sesión retiniana se divide en cuatro regiones. Son la región periférica superior, la región central superior, la región central inferior y la región periférica inferior. Después de definir las regiones, se adquiere una imagen de cada región a 10 veces 40 de aumento bajo el microscopio de haz claro de decor.Ahora estamos listos para analizar la información morfológica de la retina. Esta sesión demostrará cómo medir el grosor de la capa nuclear interna. Abra el software llamado thorough investigator.Seleccione los 40 tipos, luego en la barra principal de dos opciones seleccione abrir imagen. En la pestaña archivo, elija una imagen de una región retiniana que desee analizar. Elija el tipo de línea de contorno desde el menú desplegable de la barra principal de dos opciones.Asegúrese de que el movimiento automático esté activado. Puede ampliar la imagen haciendo clic en el botón de acercar. Puede usar el botón de alejar para reducir el tamaño de la visualización de la imagen.Tanto el trazado como la muestra pueden moverse en cuatro direcciones diferentes accionando los botones de movimiento de la causa. Haga clic con el botón derecho en la ventana de trazado y seleccione trazado de grieta simple. Dibuje la línea contigua a lo largo del borde interno de la capa interna.Si se comete un error, haga clic en la ventana de trazado y presione el botón deshacer para borrar el último punto dibujado. Continúe el trazado hasta el último punto de la línea. Cuando finalice el dibujo, haga clic en la ventana de trazado, seleccione un contorno abierto y lance la imagen haciendo clic en acercar.Haga clic con el botón izquierdo en la ventana de trazado. Para ampliar la imagen, seleccione un marcador en la barra de marcadores dos en Marcus. En el punto de unión.Después de agregar todos los marcadores, seleccione el icono de marcador en la posición de la barra del marcador dos y el cursor. En el centro de uno de los marcadores, seleccione mediciones rápidas de ángulos en la pestaña dos haciendo clic derecho en la ventana de trazado y luego seleccione la opción continua. Mida el ángulo haciendo primero clic en el centro de un marcador, que esté adyacente al marcador seleccionado.Para un extremo del segmento de línea, mueva el más cercano al centro de interés. Marcador y grieta. Nuevamente, extienda la línea de banda elástica hasta el borde externo de la capa inia y ajuste el ángulo hasta 90 grados.Alcance la grieta izquierda en el punto deseado. Coloque un cuadro de diálogo que muestre la medición del ángulo, el cual aparecerá justo después del clic. Presione la tecla Intro mientras mantiene el ratón inmóvil hacia la izquierda.Haga clic en la ventana de trazado para que la línea se dibuje desde un extremo hasta el nuevo extremo seleccionado. Rompa la línea en la ventana de trazado y elija un control abierto. Debemos tomar cuatro mediciones de los dedos de la capa nuclear interna en cada región, donde se dibujarán cuatro líneas.Perpendicularmente desde la base de control nocturna hasta el borde externo de la capa nuclear interna, y lance la imagen para poder ver claramente el borde. Si la punta de la línea no se encuentra en el extremo externo de la capa nuclear interna, podemos unirla o acortar la línea en el modo de edición. Seleccione el modo de edición y elija la línea.Haga clic en la ventana de trazado y elija un punto de búsqueda en el control eléctrico; agregue un punto en el borde exterior mientras que la edición del punto debe realizarse a lo largo de la misma línea. Elimine el punto original. Luego se puede obtener una nueva alineación con un elevador.Reduzca el tamaño de la imagen haciendo clic en el botón de alejar. Desactive el modo de edición y dibuje el último segmento de línea. Después de dibujar las líneas en orden, seleccione el modo de edición.Haga clic derecho en la ventana de trazado y colocamos los cuatro segmentos de línea de forma correspondiente. Ahora podemos obtener las cuatro mediciones presionando el botón de medición CONT. Seleccione estas cuatro mediciones y péguelas a un especialista haciendo clic en copiar.Para hacer clic en la bola, seleccione "Guardar como" en la pestaña Archivo. Los datos de trazado se pueden guardar como un archivo de datos. En esta parte, cuantificaremos el número de células de cola roja gagan; seleccione imagen abierta.Bajo la pestaña archivo, seleccione una imagen de una región retiniana deseada que desee analizar. En primer lugar, debemos identificar cuáles son las células viables y cuáles son las células muertas. Aquellas células con forma aproximadamente regular y con citoplasma y núcleo claramente observados se consideran como células ganglionares retinianas viables.Aquellas células pequeñas y condensadas se consideran como esa célula. Elija el tipo de línea de contorno en el menú desplegable de la barra principal. Dibuje una línea a lo largo del borde de la capa de fibras izquierda y realice el trazado con la opción de contorno abierto.Agregue un marcador en cada extremo: uno en la punta de la línea y el otro en la posición cercana al equipo. Seleccione el icono de marcador en la barra de marcador dos. Coloque el cursor en el centro de los marcadores.En la punta, seleccione medición rápida de ángulos bajo la pestaña. Haga clic derecho dos veces en la ventana de trazado, seleccione la opción continua y simplemente las líneas elásticas, y mida un ángulo de 19 grados. Presione la tecla Intro inmediatamente después de que se capture el cuadro de destino.Pero recuerde que el ratón aún tiene simultáneamente la izquierda. Rompa la ventana de trazado para que una nueva línea pueda extenderse particularmente desde la punta. Rompa en la ventana de trazado y elija un control abierto.Dibuje otra nueva línea exactamente de la misma manera que en el otro extremo. Hemos creado dos límites dentro de los cuales se cuenta el número de células de ratin gagan. Seleccione un tipo de marcador y coloque uno en cada cinco células.Elige un límite como línea de exclusión, que la célula toca y que no es actual. Selecciona otro tipo de marcador para las células muertas. El número de cada tipo de espacio de marcador se mostrará junto al icono del marcador, respectivamente.En la barra del marcador dos, seleccione el modo de edición y seleccione la línea base del contorno. Rompa la línea en la ventana de trazado y finalice nuevamente la línea. El nombre de la línea base del contorno se puede obtener pulsando el botón de medición de contorno.El número de células puede expresarse entonces por milímetro del nombre. Así que guardémoslo bajo la pestaña archivo. Los datos de trazado y los datos del marcador pueden guardarse como un archivo de datos.Esta parte demostrará cómo medir el lado celular de una imagen seleccionada de una célula ganglionar retinal. Bajo la pestaña archivo, elija una imagen de una región retinal deseada que desee analizar. Seleccione una célula ganglionar viva según los criterios descritos en la parte anterior.Entonces, en la célula viva, elija el tipo de línea de contorno desde el punto de anotación de las dos barras principales. Dibuje una línea de contorno a lo largo de la circunferencia de la célula aproximadamente al final, haga clic derecho en la ventana de trazado y seleccione finalizar contorno cerrado. El área de la célula se mostrará bajo el ítem de área en el cuadro de diálogo de mediciones de control.Este video ha demostrado tres métodos sencillos que pueden analizar objetivamente la retina. Esperamos que este video sea de utilidad.

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Investigación

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