Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

El objetivo de este procedimiento es utilizar el control remoto para activar las neuronas del bulbo olfativo y observar cómo su activación afecta el comportamiento. Esto se logra mediante la introducción de un gen de tendencias del canal Redin dos, acoplado a YFP en neuronas diana de adultos con inyecciones estereotáxicas de un vector lentiviral. A continuación, se calibra un LED y se prepara para su implantación, produciendo una idea general de la cantidad de luz que se transmite al cerebro.

El paso final del procedimiento es la implantación del LED sobre la bombilla olfativa, asegurando su correcta colocación y fijación. En última instancia, la activación neuronal se confirma a través de los CFO, la tinción inmunológica y los resultados de las pruebas de comportamiento. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la estimulación eléctrica estándar o las perturbaciones farmacológicas, es que la estimulación optogenética de las neuronas marcadas es muy específica tanto en cuanto al tipo como al número de neuronas activadas.

Las implicaciones de esta técnica hacen avanzar la terapia o el diagnóstico de la enfermedad neurodegenerativa debido al preciso control temporal y espacial que ofrece. Este método puede proporcionar información sobre el papel de la neurona ósea adulta en la red ósea olfativa. Se puede aplicar a otras regiones superficiales como las neuronas pulmonares corticales o cerebrales.

Comience por recuperar los títulos vectoriales preparados del congelador a 80 grados centígrados negativos. Manténgalos congelados antes de usarlos y deseche los títulos sobrantes. Corta la punta de las pipetas de vidrio de sílice boro agrupadas con unas tijeras.

El objetivo es fabricar puntas de 30 a 40 micras de diámetro. Guarde las pipetas preparadas en una caja libre de polvo. A continuación, configure un microinyector para inyectar una pipeta preparada con relleno trasero de 50 nanolitros con aceite mineral e insértelo en el émbolo del microinyector, que debe estar unido al marco estereotáxico.

Una vez que el título viral se haya descongelado, vacíe parcialmente el aceite de la pipeta de vidrio y luego vuelva a llenarlo con el título. Transfiera dos microlitros de virus a un pedazo estéril de película para. Baje suavemente la pipeta de vidrio en la gota y llene la pipeta con uno o dos microlitros de virus.

Compruebe que no haya burbujas de aire en la pipeta y, a continuación, proceda a preparar al animal después de anestesiar a un ratón con ketamina y xilacina diluidas en solución salina estéril. Asegúrese de que el ratón no responda a los estímulos de dolor, como un pellizco en el dedo del pie, antes de continuar. Ahora, retire el pelo del cuero cabelludo del ratón y desinfecte el cuero cabelludo.

Coloque al animal en un marco estereotáxico y use barras para las orejas y una barra para la nariz para asegurar su cabeza con un bisturí. Corta el cuero cabelludo desde entre los ojos hasta entre las orejas. Tira de la piel a un lado para exponer el cráneo y ancla la piel con un par de pinzas.

A continuación, limpie la superficie del cráneo con una solución salina estéril. Poner a cero el aparato estereotáxico con la punta de la pipeta de vidrio en breg ma. A continuación, coloque la punta en el lugar de la inyección.

Ajuste la posición de la barra nasal de acuerdo con el cálculo de las coordenadas estereotáxicas. Con estas coordenadas, el bgma y el lugar de inyección se alinean a la misma altura. Con un taladro quirúrgico de alta velocidad, perfore cuidadosamente un pequeño orificio en el cráneo en cada sitio de inyección.

Tenga cuidado de no romper los vasos sanguíneos en la superficie del cerebro mientras perfora. Ahora, con una aguja de jeringa doblada enganchada en la punta, retire los restos de hueso delgado para exponer la materia URA. Compruebe que el orificio esté centrado en la posición correcta.

Baje la pipeta y ponga a cero la altura dorso ventral. Cuando la punta de la pipeta toque la superficie del cerebro, baje la pipeta a la profundidad ventral dorsal correcta y espere 30 segundos para que la presión se equilibre. Ahora inyecte 50 nanolitros de virus cuatro veces para un total de 200 nanolitros de virus, esperando 30 segundos entre inyecciones.

Un minuto después de la última inyección, retire lentamente la pipeta y retire el ratón del aparato. Limpie el sitio de la incisión con la solución de Betadine y sutura la piel. Con un hilo quirúrgico, permita que el mouse se recupere en una almohadilla térmica antes de devolverlo finalmente a su jaula antes de implantar el LED azul en miniatura.

Para la estimulación optogenética, debe estar preparada y probada. Se venden los pines LED a un conector eléctrico hembra para que el conector se coloque en el lado opuesto del LED. Verifique que no haya un cortocircuito eléctrico e identifique el pin positivo y negativo en el conector.

Por último, pruebe el LED conectándolo a un controlador LED para medir o configurar la potencia lumínica absoluta de la montura LED, el LED en un micro manipulador y prepare el medidor de luz. Taladre un orificio de tres milímetros en una placa de PVC opaco y fije este orificio al medidor de potencia. Ahora coloque el LED en contacto directo con el fotodetector del medidor de potencia y tome medidas a la intensidad máxima de la luz LED, que suele ser de cuatro 70 nanómetros.

Utilice el medidor de potencia para crear una curva estándar de potencia óptica frente a la corriente de entrada. A continuación, utiliza el para calcular la potencia por milímetro cuadrado para medir la propagación de la luz a través del cerebro. Obtener bloques cortados por vibram de tejido cerebral fresco de 300, 500, 1000, mil quinientas y dos mil quinientas micras de espesor utilizando un trozo de cráneo con una craneotomía idéntica a la realizada en los ratones vivos.

Colóquelo entre el LED y el detector. Ahora, mide la potencia de la luz sin tejido. A continuación, coloque cada bloque de tejido entre el LED y el fotodetector del medidor de potencia y mida el cambio de potencia.

Construya una curva de espesores de tejido frente a la fracción de transmisión relativa. La fracción de transmisión es la relación entre la potencia medida a través del tejido en comparación con la que no lo tiene. Utilice estos datos para calibrar el LED y luego proceda con la cirugía de implantación.

Prepare el LED y el conector desinfectándolos con etanol al 70% y conectando el conector a un soporte estereotáxico. Después de colocar un ratón anestesiado en el marco estereotáxico, use una barra nasal para alinear la superficie del cráneo perfectamente horizontal y paralela a la superficie del LED en miniatura. En este caso, se alinea la región del cráneo correspondiente con el bulbo olfatorio.

Ahora, con un bisturí, corta el cuero cabelludo desde tres milímetros por delante de los ojos hasta tres milímetros por detrás de las orejas. Tira de la piel a un lado y fíjala con un par de pinzas. Raspa las membranas de la superficie del cráneo con una cuchilla de afeitar.

Prepárese para realizar una craneotomía rectangular sobre los bulbos de efecto apagado. Primero, use un taladro de alta velocidad para adelgazar cuidadosamente el cráneo hasta que solo quede una capa delgada de hueso. En segundo lugar, retire con cuidado el hueso restante con la ayuda de una aguja de jeringa doblada.

Evite cuidadosamente perforar la duramadre. Ahora enjuague el área quirúrgica con solución salina estéril y luego seque el cráneo. Después de limpiar y secar el cráneo expuesto, aplique una fina capa base de adhesivo de cianoacrilato al cráneo para su posterior adhesión del acrílico dental.

Es posible que se requiera la adición de dos tornillos pequeños para fijar el LED. Los tornillos deben insertarse en el cráneo posterior al LED y cubrirse con ambos acrílicos. Después de conectar el conector LED al soporte, baje el LED en miniatura por encima de las bombillas olfativas con su eje principal paralelo al eje del cordón rostral.

A continuación, fije el LED al cráneo con dos capas de acrílico dental. Mientras el acrílico aún está líquido, retira los bordes libres del cuero cabelludo y pégalos a dos capas de acrílico dental. Tenga cuidado de no aplicar ningún acrílico al conector después de que el acrílico se haya endurecido.

Retira al animal del marco y deja que se despierte sobre una almohadilla térmica. Una vez devuelto a su jaula, la recuperación completa tarda al menos siete días después. Se utiliza un cable eléctrico de luz delgada para atar al animal a un controlador LED, lo que permite una amplia libertad de deambulación, respetando la polaridad del cable como invertido.

La polaridad puede romper el LED. Después del experimento, retire el LED para verificar que era CH opsina funcional. Dos YFP se expresaron en las neuronas transducidas aproximadamente 48 horas después de la inyección y permanecieron estables durante varios meses.

Una sección sagital de un animal fijado en paraldehído 15 días después de la inyección mostró un marcado denso y el tamaño del sitio de inyección. En el RMS, un gran número de células recién nacidas migraron a lo largo del RMS para colonizar las diferentes capas del bulbo olfatorio. La proteína de fusión se expresó en todos los compartimentos neuronales, incluidas las dendritas y las espinas del soma.

La implantación de LED en miniatura permitió la estimulación óptica a gran escala y económica de una amplia región de interés mediante la caracterización de la difusión de la luz en el tejido cerebral y el umbral de activación del canal redin dos. Se estimó que la activación óptica se desencadenó a una profundidad de unos dos milímetros por debajo de la superficie del LED para monitorear la activación funcional de la adopción del canal, dos neuronas expresadoras in vivo. La expresión de los CFOs.

Se analizó un marcador de actividad neuronal tras la estimulación lumínica repetitiva. Un maestro. Esta técnica se puede realizar en una hora para inyectar el virus, y después de al menos tres semanas, dos horas más para implantar LAD.

La calibración de LAD es importante y requiere tiempo adicional después de este procedimiento. Otros métodos, como el registro electroquirúrgico in vivo, se pueden realizar para responder a preguntas adicionales como sobre la relación entre la activación de un tipo de célula y la respuesta en otra después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia de sistemas exploraran correlaciones precisas entre la activación de las neuronas recién nacidas y la percepción olfativa en el sistema olfativo del ratón.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar un vector viral usando coordenadas ESTEREOTÁXICAS, cómo preparar y calibrar un LED para la implantación, cómo implantar el LED y cómo usar el oxígeno y la estimulación para realizar experimentos de comportamiento. Además, recuerde que el uso de vectores virales puede ser extremadamente peligroso y se deben tomar las precauciones adecuadas, como la capacitación adecuada y la eliminación de materiales peligrosos.