Utilización de nanoestructuras fotónicas de cristal plasmónicos y para la manipulación mejorada de Micro y nanopartículas

El objetivo general de este procedimiento es atrapar objetos biológicos de tamaño micrométrico mediante pinzas plasmónicas y de cristal fotónico. Esto se logra primero fabricando el sustrato plasmónico o el sustrato de cristal fotónico. A continuación, se prepara la muestra biológica añadiendo BSA a la solución celular y proporcionando un espaciado adecuado para la solución celular debajo del cubreobjetos superior.

Luego, el láser se alinea con el microscopio, que ha sido equipado con el esquema de filtros adecuado. El microscopio ahora se enfoca en la muestra y se realiza el atrapamiento. Finalmente, partículas de tamaño micro o nano pueden atraparse con una intensidad incidente reducida mediante el uso de nanoestructuras plasmónicas o de cristal fotónico.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los pinzas ópticas convencionales es que la conversión de los campos ópticos mediante nanoestructuras de cristales fotónicos y plasmónicos reduce la intensidad necesaria para atrapar partículas pequeñas como células, y además no requiere un haz estrechamente enfocado, lo que disminuye el riesgo de daño fotoinducido en las células debido a la exposición a la radiación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos biológicos, como la interacción entre células y el estudio de diversas fuerzas en biología. Asimismo, puede ser una herramienta útil para la fabricación en micro y nanotecnología al permitir la manipulación precisa de micro y nanopartículas. Para formar un arreglo de nanopartículas de oro utilizando un evaporador de haz de electrones y cromo como capa de adhesión, evapore oro sobre un cubreobjetos de vidrio hasta un espesor de 20 nanómetros.

Limpie la muestra utilizando plasma de oxígeno durante aproximadamente un minuto para eliminar las impurezas orgánicas de la superficie. Después de inducir la autoensamblaje de la monocapa de poliestireno, deposite o vierta el líquido sobre la muestra, incúbele durante aproximadamente una hora y luego use un gran volumen de agua para lavar las esferas no adsorbidas y deje secar al aire. Finalmente, evapore una segunda capa de oro de 20 nanómetros sobre la monocapa de esferas de látex para formar una matriz aleatoria de nanopartículas de oro.

La matriz de nanopartículas ya está lista para la muestra biológica. Coloque el portaobjetos de nanopartículas preparado en la platina de un microscopio fluorescente. El siguiente paso consiste en preparar núcleos de células de ratón para el atrapamiento óptico.

Comience con núcleos celulares de ratón marcados con naranja aine para evitar que los núcleos se adhieran al sustrato. Coloque los núcleos celulares en un vial pequeño y añada BSA al 10 % en PBS a una concentración de uno a diez de BSA mezclando mediante vortex. Luego, pipetee cinco microlitros de la solución de núcleos con BSA sobre el portaobjetos preparado.

Para proporcionar espacio entre los núcleos y una cubreobjetos, coloque una pila de dos cubreobjetos separadores alrededor de la gota y luego coloque otra cubreobjetos encima. Para el atrapamiento y la imagen simultánea, utilice una configuración personalizada de microscopio de fluorescencia, que incluya un filtro de excitación omitido y dos divisores de haz dicróicos personalizados. Las pinzas ópticas se construyen enviando un láser de helio-neón de 35 milivatios a través de un microscopio zes axio imager D one M, equipado con un conjunto de filtros GFP 17, que se modifica para permitir que la radiación láser de 633 nanómetros alcance la muestra.

El microscopio enfocará el haz láser sobre la muestra, y luego el haz será difractado por el sustrato de nanopartículas plasmónicas o por la rejilla de difracción. Para obtener imágenes de los núcleos celulares, que tienen aproximadamente cinco micrómetros de diámetro, utilice un microscopio Zeiss LDEC epi plan con un objetivo Neola de 50x. Comience colocando la muestra sobre el objetivo y enfoque el plano con mayor cantidad de núcleos, ya que estos se encuentran sobre la superficie del sustrato.

A continuación, enfoque el microscopio en un núcleo para atraparlo, localizando núcleos celulares libres flotando sobre las capas de células en la superficie. Luego, coloque el punto de la trampa láser sobre la partícula. En este momento, debería quedar atrapada y mantener su posición dentro del punto láser incluso cuando se mueva la platina.

Los núcleos de ratón que se encuentran en el plano focal del microscopio probablemente se desplazarán debido a una ligera corriente microfluídica provocada por el calentamiento y la evaporación de la muestra, pero los núcleos atrapados permanecerán en una posición fija. Esta figura muestra una micrografía electrónica de barrido de nanopartículas de oro autoensambladas, cada una con un diámetro aproximado de 450 nanómetros. Aquí se presenta una imagen de microscopía óptica de barrido en campo cercano del sustrato plasmónico, donde la distribución de las nanopartículas es escasa, mostrando la radiación en campo cercano.

La longitud de onda del láser de excitación es de 633 nanómetros, aquí se muestra un espectro de eficiencia de dispersión del sustrato plasmónico con un pico a 624 nanómetros. Un espectro de eficiencia de absorción del sustrato plasmónico muestra el pico a 668 nanómetros. Esferas nanométricas de oro distribuidas aleatoriamente en un dominio 2D de un por un cuadrado.

Se muestran micrómetros aquí. Cada círculo azul representa el centro de la nanoesfera. En estos paneles se muestran distribuciones del campo disperso en planos de observación, que son paralelos al arreglo aleatorio de nanoesferas.

Estos gráficos muestran las intensidades mínimas del láser necesarias para mantener el trampa en función del caudal del fluido circundante. Mediante el uso de trampa plasmónica, todas las intensidades ópticas se miden en el plano de la muestra bajo el objetivo del microscopio. Cada panel muestra los resultados de las mediciones para microesferas de poliestireno individuales con diferentes diámetros.

Los recuadros muestran las imágenes microscópicas correspondientes de las partículas. Las barras de escala en todas las imágenes representan cinco micrómetros de longitud. Aquí se representa gráficamente la pendiente de la línea ajustada que pasa por el origen en las gráficas anteriores frente al tamaño de las partículas.

Para el atrapamiento plasmónico. Las barras de error muestran las desviaciones estándar de los ajustes lineales. Los resultados indican que partículas más grandes requieren mayor intensidad láser para mantener una estabilidad adecuada del atrapamiento.

Este esquema muestra el atrapamiento óptico mejorado que utiliza nanoestructuras periódicas unidimensionales. El haz incidente es difractado por la nanoestructura periódica en campo lejano. Aquí se muestra la distribución de intensidad de la luz con dos polarizaciones ortogonales en la superficie de una rejilla de aluminio.

Con un período de 417 nanómetros obtenido mediante simulaciones de dominio temporal de diferencia finita, la distribución se normaliza a la intensidad sobre una superficie plana de aluminio. Estas figuras muestran el potencial de atrapamiento para partículas directamente por encima de la superficie gradada en función de la ubicación de la partícula. Para la perla de poliestireno CA de 350 nanómetros y la perla de poliestireno DA de un micrómetro, los círculos blancos ilustran los tamaños de las partículas.

Los insertos muestran el potencial de atrapamiento sobre una superficie plana de aluminio. Para el mismo tamaño de partícula, se realizan comparaciones. Los valores se normalizan para cada tamaño de partícula.

Para todas las figuras de simulación FDTD, el campo de visión es de 10 por ocho micrómetros cuadrados. Aquí se muestra la eficiencia de la trampa y la intensidad mínima de atrapamiento medida para microesferas de poliestireno de diversos tamaños, con la polarización del haz perpendicular a las líneas de la rejilla. El recuadro muestra la asimetría de la trampa en la eficiencia de atrapamiento al trasladar una microesfera de poliestireno de 3,87 micrómetros, perpendicular y paralelamente a las líneas de la rejilla.

Aquí se muestra una representación esquemática del ángulo de traslación de la partícula. Este recuadro muestra la mejora frente a la dirección de traslación para diferentes polarizaciones y tamaños de partículas. La línea continua de gran asimetría se obtiene con luz incidente polarizada perpendicularmente al gradiente y la línea discontinua.

Se obtiene una pequeña asimetría con luz incidente polarizada paralelamente al gradiente. Estos paneles representan una demostración de atrapamiento de una microesfera fluorescente de poliestireno de 590 nanómetros. El círculo rojo indica la posición del punto láser, ya que al principio la luz láser era demasiado tenue para ser visible.

La partícula queda atrapada dentro del punto a mayor potencia. Al reducir la potencia, el movimiento browniano de la partícula supera la fuerza de atrapamiento, lo que permite que la partícula escape. Aquí, un núcleo de célula cancerosa ovárica fluorescente quedó atrapado; la intensidad mínima requerida para iniciar el atrapamiento fue de 16 microvatios por micrómetro cuadrado, obtenida utilizando un objetivo de 20 x.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear una trampa óptica de baja intensidad para la manipulación no invasiva de especímenes biológicos de tamaño micro y nanométrico utilizando sustratos nanoestructurados de cristales fotónicos y plasmónicos.