Modelo de ratón de la endometriosis quirúrgicamente inducida por la Auto-trasplante de tejido uterino

El objetivo general de este procedimiento es inducir quirúrgicamente endometriosis en ratones mediante la transferencia autóloga de tejido uterino a la cascada arterial del mesenterio intestinal. Esto se logra primero mediante la ligadura, extirpación y exposición del endometrio del útero. El segundo paso del procedimiento consiste en crear tres implantes endometrioides a partir del endometrio expuesto utilizando una punzón de biopsia de dos milímetros.

El tercer paso del procedimiento consiste en suturar los tres implantes endometrioides a las arterias en la cascada arterial del mesenterio intestinal. El paso final del procedimiento es cerrar la pared abdominal y la piel y permitir que el animal se recupere, manteniendo las lesiones endometrioides. Los tejidos extirpados de ratones se asemejan a los de mujeres con endometriosis, según se determinó mediante análisis histológico y patrones de expresión génica y proteica.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades por tres razones principales. Primero, los tejidos de ratón son muy pequeños. Segundo, el mesenterio intestinal se daña fácilmente, y tercero, si los puntos se colocan demasiado apretados, provocarán necrosis intestinal.

Comience reuniendo todo el equipo quirúrgico necesario para una cirugía aséptica exitosa, incluyendo soluciones para analgesia y anestesia. Después de anestesiar al animal mediante isoflurano inhalado, confirme la anestesia completa mediante la ausencia de respuesta a un estímulo de presión en el dedo del pie; para prevenir la sequedad durante la cirugía, aplique una pomada oftálmica en los ojos y luego afeite el sitio quirúrgico utilizando una máquina de cortar pequeña. Desinfecte el área quirúrgica con tres pasadas alternadas de solución de clorhexidina y etanol al 70 %, y luego coloque un campo estéril sobre el animal.

Realice una pequeña incisión media utilizando tijeras pequeñas o una hoja de bisturí, finalizando entre 0,5 y 1,0 centímetros hacia la región rostral respecto a la abertura vaginal. Desprenda suavemente con técnica roma la pared corporal de la pared abdominal para facilitar el cierre del sitio quirúrgico. Tras la disección roma, realice una pequeña incisión media en la pared abdominal.

A continuación, utilizando fórceps pequeños, localice suavemente el cuerno uterino izquierdo. El útero se encuentra dorsal al intestino, que es lo que normalmente es visible al ingresar por primera vez al sitio de la incisión; levante suavemente el cuerno uterino y deslice un fórceps abierto debajo de él para usarlo como retráctor. También es útil observar en este momento el aspecto de los ovarios y del útero.

Para ayudar en la determinación de la fase del ciclo estral. Deslice dos trozos de hilo de sutura de seda negra trenzada número cinco, de seis a ocho centímetros de longitud, debajo del cuerno uterino extendido. Ligue firmemente el cuerno en la unión uterotubárica.

Simplemente coloque la ligadura en el tubo uterino y en la unión uterocervical. Utilizando un nudo cuadrado en cada ubicación, deje los extremos del hilo sin cortar. Extraiga el segmento del cuerno uterino comprendido entre las dos ligaduras y coloque el tejido en una placa de Petri de vidrio que contenga aproximadamente 100 microlitros de PBS con penicilina y estreptomicina.

Corte los extremos del hilo de sutura de seda al final. Si la sutura se afloja o hay sangrado, busque el muñón y ate otro nudo o no use tijeras pequeñas. Retire la grasa del cuerno uterino.

Abra el cuerno uterino insertando una hoja de unas tijeras pequeñas en la luz. Deslice suavemente las tijeras a lo largo del cuerno uterino mientras sostiene este con pinzas. En la placa de Petri de vidrio, utilice un punzón de biopsia de dos milímetros para extraer tres implantes de tamaño igual. Asegurándose de que no se sequen.

Coloque gasa estéril inmediatamente por encima del sitio de incisión y humedézcala completamente con PBS estéril que contenga penicilina y estreptomicina. Es importante mantener la hidratación durante todos los pasos siguientes utilizando pinzas pequeñas y suaves. Localice suavemente el ciego y desplácese hacia el intestino delgado.

Extraiga una pequeña sección de cuatro a cinco centímetros de intestino y dispóngala como un abanico sobre la gasa previamente humedecida, de modo que la cascada arterial del mesenterio intestinal sea claramente visible. Asegúrese de mantener el intestino húmedo en todo momento con solución salina estéril. Coloque un implante sobre una aguja y luego utilice sutura negra autónoma n.º 6 para fijar suavemente el implante a una arteria aproximadamente a 0,5 centímetros del intestino.

Utilice solo uno. Pase por encima la pinza y no apriete mucho la sutura. Hacerlo podría provocar pérdida del flujo sanguíneo y necrosis subsiguiente del intestino.

Complete dos nudos con uno, lance cada uno y corte la sutura a menos de dos milímetros del implante, hidrate el intestino. Luego, moviéndose en dirección rostral. Extraiga los siguientes tres a cuatro centímetros de intestino y reemplace suavemente la sección que ya contiene un implante.

Salte una o dos arterias desde el sitio de implante anterior y sutúre el siguiente implante; repita el procedimiento para el tercer implante. Finalmente, sutúre la pared abdominal y cierre la piel con clips quirúrgicos. Después de cerrar el sitio quirúrgico y administrar analgésicos, coloque al animal con el lado ventral hacia abajo en la jaula, parcialmente sobre una almohadilla de agua caliente con recirculación hasta que el animal se recupere.

Para recuperar las lesiones endometrioides, localice las suturas negras en el mesenterio intestinal. Mida la longitud y el ancho de cada lesión endometrioide utilizando un calibrador. Diseque las lesiones endometrioides, teniendo cuidado de no perforarlas.

Elimine cualquier tejido no endometrioide de la lesión. Agite suavemente las tres lesiones endometrioides llenas de líquido antes de retirar la sutura. Retire con cuidado la sutura y punce dos de las lesiones endometrioides.

Pese nuevamente estos antes de continuar con el procesamiento del tejido. A continuación, extirpe y pese el cuerno uterino restante. El análisis histológico de la endometriosis tanto en mujeres como en el modelo murino mostrado aquí indica que la lesión endometrioide contiene glándulas y estroma endometriales. Las lesiones endometriósicas en ratones también contienen macrófagos cargados de hemisiderina, que son un signo común de la endometriosis en mujeres. Las lesiones endometrioides extraídas de ratones tres días después de la inducción aparecen inflamadas y hemorrágicas, como se muestra a la izquierda, tras dos a cuatro semanas de crecimiento.

Las lesiones endometriósicas en el modelo murino son quísticas, llenas de líquido y están rodeadas por adherencias peritoneales en comparación con el peso de la lesión en el momento de la inducción. Las lesiones llenas de líquido fueron un 306 % y un 862 % más grandes, y las lesiones en forma de lanza fueron un 51 % y un 172 % más grandes a un mes y dos meses posteriores a la inducción, respectivamente. Lesión endometrioide llena de líquido y en forma de lanza.

Los pesos permanecen constantes un mes después de la inducción en cinco experimentos diferentes siguiendo este procedimiento. Este modelo puede utilizarse para responder preguntas sobre la fisiopatología de la endometriosis y para explorar terapias novedosas para el tratamiento del dolor y la infertilidad asociados con esta enfermedad.