Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

El método tiene como objetivo cuantificar con precisión los metabolitos lipídicos bioactivos celulares mediante la combinación de dilución de isótopos estables, fase cnor, cromatografía líquida, captura de electrones, presión atmosférica, ionización química y espectrometría de masas. Comience por recolectar muestras de medios y células y agregue una mezcla estándar interna marcada con isótopos pesados. Extraiga los lípidos bioactivos con solvente orgánico, luego derive los lípidos bioactivos con un reactivo de captura de electrones y proceda a cuantificar con precisión los lípidos bioactivos mediante cromatografía líquida.

La espectrometría de masas a través del análisis LCMS de los resultados del lisado celular y de los medios determina con precisión la concentración de lípidos bioactivos específicos y los niveles de los ER de Anant individuales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la cromatografía líquida de fase reversa, la espectrometría de masas y otros métodos LCMS, es que las anteras individuales y las anteras se cuantifican con precisión mediante el uso de la cromatografía de fase normal en automóvil y la dilución de isótopos estabilizados. Los datos resultantes pueden proporcionar información valiosa sobre el funcionamiento de las vías enzimáticas en la célula.

Por cada placa de 10 centímetros de un adherente, las células recogen tres mililitros de medio en un tubo de centrífuga de vidrio de 10 mililitros. A continuación, lave las celdas dos veces con PBS. Luego agregue un mililitro de PBS, raspe las células de la placa y transfiera la muestra a un segundo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mililitros.

Prepare ocho tubos adicionales con tres mililitros de PBS para una curva de calibración. A continuación, añada 10 microlitros del patrón de calibración adecuado a cada tubo. Alinee cada muestra de prueba de los tres mililitros de medios de cultivo celular recolectados para la extracción de lípidos bioactivos libres.

Agregue 10 microlitros de mezcla estándar interna a cada patrón de calibración y equilibre la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente para procesar muestras a cinco mililitros de éter datílico y colóquela en un agitador durante 30 minutos. Centrifugar las muestras y transferir la fase orgánica superior a tubos de centrífuga de vidrio de 10 mililitros. Continúe secando las muestras bajo nitrógeno Primero, recoja las muestras de células recolectadas por centrifugación y vuelva a suspender cada paleta en dos mililitros de PBS por Vortex Reserve 25 microlitros de cada muestra para la normalización del lisado celular.

Ahora divida equitativamente cada lisado en tubos de centrífuga de vidrio de 10 mililitros. Agregue dos mililitros adicionales de PBS y 10 microlitros de ISM a cada muestra para medir los lípidos celulares libres y evitar la degradación alcalina de lípidos como las prostaglandinas, use uno de los duplicados de cada muestra para realizar extracciones de éter datílico como se muestra anteriormente. Para extraer los lípidos esterificados, agregue cinco mililitros de mezcla de cloroformo y metanol a cada una de las muestras restantes.

Coloque en una coctelera a baja velocidad durante 30 minutos, luego centrifugar durante 10 minutos. Ahora, recoja la capa orgánica inferior y seque las muestras bajo nitrógeno para clasificar los lípidos esterificados. Agregue 0,5 mililitros de hidróxido de potasio 0,4 normal en metanol al 80% a cada tubo.

Incubar las muestras a 60 grados centígrados durante una hora. Luego agregue dos mililitros de PBS y ajuste el pH dos seis con ácido clorhídrico concentrado. Finalmente, agregue 10 microlitros de ISM a cada muestra y proceda a las extracciones de éter de datilo a las muestras secas y los estándares de calibración.

Agregue reactivos de derivación en el orden especificado. A continuación, agite las muestras e incube a 60 grados centígrados durante una hora. Ahora, seque las muestras bajo nitrógeno antes de almacenarlas y analizarlas.

Este método utiliza una combinación de dilución de isótopos estables, chii, cromatografía líquida, captura de electrones, presión atmosférica, ionización química y análisis de espectrometría de masas. Reconstituya las muestras y los estándares de calibración en 100 microlitros de etanol de hexano y transfiera las muestras completas a viales de HPLC con inserto, coloque las muestras en el muestreador automático refrigerado. Cree una lista de muestra para el análisis.

A continuación, configure los métodos HPLC y MS utilizando los parámetros descritos en la tabla uno y la tabla dos del protocolo escrito adjunto para la separación de fases normal. Un paquete quiral, una columna DH a 30 grados centígrados, inyecta la muestra y comienza la ejecución. Ahora configure el MS en modo de iones negativos usando la fuente PCI A.

Comience con una pieza en bruto de hexano para equilibrar la columna. A continuación, ejecute las muestras estándar de calibración en orden creciente de concentración de SM. Continúe procesando muestras de prueba de medios de cultivo después de la separación de HBLC.

Agregue la columna de poste de metanol para evitar la deposición en la aguja de corona. Utilizando los datos generados a partir de los estándares. Cree una curva de calibración que trace el área de la muestra en el eje Y, y la concentración estándar en el eje x derive la ecuación Y igual a MX más B.

Por último, determine las concentraciones de lípidos bioactivos de la muestra de prueba para la célula. Lysates. Normalice estos valores dividiendo la concentración determinada de lípidos bioactivos por el número de células por placa o la proteína total normalizada en los pasos anteriores. Los datos del monitoreo de reacciones múltiples indican varios ácidos linoleico y araquidónico.

Los metabolitos oxidados 13 y nueve, junto con los correspondientes 13 y nueve Oxo ode se derivan del ácido linoleico. Además, los metabolitos del calor del ácido araquidónico y sus productos oxidados también están presentes, como se esperaba.

Hay un pequeño cambio en el tiempo de retención del estándar interno reducido en comparación con el estándar no etiquetado. Es importante destacar que este protocolo también separa el calor y las anteras y determina transiciones únicas para los isómeros estéreo que pueden resultar de la oxidación enzimática de un ácido araquidónico o de la reacción con especies reactivas de oxígeno. Por ejemplo, este cromatograma muestra la separación entre los isómeros estereofónicos r y s de cinco.

El análisis lipidómico por calor es una técnica poderosa para el análisis de numerosas especies de lípidos. Por ejemplo, este experimento evalúa y cuantifica prostaglandinas, isopsenos y leucotrienos B cuatro. Además de los calores que consume Oxo y los metabolitos omega hidroxilados, este método puede optimizarse para la extracción de lípidos bioactivos de otras matrices biológicas como el plasma, la orina y los tejidos.

En algunos casos, los lípidos bioactivos se han utilizado como biomarcadores de respuesta al estrés oxidativo.