Name: Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a extraer y cuantificar lípidos bioactivos celulares mediante dilución de isótopos estables y cromatografía líquida-espectrometría de masas. Este protocolo avanza el análisis lipídico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La mayoría de los métodos bioanalíticos actuales disponibles para la medición de lípidos bioactivos no son tan extensos, ya que no incluyen cromatografía quiral de fase normal o SID. La fase normal quiral LC es crítica para la separación de enantiómeros y para poder distinguir entre el metabolismo mediado por enzimas o ROS. El uso de SID garantiza que los errores humanos o las complicaciones que surjan durante la extracción o el análisis se tengan en cuenta durante la cuantificación. Estos componentes añadidos, junto con ECAPCI-MRM, lo convierten en el método más sensible y selectivo disponible para el análisis de lípidos bioactivos.

1. Mezclas estándar e internas
<ol>
	<li>Antes de la extracción de lípidos, se debe preparar una mezcla estándar (SM) y una mezcla estándar interna (ISM). En el caso del SM, alícuota el volumen equivalente de 1 μg de cada patrón (25 en total) enumerado en la tabla de reactivos que figura a continuación, utilizando una jeringa calibrada, en un matraz aforado de 10 mL. Secar los patrones bajo nitrógeno y reconstituirlos en 10 mL de acetonitrilo (ACN). La concentración final de la mezcla estándar será de 100 pg/μL. Divida en alícuotas de 1 mL y almacene a -80 °C hasta que se necesite.</li>
	<li>A partir de esta mezcla estándar, se pueden hacer 6 diluciones estándar para un total de 7 patrones de calibración (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL y 100 pg/ μL). Estos patrones deben ejecutarse con cada lote de muestras preparadas para desarrollar la curva de calibración utilizada en el análisis cuantitativo.</li>
	<li>En el caso del ISM, alícuota el volumen equivalente de 1 μg de cada IS (14 en total) indicado en la tabla de reactivos que figura a continuación en un matraz aforado de 10 ml, utilizando una jeringa calibrada, y séquelo con nitrógeno. Reconstituya el ISM en 10 mL de ACN y divídalo en alícuotas de 1 mL. La concentración final del ISM debe ser de 100 pg/μL. Hay suficiente ISM para procesar 1000 muestras.</li>
	<li>Almacene el SM y el ISM a -80 °C.</li>
</ol>
2. Recolección de medios y lisado celular
<ol>
	<li>Por cada placa de 10 cm de células adherentes (~ 1 X 107), recoja 3 mL de medio en un tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL. A continuación, lave las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agregue 1 mL de PBS a la placa y raspe las celdas de la placa y pipetee en un segundo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL. En este punto, es posible que se almacenen células y medios si el procedimiento no se continúa en este momento. Almacene las muestras a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo o a -20 °C durante menos de una semana.</li>
</ol>
3. Extracción de lípidos de los medios
<ol>
	<li>Los lípidos bioactivos libres se encuentran en los medios celulares y estos se extraen fácilmente con un procedimiento de extracción de un solo paso. A los medios recogidos (2.1), añadir 10 μL de ISM. En este momento, 8 tubos de centrífuga de vidrio de 10 mL adicionales deben estar etiquetados como #0-7 para los estándares de calibración. Añada 3 mL de PBS a cada uno de estos tubos y luego agregue 10 μL del SM apropiado a los tubos 1-7 (1-7 desde 1.1).</li>
	<li>Deje que el ISM se equilibre en cada patrón de calibración y muestreo durante 10 minutos y luego agregue 5 mL de éter dietílico. A continuación, las muestras y los patrones de calibración se colocan en el agitador a baja velocidad durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de agitar, todos los patrones de calibración y las muestras se centrifugan a 1935 x g durante 10 minutos. A continuación, con una pipeta Pasteur, transfiera la fase superior (orgánica) a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de 10 ml y séquela con nitrógeno.</li>
</ol>
4. Extracción de lípidos del lisado celular
<ol>
	<li>Gire las muestras de células en los tubos de centrífuga de vidrio a 1935 X g durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante; agregue 2 mL de PBS a cada tubo y vórtice brevemente. Extraer 25 μL de muestra para la cuantificación de proteínas. La proteína total se utilizará para la normalización del lisado celular.</li>
	<li>A continuación, transfiera la mitad de la mezcla de lisado/PBS a un tubo de centrífuga de vidrio de 10 ml separado. Agregue 2 ml adicionales de PBS junto con 10 μl de ISM a cada muestra. Siga el proceso de extracción l-l descrito para los medios en 3.2 y 3.3. Esta alícuota se utilizará para medir los lípidos libres en las células y evitar la degradación alcalina de los lípidos, como las prostaglandinas. Esta alícuota no se someterá a los pasos 4.3 y 4.4 que se describen a continuación.</li>
	<li>El primer paso del proceso de extracción de lípidos esterificados l-l requiere la adición de 5 mL de CHCl3/MeOH (2:1) a cada una de las muestras. Las muestras se colocan en un agitador a baja velocidad durante 30 minutos. Después de agitar, las muestras se centrifugan a 1935 x g durante 10 minutos. A continuación, con una pipeta Pasteur, transfiera la capa inferior (orgánica) de la extracción l-l a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de 10 mL y seque la muestra con nitrógeno.</li>
	<li>Los lípidos esterificados deben ser saponificados antes de la cuantificación. Una vez que las muestras estén secas, agregue 0,5 mL de 0,4N KOH en 80% de MeOH a cada tubo. A continuación, las muestras se incuban a 60 °C durante 1 h. Después de la incubación, agregue 2 mL de PBS. Ajuste el pH a 6 con ácido HCl concentrado (~30 μL). Añada 10 μL de ISM a cada muestra. El resto del procedimiento es el mismo que la extracción de lípidos del medio y se puede seguir en 3.2 y 3.3.</li>
	<li>Si estas extracciones se realizan simultáneamente con las muestras de medios, se pueden utilizar los mismos patrones de calibración para desarrollar una curva de calibración; sin embargo, si estas muestras se ejecutan en otro momento, los patrones de calibración también deben procesarse como se describe en 3.1-3.3.</li>
</ol>
5. Derivatización del pentafluorilbencilbromuro (PFB)
<ol>
	<li>A las muestras secas y a los patrones de calibración, se añadan 100 μL de diclorometano anhidro (CH2Cl2) seguido de 100 μL de N,N-diisopropiletilamina al 20% (v/v) en CH2Cl2 anhidro y, finalmente, 100 μL de PFB al 20% (v/v) en CH2Cl2 anhidro.</li>
	<li>Después de la adición de reactivos de derivatización, las muestras se agitan en vórtice, se incuban a 60 °C durante 1 h y se secan bajo nitrógeno. Las muestras y los patrones de calibración pueden almacenarse a -80 °C si no se analizan inmediatamente o a -20 °C durante un máximo de una semana.</li>
</ol>
6. Dilución de isótopos estables Cromatografía líquida quiral Captura de electrones Ionización química Análisis de espectrometría de masas de ionización química (SID-LC-ECAPCI-MS)
<ol>
	<li>Las muestras secas y los patrones de calibración se reconstituyen en 100 μL de hexano/etanol (97:3). A continuación, toda la muestra puede transferirse al vial de HPLC con inserto. Coloque las muestras en el muestreador automático refrigerado (4 °C) y cree una lista de muestras para su análisis.</li>
	<li>A continuación, configure los métodos HPLC y MS utilizando los parámetros descritos en la Tabla 1 y la Tabla 2 a continuación. La Tabla 3 contiene información específica de los compuestos, incluida la transición MRM y la energía de colisión (CE) para cada lípido, así como el tiempo de retención estimado del análisis Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. La CE se determina ajustando cada lípido individual durante el desarrollo del método.</li>
	<li>Para la separación de fases normal se utiliza una columna AD-H de Chiralpak (4,6 X 250 mm, 5 μ) calentada a 30 °C. La fase móvil inicial es 98% hexano y 2% metanol/isopropanol (1:1). Después de la separación por HPLC, se añade metanol después de la columna (0,75 mL/min) para evitar la deposición en la aguja Corona que provocaría una disminución de la sensibilidad. La EM se configura en modo de iones negativos utilizando la fuente APCI. Si es necesario cambiar la fuente de ESI a APCI, asegúrese de insertar una aguja Corona.</li>
	<li>La primera muestra que se debe ejecutar es siempre un blanco de hexano. Esto equilibrará la columna y también revelará si hay alguna contaminación en la columna que pueda interferir con el estándar de calibración y el análisis de la muestra.</li>
	<li>Las siguientes muestras ejecutadas deben ser las muestras estándar de calibración en orden de 0 a 7 (concentración de SM creciente). Estos patrones se utilizarán para crear una curva de calibración que contenga la relación entre el área estándar/área IS en el eje Y y la concentración o masa estándar en el eje X. A partir de la ecuación y = mx + b derivada de este gráfico, la relación entre el área de la muestra y el área IS (y) se puede utilizar para determinar la cantidad o concentración de la muestra (desconocida) (x).</li>
	<li>La cantidad de lípidos bioactivos que se encuentran en el medio se puede normalizar al volumen total del medio y la cantidad de lípidos que se encuentran en el lisado celular se puede normalizar al número total de células/placa o a la cantidad total de proteína/placa. Se deben tomar medidas durante el punto 4.1 del protocolo para garantizar que se cuenten las células o que se cuantifique la proteína.</li>
</ol>
7. Resultados representativos:
Los cromatogramas de la Figura 1 son representativos de un perfil lipidómico dirigido. El primer panel (Figura 1A) muestra el 13- y el 9-HODE junto con el correspondiente 13- y 9-oxoODE, derivados del ácido linoleico. Además, en el segundo panel también se muestra el 15-oxoETE, el metabolito oxidado del 15-HETE. Los dos paneles inferiores muestran el 20-HETE y el 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. La Figura 1B muestra la separación y las transiciones únicas determinadas para los estereoisómeros HETE que resultan de la oxidación enzimática de AA o por ROS. La figura 1C es una representación de PG, isoP y LTB4. Algunos de los estándares no tienen un SI deuterado disponible comercialmente; por lo tanto, se utiliza un IS que es similar en tiempo de retención para la cuantificación. Por ejemplo, [2H8]-12(S)-HETE se utiliza para cuantificar las especies de 11-HETE y 8-HETE además de 12(R)-HETE y 12(S)-HETE.
A partir de los cromatogramas representativos, es evidente que hay un pequeño cambio en la retención del IS deuterado en comparación con el estándar no etiquetado. Este cambio a un tiempo de retención posterior es el resultado de la interacción del deuterio con la columna de fase normal. El deuterio es más polar que el hidrógeno; Por lo tanto, hay una interacción más fuerte con la fase normal de la columna. Si esta separación tuviera lugar utilizando una columna de fase invertida, el cambio sería a un tiempo de retención más temprano, ya que una fracción más polar tendría una interacción más débil con la fase invertida.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="Figura 1"> 
Figura 1. Esta figura es un ejemplo representativo de un análisis lipidómico dirigido. La Figura 1A muestra los cromatogramas iónicos totales (TIC) para varios metabolitos oxidados de LA y AA, incluidos 13-oxoODE y 9-oxoODE en el primer panel, 15-oxoETE en el segundo panel, 13-HODE y 9-HODE (paneles 3 y 5) y 20-HETE (panel 7). Los HODE y 20-HETE tienen un IS deuterado correspondiente en el panel de abajo (4, 6 y 8). Los TICs de la Figura 2B muestran la separación y las transiciones únicas de los estereoisómeros HETE derivados de AA. La figura 2C es una representación de PG, isoP y LT. La energía de colisión (CE), las transiciones MRM y el tiempo de retención (RT, min) se optimizaron utilizando un Waters 2695 LC acoplado a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra y se enumeran en la Tabla 3 para cada compuesto.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tiempo (min)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>número arábigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>
			<td>número arábigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Artículo 96.4</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>
			<td>98</td>
			<td>número arábigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>98</td>
			<td>número arábigo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Condiciones de gradiente de HPLC para la separación lipidómica en fase normal quiral. El disolvente A es 100% hexanos y el disolvente B es metanol/isopropanol (1:1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parámetro de espectrometría de masas</td>
			<td>ajuste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuente</td>
			<td>APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modo</td>
			<td>Ion negativo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longitud del método</td>
			<td>40 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancho de escaneo MRM</td>
			<td>0,002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiempo de escaneo MRM</td>
			<td>0.15 segundos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anchura del pico MRM</td>
			<td>0.70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lente de tubo</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuente: CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 Gas de colisión</td>
			<td>1.5 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura del vaporizador</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura capilar</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corriente de descarga</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presión de gas de la vaina</td>
			<td>25 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presión de barrido iónico</td>
			<td>3 unidades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Presión de gas auxiliar</td>
			<td>5 unidades</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2. Arriba se enumeran los parámetros optimizados de espectrometría de masas para la medición de lípidos bioactivos. Estos parámetros se toman de un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>compuesto</td>
			<td>transición</td>
			<td>CE (eV)</td>
			<td>RT (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-oxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>9.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-oxoODE</td>
			<td>293,03 → 113,10</td>
			<td>21</td>
			<td>Artículo 17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-oxoETE</td>
			<td>317,05 → 113,18</td>
			<td>18</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 195,12</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 198,12</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-HODE</td>
			<td>295,03 → 171,10</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299,03 → 172,12</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETE</td>
			<td>319,03 → 289,10</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325,03 → 295,10</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 115,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 115,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327,04 → 116,04</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 16.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>Artículo 11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 179,11</td>
			<td>14</td>
			<td>Artículo 12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327,13 → 184,11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Artículo 12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 219,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Artículo 15.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327,03 → 226,12</td>
			<td>13</td>
			<td>Artículo 16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 167,11</td>
			<td>16</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319,04 → 155,09</td>
			<td>16</td>
			<td>Artículo 12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335,03 → 195,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339,03 → 197,10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355,03 → 275,15</td>
			<td>25</td>
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGE2</td>
			<td>351,03 → 271,15</td>
			<td>18</td>
			<td>Artículo 37.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353,03 → 193,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 34.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF 2α</td>
			<td>357,03 → 197,11</td>
			<td>25</td>
			<td>Artículo 34.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3. Esta tabla enumera los compuestos detectados en los cromatogramas iónicos totales de la Figura 1A-C. La segunda columna proporciona la transición utilizada para MRM/MS, la tercera columna enumera la energía de colisión (CE, eV) y la última columna enumera el tiempo de retención (RT, min). Los parámetros se optimizaron utilizando un módulo de separación Waters 2695 acoplado a un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

<ol><li>Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid metabolism.</a> Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).</li>
<li>Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereochemical+nature+of+the+products+of+linoleic+acid+oxidation+catalyzed+by+lipoxygenases+from+potato+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).</li>
<li>Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-derived+eicosanoids%3A+the+neglected+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Metastasis.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer.</a> Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+eicosanoids%3A+role+of+prostaglandin+F%282alpha%29+and+F-isoprostanes+in+inflammation+and+oxidative+stress+related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology.</a> Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).</li>
<li>Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+A2+and+arachidonic+acid+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).</li>
<li>Hersberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+the+lipoxygenase+derived+lipid+mediators+in+atherosclerosis%3A+leukotrienes%2C+lipoxins+and+resolvins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins.</a> Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).</li>
<li>Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%3A+implications+for+nutrigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutrigenet.+Nutrigenomics%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics.</a> J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).</li>
<li>Capdevila, J. H., Falck, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+properties+of+the+cytochrome+P450+arachidonic+acid+monooxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).</li>
<li>Ciccimaro, E., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dilution+LC-MS+for+quantitative+biomarker+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis.</a> Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-capture+negative-ion+chemical+ionization+mass-spectrometry+of+lipid+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators.</a> Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).</li>
<li>Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Felectron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization%2Fmass+spectrometry%3A+analysis+of+pentafluorobenzyl+derivatives+of+biomolecules+and+drugs+in+the+attomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range.</a> Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).</li>
<li>Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+IA+%22Encyclopedia+of+Mass+Spectrometry%22">Encyclopedia of Mass Spectrometry</a>. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).</li>
<li>Lee, S. H., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chiral+lipidomics+analysis+by+liquid+chromatography+electron+capture+atmospheric+pressure+chemical+ionization+mass+spectrometry+%28LC-ECAPCI%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS).</a> Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Los estándares y estándares internos utilizados en este protocolo proporcionan una representación de un método lipidómico dirigido. Se utilizó un módulo de separación Waters 2695 y Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra para el análisis LC-MS y la configuración óptima de los parámetros se puede encontrar en las Tablas 1 y 2. Además, este protocolo de extracción fue diseñado para células adherentes, pero puede modificarse para otros tipos de células, así como para otras matrices biológicas, como...

<table><tbody><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-6,8,9,11,12,14,15-d7</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE Estándar interno</td></tr><tr><td>5S-hidroxi-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE Estándar interno</td></tr><tr><td>12S-hidroxi-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[2H8]-12(S)-HETE Estándar interno</td></tr><tr><td>15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico-5,6,8,9,11,12,14,15-d8</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE Estándar interno</td></tr><tr><td>20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico-16,16,17,17,18,18-d6 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE Estándar interno</td></tr><tr><td>9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE Estándar interno</td></tr><tr><td>13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico-9,10,12,13-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE Estándar interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; Estándar interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a Estándar interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 Estándar interno</td></tr><tr><td>9&alfa;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[2H4]-PGD2 Estándar interno</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,19,20,20,20-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 Estándar interno</td></tr><tr><td>5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico-6,7,14,15-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 Estándar interno</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihidroxi-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 ácido</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 Estándar interno</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE</td></tr><tr><td>Estándar 12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, Ácido 8Z,11Z,13E-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, Ácido 14Z-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE Estándar</td></tr><tr><td>8S-hidroxi-5Z,9E,11Z,14Z-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE</td></tr><tr><td>Estándar 11R-hidroxi-5Z,8Z,12E,14Z-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>11S-hidroxi-5Z,8Z,12E, Ácido 14Z-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE Standard</td></tr><tr><td>12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoico</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE Standard</td></tr><tr><td>15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, Ácido 13E-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE Estándar</td></tr><tr><td>15S-hidroxi-5Z,8Z,11Z,13E-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE</td></tr><tr><td>Ácido 20-hidroxi-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE Estándar</td></tr><tr><td>9R-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico</td> ácido <td>Cayman Chemical</td><td>38405</td><td>9(R)-HODE Estándar</td></tr><tr><td>9S-hidroxi-10E,12Z-octadecadienoico</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9(S)-HODE Estándar</td></tr><tr><td>13R-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13(R)-HODE Estándar</td></tr><tr><td>13S-hidroxi-9Z,11E-octadecadienoico</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13(S)-HODE Estándar</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>acid Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF2&alpha; Estándar</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alpha; Estándar</td></tr><tr><td>9&alfa;,11&#946;,15S-trihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oico</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&#946;-PGF2 Estándar</td></tr><tr><td>9&alpha;,15S-dihidroxi-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD2 Estándar</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihidroxi-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Estándar</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihidroxi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Estándar</td></tr><tr><td>5S,12R-dihidroxi-6Z,8E,10E,14Z-ácido eicosatetraenoico</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Estándar</td></tr><tr><td>9&alfa;,11,15S-trihidroxitromba-5Z,13E-dien-1-oic</td><td>ácido Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Solución</td></tr><tr><td>salina tamponada con fosfato</td> estándar <td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>anhidro</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de pentafluorilbencil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agua Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de vidrio de 10 mL</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>Tapón de rosca</td></tr><tr><td>Tapones de rosca fenólicos</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Columna Chiralcel ADH</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>Viales de HPLC</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de HPLC</td><td>Waters WAT094171</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-mass

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

El metabolismo de los ácidos grasos, como el ácido araquidónico (AA) y el ácido linoleico (LA), da lugar a la formación de lípidos bioactivos oxidados, incluyendo numerosos estereoisómeros1,2. Estos metabolitos pueden formarse a partir de ácidos grasos libres o esterificados. Muchos de estos metabolitos oxidados tienen actividad biológica y han sido implicados en diversas enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, asma y cáncer3-7. Los lípidos bioactivos oxidados pueden formarse enzimáticamente o por especies reactivas de oxígeno (ROS). Las enzimas que metabolizan los ácidos grasos incluyen la ciclooxigenasa (COX), la lipoxigenasa (LO) y los citocromos P450 (CYPs)1,8. El metabolismo enzimático da lugar a la formación enantioselectiva, mientras que la oxidación de las ROS da lugar a la formación racémica de productos.
Si bien este protocolo se centra principalmente en el análisis de AA- y algunos metabolitos bioactivos derivados de LA; podría aplicarse fácilmente a metabolitos de otros ácidos grasos. Los lípidos bioactivos se extraen del lisado celular o de los medios mediante extracción líquido-líquido (l-l). Al comienzo del proceso de extracción l-l, se agregan patrones internos de isótopos estables para tener en cuenta los errores durante la preparación de la muestra. La dilución de isótopos estables (SID) también explica las diferencias, como la supresión de iones, que los metabolitos pueden experimentar durante el análisis de espectrometría de masas (MS)9. Después de la extracción, se emplea la derivatización con un reactivo de captura de electrones (EC), bromuro de pentafluorilbencil (PFB) para aumentar la sensibilidad de detección10,11. La monitorización de reacciones múltiples (MRM) se utiliza para aumentar la selectividad del análisis MS. Antes del análisis de MS, los lípidos se separan mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase normal quiral. Las condiciones de HPLC están optimizadas para separar los enantiómeros y los diversos estereoisómeros de los lípidos monitorizados12. Este método específico de LC-MS monitoriza las prostaglandinas (PGs), los isoprostanos (isoPs), los ácidos hidroxieicosatetraenoico (HETEs), los ácidos hidroxioctadecadienoicos (HODEs), los ácidos oxoeicosatetraenoico (oxoETEs) y los ácidos oxooctadecadienoicos (oxoODEs); sin embargo, los parámetros de HPLC y MS pueden optimizarse para incluir cualquier metabolito de ácidos grasos13.
La mayoría de los métodos bioanalíticos disponibles actualmente no tienen en cuenta la cuantificación separada de los enantiómeros. Esto es extremadamente importante cuando se trata de deducir si los metabolitos se formaron enzimáticamente o por ROS. Además, las proporciones de los enantiómeros pueden proporcionar evidencia de una vía enzimática específica de formación. El uso de SID permite una cuantificación precisa de los metabolitos y tiene en cuenta cualquier pérdida de muestra durante la preparación, así como las diferencias experimentadas durante la ionización. El uso del reactivo de captura de electrones PFB aumenta la sensibilidad de detección en dos órdenes de magnitud en comparación con los métodos APCI convencionales. En general, este método, SID-LC-EC-ionización química a presión atmosférica APCI-MRM/MS, es uno de los métodos más sensibles, selectivos y precisos de cuantificación de lípidos bioactivos.

Este protocolo demostrará la extracción y el análisis de ácidos grasos bioactivos libres y esterificados de las células. Los ácidos grasos se cuantifican con precisión mediante dilución de isótopos estables, cromatografía líquida quiral, captura de electrones, ionización química atmosférica, espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

El método tiene como objetivo cuantificar con precisión los metabolitos lipídicos bioactivos celulares mediante la combinación de dilución de isótopos estables, fase cnor, cromatografía líquida, captura de electrones, presión atmosférica, ionización química y espectrometría de masas. Comience por recolectar muestras de medios y células y agregue una mezcla estándar interna marcada con isótopos pesados. Extraiga los lípidos bioactivos con solvente orgánico, luego derive los lípidos bioactivos con un reactivo de captura de electrones y proceda a cuantificar con precisión los lípidos bioactivos mediante cromatografía líquida.La espectrometría de masas a través del análisis LCMS de los resultados del lisado celular y de los medios determina con precisión la concentración de lípidos bioactivos específicos y los niveles de los ER de Anant individuales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la cromatografía líquida de fase reversa, la espectrometría de masas y otros métodos LCMS, es que las anteras individuales y las anteras se cuantifican con precisión mediante el uso de la cromatografía de fase normal en automóvil y la dilución de isótopos estabilizados.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Para probar la interacción de una proteína con su objetivo de lípidos se utilizó MACS y anexina V conjugada con partículas magnéticas y de las vesículas de lípidos sintetizados a partir de los lípidos de destino y fosfatidilserina anexina V vinculante. Proteínas unidas a los lípidos de destino se co-purificados y analizados después de la elución de las cuentas.

Lípidos vesículas mediada por cromatografía de afinidad utilizando magnética clasificación de células activadas (LIMACS): un nuevo método para analizar la interacción de proteínas y lípidos

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Se presenta un protocolo para la extracción completa de lípidos, metabolitos y proteínas de tejidos biológicos utilizando una muestra.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Este artículo presenta un protocolo modular para lipidómica tisular y transcriptómica, y lipidómica plasmática en modelos de ratones de enfermedades neurológicas dirigidos a lípidos subyacentes a la inflamación subyacente y la actividad neuronal, lípidos de membrana, mensajeros aguas abajo y enzimas / receptores subyacentes de ARNm función lipídica subyacente. Se describen los procedimientos de muestreo, procesamiento de muestras, extracción y cuantificación.

Lipidómica y Transcriptómica en Enfermedades Neurológicas

Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Aquí se presenta un método para el cribado de estructuras lipídicas mediante el marcaje de isótopos estables mediante el uso de su tiempo de retención, movilidad y fragmentación.

Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

Describimos un método para utilizar la ciclodextrina para mediar el intercambio entre lípidos de la membrana plasmática con lípidos exógenos. Esta técnica se puede combinar con experimentos que estudian proteínas transmembrana, que se comportan de manera diferente en entornos lipídicos similares a balsas que en entornos no similares a balsas.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Aprende a extraer y cuantificar lípidos bioactivos celulares mediante dilución de isótopos estables y cromatografía líquida-espectrometría de masas. Este protocolo avanza el análisis lipídico.

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass (Video) | JoVE Journal

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

Explorar más videos