Un protocolo para la detección y borrado en fase gaseosa radicales libres en el humo del cigarrillo Mainstream

El objetivo general de este procedimiento es medir la cantidad de radicales libres en el humo principal del tabaco y evaluar la capacidad de captación de varios antioxidantes. Esto se logra primero preparando filtros que contienen varios compuestos captadores diferentes, así como controles sin filtro captador. A continuación, se realiza una simulación de fumado con el humo de cigarrillos de investigación, que pasa a través de una solución de captación de espines.

La resonancia de espín electrónico, abreviada como ESR, se utiliza entonces para registrar espectros de radicales atrapados así como de muestras de referencia. A continuación, los espectros de ESR obtenidos se someten a un análisis rutinario con el fin de separar la señal de los radicales atrapados en fase gaseosa del fondo y cuantificar la concentración de radicales mediante una muestra de referencia. En última instancia, los resultados muestran información cuantitativa sobre el contenido de radicales libres en el humo principal del cigarrillo y estimaciones de la capacidad de captación de antioxidantes naturales mediante espectroscopía de ESR con captación de espín.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes de análisis del humo del tabaco, como la cromatografía de gases, es que la RES es especialmente sensible a los radicales libres. Las implicaciones de esta técnica pueden ayudar a reducir los efectos peligrosos del humo del tabaco, ya que los radicales libres constituyen un grupo importante de carcinógenos. Este método puede aportar información valiosa para el estudio de radicales libres en el humo del tabaco, y también puede aplicarse a otros sistemas, como el humo industrial y el humo de segunda mano. El Centro Nacional de Investigación Biomédica para la tecnología de resonancia de espín electrónico, también conocido como cert, es un derivado de nuestra amplia experiencia en el desarrollo de tecnología moderna de RES.

Para los investigadores dedicados a la resonancia de espín electrónico, ofrecemos una amplia variedad de servicios para ellos y para la comunidad biomédica. Ponemos a disposición nuestras instalaciones regularmente para introducir antioxidantes en el filtro del cigarrillo. Primero, disuelva los antioxidantes, pirogenol y extracto de uva en etanol al 95 % y disuelva licopeno en acetona.

Ajuste los volúmenes del disolvente según la solubilidad de los antioxidantes. A continuación, combine los antioxidantes disueltos con carbón activado agitando en condiciones anaerobias durante aproximadamente 12 horas. Se logran condiciones anaerobias haciendo burbujear Argonne a través de la mezcla mientras se agita.

Tras la incubación, filtre la solución y seque al vacío. A continuación, introduzca los antioxidantes y el carbono en un filtro de acetato convencional cortando primero el filtro en dos piezas. Inserte los antioxidantes vegetales recubiertos entre dos piezas del filtro para formar un sándwich de filtro con antioxidantes, y vuelva a insertarlo en el cilindro de papel del cigarrillo.

Prepare el filtro de control de la misma manera que el filtro antioxidante, excepto que no debe agregar el antioxidante antes del montaje experimental. Los cigarrillos de investigación deben desempacarse y mantenerse en un ambiente de humedad constante utilizando una solución saturada de bromuro de sodio durante un mínimo de dos días. Recupere las varillas de cigarrillo que contienen tabaco y conéctelas al filtro combinado.

Realice una simulación de fumado para análisis de rutina a temperatura ambiente utilizando un dispositivo de fumado de un solo puerto, que consiste en un eyector de agua o una bomba de vacío o compresor de aire conectado al ensamblaje de captura de espín a través de una unión en T con un extremo abierto. Utilice un medidor de flujo para verificar el flujo de gas y ajústelo a aproximadamente 2,2 pies cúbicos estándar por hora regulando una válvula colocada entre la bomba y la salida de ventilación. Fume los cigarrillos de investigación con volúmenes intensos de 35 mililitros durante dos segundos y repita cada 60 segundos.

El extremo abierto del dispositivo para fumar debe taparse para realizar caladas y dejarse abierto entre caladas. Mientras el extremo está destapado, hay poca corriente de aire a través del cigarrillo, lo que corresponde a las condiciones entre caladas. Realice 10 caladas intensas por cada cigarrillo, recolectando los radicales libres en fase gaseosa haciendo pasar el humo principal del cigarrillo a través de una almohadilla de filtro Cambridge y luego introduciéndolo en la solución de captura de radicales.

La trampa de nitrógeno líquido elimina el vapor de agua del humo principal, pero no afecta sustancialmente los radicales en fase gaseosa. Después de la última calada, transfiera una alícuota de la solución de captura burbujeada a un tubo de muestra de vidrio de aproximadamente 25 cm de largo y tres milímetros de diámetro interno. Dado que el oxígeno ensancha los espectros de RPE y disminuye la sensibilidad del método, desoxigene la solución utilizando el método de congelación, bombeo y descongelación: primero sumerja el tubo en nitrógeno líquido, luego evacúe la solución con una bomba de aceite y a continuación descongele la solución bajo argón.

Repita este método de congelación, bombeo y descongelación varias veces. A continuación, selle el tubo al vacío. El tubo ya está listo.

Para mediciones adicionales de RES, registre espectros de RES en banda X en un espectrómetro Bruker EMX a una frecuencia de 9,34 gigahercios. Bajo condiciones estándar, consulte el protocolo escrito para conocer los ajustes típicos del espectrómetro utilizados. Para estos experimentos, realice 25 acumulaciones de RES, lo que normalmente toma aproximadamente 20 minutos.

Aunque las trampas de espín son relativamente estables bajo las condiciones experimentales tras 12 horas, la intensidad de las señales de RPE en solución de benceno disminuyó en un factor de cinco. Para cuantificar la concentración del aducto atrapado, integre el espectro inicial de RPE de primera derivada. El espectro de absorción resultante muestra un fondo ancho de singlete, probablemente debido a productos de hollín y alquitrán presentes en el humo.

Tras la sustracción de este fondo, integre el triplete separado del adicto al atrapamiento. Una vez más, para obtener la concentración del radical libre. Los valores de las integrales dobles para la solución de atrapamiento de espines se comparan con los de una solución de un radical nitroxilo tempo con concentración conocida del experimento aquí demostrado, así como con cálculos adicionales encontrados en el protocolo escrito.

Se obtuvo una concentración de radicales libres en la fase gaseosa del humo principal del cigarrillo de aproximadamente 7,1 veces 10 a la menos nueve molar. A partir de esto, se determinó que el número total de radicales atrapados de la fase gaseosa de un cigarrillo completo es de alrededor de 1,5 veces 10 a la 15. Durante este experimento, las mediciones iniciales condujeron a señales débiles de RES y baja reproducibilidad debido a la humedad en el flujo de humo.

Para resolver este problema, se añadió una trampa de nitrógeno líquido al dispositivo de simulación del humo entre el filtro de Cambridge y la solución de captura de espines. La trampa de nitrógeno líquido eliminó el agua del flujo de humo principal del cigarrillo mediante congelación rápida y la atrapó en la pared interna del tubo de vidrio. Esto mejoró considerablemente las señales de RES y permitió obtener resultados altamente reproducibles.

Se observaron diferentes niveles del efecto de eliminación de antioxidantes vegetales sobre radicales libres en fase gaseosa del humo principal del cigarrillo, y se presentan sus tasas de eliminación. El licopeno y el extracto de semilla de uva mostraron las tasas más altas, mientras que para el pycnogenol se observó una tasa más baja. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora si se lleva a cabo correctamente.

Una vez que se realiza el procedimiento, es importante hacer pasar el humo a través de una trampa de nitrógeno líquido. Esto mejora la calidad del espectro SR y la reproducibilidad una vez desarrollado. La técnica ayudó a los investigadores en salud y medio ambiente a explorar y detectar la presencia de radicales libres que representan un riesgo para la salud en diversos compuestos volátiles.

Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar los radicales libres en el humo principal del tabaco con el fin de reducir los efectos peligrosos del consumo de tabaco.