Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Este procedimiento permite monitorizar en tiempo real la muerte de las células gliales de los oligoDDR. Esto se logra primero cultivando las células, luego las células se preparan para la obtención de imágenes de células vivas. El siguiente paso es proporcionar un tratamiento a las células y monitorizar los efectos mediante microscopía de fluorescencia.

El último paso es realizar el análisis de datos. En última instancia, los resultados muestran tasas de muerte celular en una población celular después de un tratamiento o estímulo mediante el monitoreo de la fluorescencia nuclear de un colorante fluorescente activado por caspasa. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inmunotinción, es la capacidad de recopilar múltiples puntos de tiempo simultáneamente.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como las respuestas a tratamientos farmacológicos, reactivos y diversos. Ahora, este método puede proporcionar información sobre la muerte dentro de los cultivos celulares. También se puede aplicar a otros sistemas, como los tejidos organotípicos ex vivo, incluidos los cortes de cerebro.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades a medida que se adaptan a trabajar con tejido vivo en lugar de tejido fijo. La demostración visual de esta técnica es importante, ya que hay muchos pasos para preparar muestras de células vivas en comparación con el tejido fijo. Primero, descongele las células gliales inmortalizadas de N 19 oligo droog congeladas en un baño de agua a 37 grados Celsius mientras las células se descongelan.

Agregue siete mililitros de DMEM de alta glucosa suplementado con estreptomicina al 10% de FBS y 1% de penicilina a una placa de cultivo de 10 centímetros. A continuación, añada la suspensión celular gota a gota a la placa y agite suavemente la placa de Petri para dispersar las células de manera uniforme. Cultive las células a 34 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono de 5 centavos durante cuatro horas después de cuatro horas.

Aspire los medios de las placas para eliminar cualquier resto de DMSO. Crioprotector. Reemplace con siete mililitros de medio fresco después de cuatro a siete días de crecimiento. Cuando las células hayan alcanzado el 70 al 80% de confluencia, aspire el medio y pipetee un mililitro de goteo en la lámina de células, incubada a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Luego coseche las células de la siguiente semilla, una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros con las células cosechadas a una densidad de 0,1 veces 10 a las seis células por mililitro, y coloque esta placa en la incubadora de cultivo de tejidos. Después de un masaje más, las células se pueden colocar en placas para experimentos de imágenes de células vivas. Para hacer esto, recoja las células como antes, luego retire 30 microlitros de la suspensión celular y cuente las células con un hemocitómetro.

A continuación, use pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento. En los pocillos de una placa de seis pocillos, agregue celdas al pocillo a una densidad de 0.1 por 10 a las seis celdas por mililitro. En dos mililitros de DMEM libre de fenol, los medios de alta glucosa suplementados con 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina permiten que las células crezcan durante la noche a 34 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono antes de la transfección.

Al día siguiente, combine 100 microlitros de medio libre de suero de 0,5 a cuatro microgramos de plásmido purificado, ADN y cuatro microlitros de gen FU hd. Agite suavemente la mezcla dos veces y luego permita que el ADN se acompleja a temperatura ambiente durante cinco minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, agregue la mezcla de ADN HD del gen FU directamente a las células cultivadas.

Incline el plato suavemente para mezclar. A continuación, cultive las células durante 48 horas adicionales a 34 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono antes del tratamiento o la experimentación. En primer lugar, encienda la caja de control del instrumento de célula viva LCI Cham.

Esto debe hacerse tres horas antes de que comience el experimento para asegurar un calentamiento completo de la etapa. Como mínimo, la caja de control debe encenderse una hora antes de comenzar el experimento. A continuación, trabajando en una campana de flujo, rocíe la cámara de cultivo de tipo magnético ligero LCI Cham y las pinzas con etanol al 70% y déjelas secar durante cinco minutos.

Retire las células de la incubadora y examínelas bajo el microscopio para confirmar que están sanas. Las células deben aparecer duraderas y bien distribuidas en el engobe de la cubierta de vidrio con numerosos procesos de membrana. Es probable que las células con un número reducido de extensiones de proceso o con un núcleo de forma irregular estén estresadas por la transfección y no sean adecuadas para experimentos posteriores que trabajen en la campana de flujo.

Incline la placa de seis pocillos y retire el cubreobjetos con pinzas. Coloque rápidamente la cubierta con el lado de la celda deslizante hacia arriba en la placa inferior de la cámara. No permita que la cubierta se seque.

A continuación, coloque el cuerpo principal magnético de la cámara de cultivo y agregue 500 microlitros de medios de la placa original de seis pocillos en la parte superior del cubreobjetos. La reutilización de los medios disminuye la cantidad de estrés ejercido sobre las células causado por los cambios ambientales y también puede ser útil para evaluar los factores segregados extracelulares. Una vez que se haya agregado el medio, coloque la cubierta de vidrio en la cámara de cultivo y use una trenza de toallitas Kim con 70% para eliminar cualquier material residual que pueda interferir con la microscopía desde la parte inferior del cubreobjetos.

Coloque la cámara de cultivo en la incubadora de 34 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Este paso asegurará que la cámara se caliente los 34 grados para reducir el desplazamiento del cubreobjetos. A medida que el metal se calienta, es necesario trabajar con la iluminación ambiental de la habitación lo más baja posible durante los siguientes pasos.

En primer lugar, Þóra preparó previamente elequa de la vista nuclear a temperatura ambiente. A continuación, recupere la cámara de cultivo de la incubadora y colóquela rápidamente en la cámara ambiental del microscopio. Encienda el tanque de dióxido de carbono premezclado al 5% con doble regulador.

A continuación, utilice el objetivo de 10 veces con la lámpara del microscopio ajustada a unos 2,5 voltios y el tiempo de exposición a 240 milisegundos. Enfoque mediante microscopía de campo claro para visualizar las células en el monitor de la computadora. A continuación, añada una concentración de 80 milimolares de iones de potasio u otro inductor de apoptosis a las células mediante el intercambio de medios con perfusión lenta y local utilizando una bomba peristáltica.

El sustrato nuke view 4 88 es estable en cultivo celular para experimentos que duran hasta 36 horas. Por lo tanto, es posible realizar experimentos durante este período de tiempo. Primero configure el microscopio para visualizar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes rojas y verdes.

A continuación, haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. Seleccione y guarde aproximadamente 12 fotogramas en los que haya varias celdas transfectadas y guarde estos puntos de etapa XY. Haga que el microscopio capture imágenes en el canal rojo de campo claro y en el canal verde en estos puntos de etapa guardados cada seis minutos.

Después de recopilar varios puntos XY de experimentos duplicados o triplicados, compile los datos de experimentos separados realizados en días diferentes y realice análisis de datos y pruebas estadísticas como se describe en el protocolo escrito para comparar la proporción de las celdas negativas de la bahía CASP con las celdas positivas de la bahía CASP. El sustrato Nuke view 4 88 puede indicar un aumento de la tasa de apoptosis de los cultivos de células gliales N 19 oligo DDR. Después de un tratamiento con una alta concentración de potasio extracelular, estas imágenes basales se adquirieron utilizando un objetivo de 10 veces.

Las células N 19 se transfectaron con RFP y se trataron con tres microlitros de nuke view, 4 88 de sustrato para las células de control, o tres microlitros de nuke view, 4 88 de sustrato y 80 milimolares de potasio. Estas imágenes ilustran que el número de células apoptóticas aumenta con el tiempo, tres, seis y nueve horas después del tratamiento con 80 milimolares de potasio en condiciones de control, no se observaron cantidades significativas de apoptosis en comparación con los cultivos tratados con 80 milimolares de potasio. La señal verde de fondo observada en las condiciones de control indica las células que están experimentando apoptosis sin la adición de potasio extracelular.

Un curso de 12 horas es adecuado para estudios que involucran lesiones neurológicas Después de 12 horas, los cultivos tratados con potasio demostraron aproximadamente un 45% de muerte celular. Prácticamente ninguna de las células en el experimento de control exhibe apoptosis en el punto de tiempo de 12 horas. Aunque en otras situaciones, es posible que se requiera que los experimentos duren más tiempo.

Este gráfico muestra el aumento de tres células positivas para caspasas en el transcurso del tiempo del experimento de 12 horas. Una vez molestada, esta técnica se puede realizar en una hora y los datos se pueden recopilar durante la noche si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser constante entre los tratamientos Después de este procedimiento.

Otros métodos, como la inmunotinción, se pueden utilizar para observar otras proteínas posteriores implicadas en las vías estudiadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para la obtención de imágenes. Adquiera un conjunto de datos y analice sus datos.