Name: Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a monitorear la apoptosis mediada por caspasa-3 en células oligodendrogliales N19 usando sustrato NucView 488 y microscopía de fluorescencia. Esta técnica permite obtener datos en tiempo real sobre la viabilidad celular.

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Este laboratorio ha sido financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá, y la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá (MSSC). GST fue el beneficiario de una beca de Doctorado de la MSSC. Estamos muy agradecidos con el Dr. Joan Boggs (Hospital para Niños Enfermos de Toronto) para muchas discusiones útiles y comentarios sobre este manuscrito. Estamos muy agradecidos a Biotium por su generosa donación adicional de 488 NucView caspasa-3.

1. La descongelación y el cultivo de células <ol><li> Obtener un balance de congelados inmortalizado N19-oligodendroglial células de largo plazo, las tiendas de nitrógeno líquido. </li><li> Sumerja vial que contiene las células a 37 ° C baño de agua hasta que la suspensión de células esté completamente descongelado. </li><li> 7 ml de DMEM (Dulbecco Modificado Medio de Eagle) con alta glucosa suplementado con 10% de SFB (suero fetal bovino) y 1% de penicilina / estreptomicina a una placa de 10 cm de la cultura. </li><li> Añadir la célula de suspensión, gota a gota a la placa, y agitar suavemente y el rock de la placa de Petri para dispersar las células de manera uniforme. </li><li> Las células de cultivo a 34 ° C / 5% CO 2 incubadora. </li><li> Después de 4 horas, los medios de comunicación aspirado de las placas para eliminar cualquier resto de DMSO (dimetilsulfóxido), que había sido utilizado como un crioprotector, y reemplazar con medio fresco (7 ml DMEM alto de glucosa en medios suplementados con 10% de SFB y 1% de penicilina / estreptomicina) . </li></ol> 2. Las células pases <ol><li> En un 70-80%confluencia (4-7 días de crecimiento), aspirar los medios de comunicación de las células. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina al 0,25% a la placa. Pipeta la tripsina para separar las células (aproximadamente 5 minutos). </li><li> Realizar las diluciones adecuadas para las condiciones experimentales y el paso de un adicional de 10 cm de la placa para futuros experimentos a una densidad celular no menos de 0,1 x 10 6 células / ml. </li></ol> Nota: Es necesario el paso a las células por lo menos dos veces después de la descongelación antes de usarlos para experimentos. 3. Contar y Revestimiento células <ol><li> A las células de la placa de células vivas, imágenes, trypsinize como se describió anteriormente. </li><li> Quite aproximadamente 30 l de las células y el recuento con un hemocitómetro. </li><li> Coloque un cubreobjetos de vidrio sin recubrimiento en una placa de 6 pocillos. Agregar celdas a la pocillos a una densidad de 0,1 x 10 6 células / ml en 2 ml de fenol libre de DMEM alto de glucosa en los medios de comunicación, suplementado con FBS al 10% y el 1% de penicilina / estreptomicina, a los 34 ° C / 5% CO 2. </li><li> Permitirlas células a crecer durante la noche (16-20 h) a 34 ° C / 5% de CO 2 antes de la transfección. </li></ol> 4. Transfección <ol><li> Combine 100 l medio libre de suero, 0.5-4 mg purificada ADN plásmido, y 4 l HD FuGENE (Roche). Vortex suavemente para mezclar. </li><li> Vortex de nuevo brevemente y permitir que el ADN al complejo por 5 min a temperatura ambiente, y luego añadir FuGENE mezcla de ADN de alta definición directamente en las células cultivadas. Incline la placa suavemente para mezclar. </li><li> Cultivar las células durante 48 horas a 34 ° C / 5% de CO 2 antes del tratamiento o la experimentación. </li></ol> 5. Las células para la preparación de imágenes de células vivas (LCI) <ol><li> Encienda el LCI Chamlide células vivas, caja de control de instrumentos por lo menos 1 hora antes de que desea iniciar el experimento. La caja de control regula la temperatura y la humedad dentro de la Chamlide LCI, y regula el flujo de la premezcla 5% de CO 2. </li></ol> Nota: Es aconsejablea su vez en la caja de control de hasta 3 horas antes del comienzo experimentos para asegurarse de que toda la etapa alcanza 34 ° C. Este paso será reducir la deriva de coordinación, que es causada por fluxulation y la expansión térmica de la fase de metal que se calienta, durante la exploración. <ol start="2"><li> Trabajar en una campana de flujo, rocíe el Chamlide de tipo magnético cámara de cultivo, y las pinzas, con el 70% de etanol y dejar que se sequen durante 5 minutos. </li><li> Eliminar las células de la incubadora y confirmar que están sanos. Deben aparecer adherente y bien extendidas sobre el portaobjetos de vidrio con numerosos procesos de membrana. Las células que se destacó de la transfección no son adecuados para la experimentación, y tendrán una reducción del número de extensiones de proceso, y con frecuencia tienen un núcleo de forma irregular. </li><li> La inclinación de la placa de 6 pocillos y retirar el cubreobjetos con unas pinzas. Rápidamente coloque el lado de células cubreobjetos hasta en la placa inferior de la cámara de cultivo. No permita que el cubreobjetos se sequen. </li><li> Conecte el magnético principalcuerpo de la cámara de cultivo y añadir 500 l de los medios de comunicación a partir de los 6 originales y placa en la parte superior del cubreobjetos. Re-utilizando este medio para disminuir la cantidad de tensión puesta en las células causados ​​por cambios ambientales, y también puede ser útil para la evaluación de factores secretados extracelular. </li><li> Coloque la tapa de cristal en la cámara de cultivo. </li><li> Use un KIMWIPE rociado con etanol al 70% para eliminar cualquier material residual de la parte inferior del cubreobjetos, que podría interferir con el microscopio. </li><li> Coloque la cámara de cultivo en los 34 ° C / 5% incubadora de CO 2 durante 30 minutos. Este paso se asegurará de que la propia cámara se calienta a 34 ° C para reducir el desplazamiento del cubreobjetos ya que el metal se calienta. </li></ol> 6. Configuración del microscopio Las imágenes fueron adquiridas aquí usando un microscopio Leica DMIRE2 invertida con una lente de relé de la costumbre y de emisión de la vivienda rueda de filtros de cartucho de carga de ruedas múltiples (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON). <ol><li> Campo claro - de luz en 2,5 V y el tiempo de exposición a 240 ms. </li><li> Proteína fluorescente roja (RFP) - Ganancia fijado en 140 por 200 ms. </li><li> La proteína verde fluorescente (GFP) - Ganancia fijado en 140 por 500 ms. </li><li> Nuestro microscopio tiene una lámpara regulable en lugar de un disco giratorio para controlar la cantidad de luz disponible para las células. Realizamos nuestros experimentos con la luz en un 90% de la intensidad máxima de la lámpara. </li></ol> 7. El tratamiento de células con inductores de apoptosis y NucView 488 sustrato de la caspasa-3 <ol><li> Es importante preparar grandes cantidades de inductores de la apoptosis antes de tiempo y congelar en alícuotas, de modo que las concentraciones serán consistentes entre los experimentos. </li><li> El NucView 488 sustrato es sensible a la luz. Preparar alícuotas de 15 l para reducir los tubos de congelación / descongelación, y guardar a -20 ° C cubierto con papel de aluminio. Trabajo con la iluminación ambiental de la sala lo más bajo posible para reducir la exposición de la NucVea 488 de sustrato a la luz, antes de su uso. </li><li> Recuperar la cámara de cultivo rápido de la incubadora para que las células no están expuestos a una reducción de la temperatura. Coloque la cámara de cultivo en la cámara ambiental del microscopio, y el uso de pinzas para mantener la cámara de cultivo que se mueva. En este punto también debe atenuar las luces de la habitación. </li><li> Encienda el 5% premezcla cilindro de CO 2 con regulador dual. </li><li> Usando el objetivo de 10x, enfoque para encontrar células en el monitor de la computadora usando el microscopio de campo brillante. Nota: usted desea utilizar la mayor apertura numérica del objetivo con la ampliación deseada para reducir el tiempo de exposición. </li><li> Ofrecer inductores de la apoptosis de las células (en nuestro caso, potasio 80 mM o 100 mM de glutamato), uno de los siguientes métodos se pueden utilizar. Vamos a recurrir a la entrega de potasio 80 mM como un ejemplo, utilizando KCl disuelto como un concentrado de 10 veces en nuestros medios de comunicación la cultura típica. <ol><li> Medios de intercambio by lenta y locales de perfusión: - Use una bomba peristáltica a los medios de cambio en la cámara de cultivo con nuevos medios de comunicación que contiene 80 mM de potasio. - Uno de los extremos de la tubería ofrecerá 10 ml de un stock de 80 mM de potasio disuelto en fenol libre de DMEM, y el otro extremo de la tubería se extraiga material de la cámara. - Usted quiere que por lo menos un cambio 10 veces de los medios de comunicación para asegurar que los medios de comunicación quedan en la cámara tiene la concentración correcta de potasio. - Después de los medios de comunicación se intercambia, añadir 3 l de 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara. Pipeta para mezclar. </li><li> Adición directa de 80 mM de K + y 488 NucView sustrato a los medios de comunicación en la cámara de la cultura: - Preparar una solución madre 10 veces más de potasio 80 mM disuelto en fenol libre de DMEM. - Añadir 3 l de 488 NucView sustrato a 50 l de potasio 10x 80 mm. Pipeta para mezclar. Añadir a 500 l de fenol-DMEM libre en cámara de cultivo. Nota: este método espreferible si usted está interesado en el mantenimiento o la evaluación del crecimiento u otros factores secretados que pueden estar presentes en los medios de comunicación original. Hemos encontrado que el 488 NucView sustrato es estable en el cultivo de células para los experimentos que dura hasta 36 h. </li></ol></li></ol> 8. Imágenes de células vivas <ol><li> Haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. </li><li> Seleccionar y guardar alrededor de una docena de cuadros donde hay varias células transfectadas, y guardar estos "puntos XY etapa". Dependiendo de la cantidad de memoria del ordenador, es posible que se limita al número de puntos de la etapa que va a ser capaz de adquirir. </li><li> Tienen las imágenes de la captura de microscopio (en campo claro, canal rojo y canal verde) en estas etapas guardan puntos cada 6 minutos. </li><li> Alguna mancha verde que es visible durante las primeras etapas de los experimentos de probabilidades indica que las células que ya están sometidas a la apoptosis, por lo general para la transfección y / o el estrés ambiental. Apoptosis, debido a los tratamientos experimentales se detectó en un punto de tiempo después del experimento. </li></ol> 9. Análisis estadístico <ol><li> Para cada experimento, se programa el microscopio para adquirir varios puntos de XY para reunir un gran conjunto de datos de manera eficiente. Cada experimento se realiza por duplicado o triplicado, y compilar los datos de distintos experimentos realizados en días diferentes. Cada conjunto de datos, se analizan hasta 15 campos de ver y comparar la relación de la caspasa-negativos células de la caspasa-células positivas (número total de células en el campo de visión / número total de la caspasa-células positivas). </li><li> Las medidas registradas por cada conjunto de datos se agrupan en un conjunto de muestras más grandes, y se comparan entre sí mediante una tabla de ANOVA (p = 0,05). Se muestran los errores estándar de la media (SEM) de cada experimento, y luego comparar la diferencia de medias mediante la realización de una prueba de comparación de los medios de Tukey (p = 0,05) para determinar quICH tratamientos son muy diferentes unos de otros. </li></ol> 10. Resultados representante Hemos descrito un experimento para ilustrar cómo el NucView 488 sustrato puede indicar una mayor tasa de apoptosis de N19-OLG cultivos celulares siguiendo un tratamiento con una concentración alta de potasio extracelular. El N19-células fueron transfectadas con PP, y fueron tratados con 3 l NucView 488 substrato (control), o 3 l de sustrato NucView 488 y 80 mm [K +] (tratamiento). Las células fueron controlados y las imágenes fueron adquiridas en un curso de 12 h, lo cual es adecuado para los estudios con insultos neurológicos (Figura 1A). En las condiciones de control, no observamos una cantidad significativa de apoptosis en comparación con el 80 mM [K +] cultivos tratados (cuadro hash), que mostró aproximadamente 45% la muerte celular después de 12 h (fig. 1B). La luz verde de fondo observard en las condiciones de control indica que las células que se someten a la apoptosis, sin la adición de potasio extracelular. Prácticamente ninguna de las células de la apoptosis de control de exhibición experimento por el punto de tiempo de 12 h, aunque en otras situaciones, los experimentos pueden ser obligados a largo plazo. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10x. Bar = 100 micras. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg"> <img alt="Figura 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg"> Figura 1. (A) Un tiempo de 12 h experimento curso de N19 culturas OLG 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo) junto con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde). Los cultivos fueron tratados con una concentración final de 80 mM [K +] (paneles de la izquierda), o ningún tratamiento en el control (paneles de la derecha). Las imágenes fueron adquiridas en intervalos de 6 minutos, y la activación significativa de exfoliados caspasa-3 (señal verde) se puede observard en los cultivos tratados con 80 mM [K +] dentro de los núcleos celulares (cuadro de hash) en comparación con el experimento de control. (b) Porcentaje de la caspasa-3 cortado las células (que se calcula dividiendo el número total de células en el campo de visión el número total de la caspasa-células positivas). En comparación con el control de las condiciones, se observó un 45% la muerte celular después de K +-tratamiento por 12 h. S-Video 1. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con brillantes imágenes de campo y una de tres vías imagen fusionada, tras el tratamiento con 80 mM [K +]. S-Video 2. Un tiempo de 12 h por supuesto experimento de N19-OLG culturas 48 h después de la transfección expresan RFP-MBP (canal rojo), con 3 l de 488 NucView sustrato (canal verde), junto con el campo brillante images y una imagen de tres vías combinadas. No hay un tratamiento se aplicó a las culturas y N19-OLGs se puede ver a través de la migración campo del microscopio, en contraste con los cultivos celulares tratados con 80 mM [K +] (comparar con el S-Video 1).

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Aunque este no es el único producto disponible para fluorogénico detección de la apoptosis, hay varias ventajas de utilizar el sustrato NucView 488. Una de las principales ventajas es la capacidad de seguir la apoptosis en células vivas en tiempo real, mientras que la mayoría de los productos alternativos o bien requieren la lisis celular o la permeabilidad celular pobres. Otros beneficios incluyen una alta sensibilidad para el reconocimiento de la caspasa-3, la permeabilidad celular de alta, baja citotoxicidad, y no hay interferencia con la progresión de la apoptosis. El sustrato también tiene antecedentes de fluorescencia bajo hasta que se rompe y entra en el núcleo, lo que elimina la fluorescencia de fondo. La secuencia de reconocimiento de la caspasa-3 contiene tres cargas negativas y el tinte de unión al ADN tiene una carga positiva 2. El DEVD-NucView 488 molécula por lo tanto tiene una carga neta negativa, lo que impide la activación y la unión del colorante en el ADN en las células donde no está activa la caspasa. Maintaining consistencia entre los experimentos se requiere para poder hacer comparaciones significativas entre repeticiones. Uno de los principales parámetros para mantener constante es la densidad celular, ya que afecta a la tasa de transfección. La obtención de altas tasas de transfección en inmortalizado N19-OLG cultivos celulares es más difícil que con otras líneas celulares comunes, tales como HeLa o HEK293, y es altamente dependiente de la densidad, en nuestra experiencia, 12, 13. Nuestra mejor eficiencia de transfección de estas células se han obtenido con Fugene HD (Roche) y normalmente son alrededor del 15%, pero puede llegar a más del 30%, dependiendo de la construcción. Recuento de células cuidado ayudará en la obtención de tasas consistentes de transfección. También es importante para exponer las células a partir de diferentes tratamientos en el mismo grado de estrés ambiental, especialmente en la medición de los índices de apoptosis. En concreto, la longitud de tiempo durante el cual las células son expuestas a reactivos de transfección, o la cantidad de exposición a la luz, son importantes variables ambientalesvariables a considerar, y debe seguir siendo constante a través de experimentos. Para nuestras aplicaciones, hemos encontrado que la recopilación de un gran número de campos de visión proporciona un tamaño de muestra suficientemente grande como para hacer comparaciones estadísticamente significativa [ibid].

Tabla de reactivos y equipos específicos <table border="1"><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> NucView 488 Kit de caspasa-3 ensayo de células en vivo </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD reactivo de transfección </td><td> Roche </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modificado Medio Eagle </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 mm de vidrio cubreobjetos </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB magnética cultura de la cámara de 25 mm cubreobjetos </td&gt; <td> Tecnologías de quórum </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart cultivo de tejidos platos de 10 cm </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD Falcon 6-y platos de cultivo de tejidos </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y cleaveable sustratos fluorogenic-dye después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

El sistema nervioso central pueden experimentar una serie de tensiones e insultos neurológicos, que pueden tener numerosos efectos adversos que en última instancia conducir a una reducción de la población neuronal y la función. Axones dañados pueden liberar moléculas excitatorios como el potasio o el glutamato en la matriz extracelular, que a su vez, pueden producir más insultos y daños a las células gliales de apoyo incluyendo los astrocitos y oligodendrocitos 8, 16. Si la lesión persiste, las células se someten a la muerte celular programada (apoptosis), que está regulada y activada por una serie de bien establecida cascadas de transducción de señales 14. Apoptosis y necrosis de los tejidos puede ocurrir después de una lesión cerebral traumática, la isquemia cerebral y convulsiones. Un ejemplo clásico de regulación de la apoptosis es dependiente de la familia de cisteína-aspartato dirigida proteasas o caspasas. Proteasas activadas incluyendo las caspasas también han sido implicados en la muerte celular en respuesta a la neuro crónicaenfermedades degenerativas como el Alzheimer, Huntington, esclerosis múltiple y 4, 14, 3, 11, 7. En este protocolo se describe el uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato para medir la velocidad de la caspasa-3 en la apoptosis mediada por inmortalizado N19-cultivos de células de oligodendrocitos (OLG) 15, 5, tras la exposición a diferentes tensiones extracelulares, tales como altas concentraciones de potasio o el glutamato. El condicionalmente inmortalizada N19-OLG línea celular (lo que representa el progenitor O2A) se obtuvo del Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Instituto de Neurociencias) 15, 5, y ha sido utilizado previamente para estudiar los mecanismos moleculares de la expresión génica de mielina y la transducción de la señal principal OLG a la diferenciación (por ejemplo, 6, 10). Hemos encontrado que esta línea celular para ser robusto con respecto a la transfección con exógenos proteína básica de mielina (MBP) construye fusionado a GFP o RFP o (rojo o proteína verde fluorescente) 13,12. En este caso, los cultivos celulares N19-OLG fueron tratados con 80 mM de cloruro de potasio o de sodio 100 mM de glutamato para imitar las fugas axonal en la matriz extracelular para inducir la apoptosis 9. Se utilizó un bi-funcional de la caspasa-3 que contiene un sustrato DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspasa-3 subunidad de reconocimiento y un tinte de unión al ADN 2. El sustrato rápidamente entra en el citoplasma, donde es degradado por la caspasa-3 intracelular. El medio de contraste, NucView 488 se libera y entra en el núcleo celular donde se une el ADN y el verde fluorescente a 488 nm, lo que indica la apoptosis. El uso de la NucView 488 caspasa-3 sustrato permite células vivas imágenes en tiempo real 1, 10. En este video, también se describe el cultivo y la transfección de células inmortalizadas N19-OLG, así como células vivas, las técnicas de imagen.

Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con el<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspasa-3 sustrato. Esta técnica es aplicable para los ensayos de la muerte celular programada en tiempo real en una variedad de tipos de células y tejidos.

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

El sistema nervioso central puede experimentar una serie de tensiones e insultos neurológicos, los cuales pueden tener numerosos efectos adversos que, en última instancia, conducen a un...

Este procedimiento permite monitorear en tiempo real la muerte celular glial inducida por oligo DDR. Esto se logra primero cultivando las células, luego preparándolas para la obtención de imágenes en células vivas. El siguiente paso consiste en aplicar un tratamiento a las células y monitorear los efectos mediante microscopía de fluorescencia.El paso final consiste en realizar el análisis de datos. En última instancia, los resultados muestran las tasas de muerte celular en una población celular tras un tratamiento o estímulo, mediante el seguimiento de la fluorescencia nuclear de un colorante fluorométrico activado por caspasa. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la tinción inmunológica es la capacidad de obtener múltiples puntos temporales simultáneamente.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como las respuestas a tratamientos farmacológicos, reactivos y diversos tratamientos. Ahora, este método puede proporcionar información sobre la muerte en cultivos celulares. También puede aplicarse a otros sistemas, como tejidos organotípicos y ex vivo, incluyendo cortes de cerebro.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades mientras se adaptan a trabajar con tejido vivo en lugar de tejido fijado. La demostración visual de esta técnica es importante, ya que hay muchos pasos para preparar muestras de células vivas en comparación con el tejido fijado. Primero descongele las células gliales inmortalizadas N 19 oligo droog congeladas en un baño de agua a 37 grados Celsius mientras las células se descongelan.Añada siete mililitros de DMEM con alta glucosa suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a una placa de cultivo de 10 centímetros. Luego, agregue la suspensión celular gota a gota a la placa y agite suavemente la placa de Petri para distribuir las células de manera uniforme. Incube las células a 34 grados Celsius en un incubador con 5 centímetros cúbicos de dióxido de carbono durante cuatro horas tras cuatro horas.Aspire el medio de las placas para eliminar cualquier resto de crioprotector DMSO. Reemplace con siete mililitros de medio fresco después de cuatro a siete días de crecimiento. Cuando las células hayan alcanzado una confluencia del 70 al 80 %, aspire el medio y agregue mediante pipeta un mililitro de medio gota a gota sobre la capa de células, e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, recolecte las células y siembre en un plato de cultivo de tejidos de 10 centímetros con las células recolectadas a una densidad de 0,1 veces 10 a la seis células por mililitro, y coloque este plato en el incubador de cultivo de tejidos. Tras un nuevo pasaje, las células pueden sembrarse para experimentos de imágenes de células vivas. Para ello, recolecte las células como antes, luego retire 30 µL de la suspensión celular y cuente las células utilizando un hemocitómetro.A continuación, utilice pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio sin recubrir. En los pocillos de una placa de seis pocillos, agregue células al pocillo a una densidad de 0,1 veces 10 a la seis células por mililitro. En dos mililitros de medio DMEM con alta concentración de glucosa, libre de fenol, suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina, deje crecer las células durante la noche a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono antes de la transfección.Al día siguiente, combine 100 microlitros de medio sin suero con 0,5 a cuatro microgramos de ADN plasmídico purificado y cuatro microlitros de FU gene hd. Vortexice suavemente la mezcla dos veces y luego deje que el ADN forme complejos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, agregue la mezcla de ADN de FU gene HD directamente a las células cultivadas.Incline suavemente la placa para mezclar. A continuación, cultive las células durante 48 horas adicionales a 34 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono antes del tratamiento o experimentación. Primero encienda la caja de control del instrumento de células vivas LCI Cham light.Esto debe hacerse tres horas antes de que comience el experimento para garantizar un calentamiento completo de la platina. Como mínimo, la caja de control debe encenderse una hora antes de iniciar el experimento. A continuación, trabajando en una cabina de flujo laminar, rocíe la cámara de cultivo magnética tipo LCI Cham Light y las pinzas con etanol al 70 % y déjelas secar durante cinco minutos.Retire las células del incubador y examínelas bajo el microscopio para confirmar que se encuentran sanas. Las células deben presentarse duras y bien extendidas sobre el cubreobjetivo de vidrio, con numerosos procesos de membrana. Las células con un número reducido de extensiones procesales o con un núcleo de forma irregular probablemente estén estresadas debido a la transfección y no son adecuadas para experimentos posteriores que se realicen en la cabina de flujo laminar.Incline la placa de seis pocillos y retire el cubreobjetos con pinzas. Coloque rápidamente el cubreobjetos con la cara de las células hacia arriba en la placa inferior de la cámara. No permita que el cubreobjetos se seque.A continuación, fije el cuerpo magnético principal de la cámara de cultivo y añada 500 microlitros de medio procedente de la placa de seis pocillos original sobre la parte superior del cubreobjetos. Reutilizar el medio disminuye la cantidad de estrés impuesto a las células debido a cambios ambientales y también puede ser útil para evaluar factores secretados extracelulares. Una vez añadido el medio, coloque el cubrevidrio sobre la cámara de cultivo y utilice una mecha de toallitas Kim con 70 % para eliminar cualquier material residual que pudiera interferir con la microscopía en la parte inferior del cubreobjetos.Coloque la cámara de cultivo en el incubador a 34 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Este paso garantizará que la cámara misma se caliente a 34 grados, lo que reduce el desplazamiento del cubreobjetos. A medida que el metal se calienta, es necesario trabajar con la iluminación ambiental de la habitación lo más baja posible durante los siguientes pasos.Primero, Thora previamente preparó elequa de vista nuke a temperatura ambiente. Luego, retire la cámara de cultivo del incubador y colóquela rápidamente en la cámara ambiental del microscopio. Encienda el tanque de dióxido de carbono al 5 % premezclado con regulador doble.A continuación, utilizando el objetivo de 10 aumentos, ajuste la lámpara del microscopio a aproximadamente 2,5 voltios y el tiempo de exposición a 240 milisegundos. Enfoque mediante microscopía de campo claro para visualizar las células en la pantalla del ordenador. Luego, añada una concentración de 80 milimolar de ion potasio u otro inductor de apoptosis a las células mediante el intercambio del medio con perfusión lenta y local utilizando una bomba peristáltica.El sustrato nuke view 4 88 es estable en cultivo celular para experimentos que duran hasta 36 horas. Por lo tanto, es posible realizar experimentos durante este período de tiempo. Primero configure el microscopio para visualizar la fluorescencia de las proteínas fluorescentes roja y verde.Luego, haga clic en el canal rojo para mostrar las células transfectadas. Seleccione y guarde aproximadamente 12 cuadros donde haya varias células transfectadas, y guarde estos puntos del escenario XY. Configure el microscopio para que capture imágenes en los canales de campo claro, rojo y verde en estos puntos del escenario guardados cada seis minutos.Después de recopilar múltiples puntos XY a partir de experimentos duplicados o triplicados, compile los datos de experimentos separados realizados en diferentes días y realice el análisis de datos y las pruebas estadísticas según se describe en el protocolo escrito para comparar la proporción de células negativas para CASP bay respecto a células positivas para CASP bay. El sustrato Nuke view 4 88 puede indicar una tasa aumentada de apoptosis en cultivos de células gliales oligo DDR N 19. Tras un tratamiento con una concentración elevada de potasio extracelular, estas imágenes de referencia se adquirieron utilizando un objetivo de 10 veces.Las células N 19 fueron transfectadas con RFP y se trataron ya sea con tres microlitros de nuke view, sustrato 4 88 para las células de control, o con tres microlitros de nuke view, sustrato 4 88 y 80 milimolares de potasio. Estas imágenes ilustran que el número de células apoptóticas aumenta con el tiempo, a las tres, seis y nueve horas después del tratamiento con 80 milimolares de potasio. Bajo condiciones de control, no se observaron cantidades significativas de apoptosis en comparación con los cultivos tratados con 80 milimolares de potasio. La señal verde de fondo observada en las condiciones de control indica las células que están experimentando apoptosis sin la adición de potasio extracelular.Un curso temporal de 12 horas es adecuado para estudios que involucran lesiones neurológicas. Después de 12 horas, los cultivos tratados con potasio mostraron aproximadamente un 45 % de muerte celular. Casi ninguna de las células en el experimento control exhibe apoptosis al punto temporal de 12 horas. Aunque en otras situaciones, puede ser necesario que los experimentos se prolonguen más tiempo.Este gráfico muestra el aumento en el número de células positivas para caspasa tres a lo largo del curso temporal del experimento de 12 horas. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora y los datos pueden recolectarse durante la noche si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la consistencia entre los tratamientos siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como la tinción inmunológica, pueden utilizarse para observar otras proteínas descendentes implicadas en las vías estudiadas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para su visualización, adquirir un conjunto de datos y analizar sus datos.

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Investigación

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Neurociencia

Este video describe un ensayo luminiscente in vitro de Caspasa-3/7 para cuantificar la muerte celular o la apoptosis. El ensayo mide la luminiscencia producida después de la escisión de caspasa-3/7 de un sustrato DEVD proluminiscente. La luminiscencia generada es proporcional a la actividad de la caspasa-3/7.

Ensayo de Caspasa-3/7: Un ensayo basado en luminiscencia para cuantificar la apoptosis midiendo las actividades de Caspasa-3/7 en explantes de piel de rana

Este video demuestra la activación de proteínas caspasas en macrófagos humanos utilizando proteínas reporteras de complementación de fluorescencia bimolecular. Los prodominios de la caspasa-1 se fusionan con fragmentos no fluorescentes de las proteínas de Venus, que se reclutan para los complejos de inflamasoma. La proximidad de los inflamasomas induce el repliegue y la fluorescencia de los fragmentos de Venus, lo que confirma la activación de las caspasas en los macrófagos.

Visualización de la activación de caspasas en macrófagos derivados de monocitos humanos

Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados ​​en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Para abordar los mecanismos de desmielinización y apoptosis neuronal en lesiones corticales de trastornos inflamatorios desmielinizantes, se utilizan diferentes modelos animales. Aquí describimos un enfoque ex vivo mediante el uso de células T CD8+ específicas de oligodendrocitos en cortes de cerebro, lo que resulta en la muerte oligodendroglial y neuronal. Se discuten las posibles aplicaciones y limitaciones del modelo.

Una Ex vivo Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Este protocolo describe un método de imágenes de células vivas para monitorear la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis, utilizando sondas fluorescentes que detectan cambios en la integridad y acidificación de la membrana lisosomal.

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Aprende a monitorear la apoptosis mediada por caspasa-3 en células oligodendrogliales N19 usando sustrato NucView 488 y microscopía de fluorescencia. Esta técnica permite obtener datos en tiempo real sobre la viabilidad celular.

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por (Video) | JoVE Journal

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