Name: Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a realizar grabaciones ERG transretinales en retina de ratón para obtener fotorespuestas de bastones y conos. Este método permite registrar respuestas fotoreceptoras aisladas con precisión.

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Con el apoyo de premio a la Trayectoria para el Desarrollo de la Investigación y Prevención de la Ceguera, las subvenciones del NIH EY19312 y EY19543 (VJK), así como por la subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera y la EY02687 (Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la Universidad de Washington).

1. Haciendo electrodos <ol><li> Preparar electrodos de vidrio. Pesar 120 mg de agar y se mezcla en 10 ml de agua destilada (concentración final de 1,2% de agar). Derretir la solución de agar en un baño de agua caliente. Llenar capilares de vidrio (que se usen instrumentos de Word Presision TW100-4 capilares con las siguientes dimensiones: longitud = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, y el volumen interno = 44 l) con la solución de agar con una jeringa de plástico. Solidificar el agar a temperatura ambiente durante 10 min. Así, hasta ~ 200 capilares puede ser llenado (el resto de la mezcla de agar puede ser almacenado a -4 ° C y reutilizados varias veces). </li><li> Cortar los capilares en mitades utilizando una cuchilla de diamante. </li><li> Remoje los electrodos de vidrio resultantes en solución ratón electrodo por lo menos 24 horas a 4 ° C. Almacenar los electrodos a 4 ° C y utilizarlos durante el período de 3-4 meses. </li></ol> 2. Configuración del experimento <ol><li> Dark-adaptación de un ratón durante la noche. El uso de tipo salvaje (por ejemplo, C57Bl / 6) para los ratones varilla impulsadas grabaciones transretinal y alfa T - / - ratones que carecen de barra de señalización de 8 para las grabaciones de cono transretinal. </li><li> Preparar una solución de perfusión L, 100 ml de solución electrodo, y 20 ml solución de incubación (véase más adelante) y filtrar la solución a través de perfusión un Millipore 0,45 micras o 0,22 micras filtro (opcional). </li><li> Calibrar la fuente de luz (505 nm LED o estimulador bombilla halógena óptico) utilizando un fotómetro colocado en el plano de la retina. En el caso de fuente de luz LED, utilizar un difusor óptico para conseguir una uniformidad de luz. </li><li> Prepare la cámara de perfusión para el experimento (construcciones de la cámara puede variar). Nuestra cámara está hecho de plexiglás 3 mm, con una parte inferior hecha de la tapa de un pequeño plato de Petri de plástico, y tiene un volumen de perfusión activa de ~ 400 l (l = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Llenar el espacio electrodo inferior de la cámara con una solución de electrodo que contiene 2 mM de L-glutamato y 10 mM de BaCl 2. Usando un tubo de plástico y de vidrio un capilar, realizar una conexión entre la solución en el espacio electrodo inferior (hecho de conector de tubo de plástico unido a la parte inferior de la cámara) y el soporte del electrodo. Asegúrese de que no hay burbujas en el electrodo, los tubos de conexión, o el titular de electrodo (purgar la solución con la jeringa de plástico si es necesario). </li><li> Montar la cámara de grabación en la platina del microscopio (opcional: el microscopio puede ser montado en una mesa anti-vibración y protegido dentro de una jaula de Faraday para minimizar el ruido mecánico y electromagnético). Conectar el soporte de electrodo inferior al polo positivo cabezal de la platina del amplificador diferencial (por ejemplo, Warner Instrumentos DP-311 amplificador). Centro y alinear el electrodo de la cámara baja la apertura de los puntos de luz de estímulo. Conecte la línea de perfusión a la cámara de grabación y gire a la perfusión en el. </li><li> Burbuja de la perfusión de solución con 95% de O 2/5% CO 2, mientras que la incubación de 40 ° C water baño. CO 2 ajusta el pH de la solución a 7,2. La solución fluye desde la botella a la cámara de grabación por la gravedad que pasa a través de una resistencia cerámica recalentar a 36-37 ° C. Para reducir la pérdida de calor, el calentador debe estar situada lo más cerca de la cámara de grabación como sea posible, idealmente en la platina del microscopio. </li><li> Con un regulador de flujo ajustar la velocidad de flujo a aproximadamente 1 ml / min. </li><li> Conectar el electrodo superior a la segunda (negativo) polo de la cabezal de la platina utilizando un soporte de electrodo segundos. Obligar a la sonda del termopar al electrodo superior mediante una junta tórica. Asegurarse de que las puntas de los electrodos y el termopar están muy juntas de modo que la lectura de la temperatura se toma como cerca del centro de la retina como sea posible. Sumergir la punta del electrodo superior en la solución de perfusión y lo coloca en el centro de la cámara. Permitir 10-15 minutos para la estabilización de referencia. </li><li> Ajustar la tensión de CC para el calentador de manera que la temperatura de la solución es 36 -37 ° C. </li></ol> 3. Aislamiento de la retina del ratón <ol><li> Bajo una luz roja tenue, la eutanasia el ratón adaptado a la oscuridad con CO 2 y la dislocación cervical. Opcional: hacer una marca de referencia en cada ojo del ratón mediante la cauterización, el punto más dorsal de la esclerótica con una pluma de cauterio o pines climatizada de disección. Todos los procedimientos posteriores se realizan bajo la luz infrarroja usando convertidores de imagen infrarroja de ajuste a un microscopio de disección. </li><li> Diseccionar los ojos con tijeras curvas, aplicando una presión suave y estiramiento de la piel a los lados de cada ojo. Hemisect ambos ojos bajo iluminación infrarroja usando microtijeras o una hoja de afeitar. </li><li> Retire la córnea y el cristalino. Eliminar la mayor cantidad de vítreo como sea posible. </li><li> Pelar la retina primero desde la capa de epitelio de pigmento y, si es necesario, es importante limpiarlo con pinzas para eliminar gránulos restantes de epitelio de pigmento. Estamos típicamente usando retina completa tanto para la varilla y transret conograbaciones Inal. Sin embargo, si desea grabar en concreto de la parte dorsal de la retina del ratón que tiene más de M / L-9 conos, antes de pelar la retina quitar la parte ventral de la ojera con una hoja de afeitar o microtijeras uso de la marca cauterio como una referencia. </li><li> Coloque el globo ocular hemiseccionaron segundos en una pequeña placa de Petri con solución de incubación y se incuba la preparación en una caja hermética a la luz saturada con oxígeno puro hasta su uso. Normalmente, en estas condiciones la copa ocular segundo ratón se pueden almacenar durante varias horas a temperatura ambiente y se utiliza para las grabaciones. </li><li> Utilizando una pipeta de plástico o vidrio transferir la retina aislada a una gota de solución de perfusión (ca. 300 l) en la tapa de una placa de Petri. Añadir 5-6 gotas de solución de electrodos que contienen BaCl 2 al pre-incubar la retina con BaCl 2. Coloque un pedazo cuadrado (5x5 mm CA) de la parte de atrás de esquina engrasado (se utiliza el lubricante Dow Corning 111 de la válvula y sellador) Millipore filtro de papel (0,45 micras HARG tipo) con pre-hecho agujero en su centro (2-2,5 mm de diámetro) a la solución gota mismo. Utilizando posición fórceps la retina en la parte superior del papel de filtro (lado fotorreceptor arriba) y presione sus bordes en la periferia a plana montarla. La retina debe estar centrada sobre la abertura en el papel de filtro. </li><li> Con unas pinzas transferir el papel de filtro con la retina de la cámara de perfusión y colocarlo por encima del punto de estímulo-alineados espacio inferior del electrodo. Presione ligeramente los bordes engrasadas de papel de filtro para unir con la cámara. </li><li> Coloque el electrodo superior sobre el centro de la retina (ligeramente tocar la capa de fotorreceptores). Centrado el electrodo superior en la retina aumenta la amplitud de la señal (hasta ~ 20-40% en comparación con colocarlo más cerca del borde retina). Aunque la localización del electrodo distorsiona ligeramente la intensidad de la luz estímulo eficaz de llegar a un pequeño sector de la retina (~ 12-15% de su superficie total), sigue siendo la mejor forma de colocar el electrodoatropelló. La preparación está ahora listo para las grabaciones transretinal. </li></ol> 4. Grabaciones Transretinal <ol><li> Dependiendo de su línea de ratones, registro de varilla o M / L de cono-impulsadas por las respuestas de destello de prueba desde tenue hasta la intensidad luminosa de la luz calibrada 505 nm siempre de la fuente de luz LED o estimulador óptico. En el caso de nuestra fuente de luz LED, la intensidad del flash se controla mediante una combinación de control computarizado de tensión de entrada de LED, resistencias conmutables, y un conjunto de filtros de densidad neutra (usamos E-Colour # 211 0,9 filtros ND de cine de Rosco Laboratories ) colocado entre el LED y la retina. La duración de la prueba de flash LED (20 ms) es controlado por un ordenador. Si se utiliza un estimulador bombilla halógena óptico, la intensidad de prueba flash y longitud de onda puede ser controlado por un conjunto de filtros de densidad neutra y estrechos filtros de interferencia de banda, respectivamente. Prueba de duración del flash pueden ser controlados por ordenador basadas en persianas. </li><li> Opcional: para mantener la eficienciala supresión del componente glial de la foto-con BaCl 2 durante todo el día, cambiar la solución de electrodo inferior de vez en cuando (por ejemplo, antes de la prueba cada retina) por una purga con una jeringa de plástico llena con solución fresca. </li></ol> 5. Los resultados representativos Soluciones <ol><li> Retina del ratón perfusión solución: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl 2, 1,2 mM de CaCl 2, HEPES 10 mM (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM de Na succinato, 0,5 mM de Na glutamato, 0,02 mM EDTA, y 10 mM de glucosa. Además, la solución se complementa con 2 mM de L-glutamato y 10 mM de DL-AP-4 para bloquear componentes de mayor orden de la fotorrespuesta 10,11, y con MEM 0,1% vitaminas y soluciones MEM aminoácidos (Sigma) para mejorar la retina viabilidad. </li><li> Ratón solución electrodo: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl 2, 1,2 mM de CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). La solución en el menor elementoespacio ctrode también contiene 2 mM de L-glutamato para bloquear la transmisión sináptica 10 y, además, 10 mM de BaCl 2 para suprimir el componente glial de la fotorrespuesta 3,12. </li><li> Retina solución de incubación: se disuelven 272 mg de medio L-15 (Sigma) y 20 mg de BSA en 20 ml de agua desionizada. Final L-15 y las concentraciones de BSA son 13,6 mg / ml y 1 mg / ml, respectivamente. Ajustar el pH a 7,4 con HCl 1 M. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1."> Figura 1. Diagrama esquemático que muestra el aislamiento de la retina del ratón para transretinal grabaciones ERG. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2."> Figura 2. Fotografía de la cámara de perfusión y de electrodos de registro con sus titulares. Las flechas rojas indican la dirección del flujo de perfusión. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3."> Figura 3. Esquema del montaje experimental para la transretinal grabaciones del ERG. Las flechas rojas indican la dirección del flujo de perfusión. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4."> Figura 4 resultados representativos:. Registrado familia de ratón la barra impulsadas por las respuestas transretinal. Photoresponses fueron filtrada de paso bajo a 30 Hz (8-Bessel), digitaliza a 1 kHz y almacenadas en un ordenador para su posterior análisis. Trazos mostrados corresponden a las medias de las respuestas de 5-6 a intensidades de luz tenue y las respuestas de 2-3 en la intensidad de luz de saturación. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5."> Figura 5: Los resultados representativos. Familia registrada de ratón de cono impulsadas por las respuestas transretinal. Photoresponses fueron filtrada de paso bajo a 30 Hz (8-Bessel), digitaliza a 1 kHz y almacenadas en un ordenador para su posterior análisis. Trazas se muestran en la AVERAGes de las respuestas de 5-10 a intensidades de luz tenue y las respuestas de 3-5 en la intensidad de luz de saturación.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
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<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
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<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de los bastones, los conos y las grabaciones basadas en transretinal-ERG se ha descrito anteriormente se está convirtiendo en una poderosa herramienta para la investigación de la función de los fotorreceptores de ratón en el tipo salvaje y animales modificados genéticamente. Además de la caracterización de las propiedades de fácil fotorrespuesta básicos, esta técnica simple proporciona estabilidad durante gran respuesta de larga duración experimentos realizados en preparaciones retina cercana al intactas. Tant...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> Biociencia Tocris </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Todos los demás reactivos </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio </td><td></td><td> World Precision Instruments </td><td> TW100-4 </td><td> Para hacer electrodos </td></tr><tr><td> Papel de filtro </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotómetro </td><td></td><td> UDT Instruments </td><td> S350 </td><td> Para la calibración de la luz </td></tr><tr><td> Sensor de silicio radiométrica </td><td></td&gt; <td> UDT Instruments </td><td> 221 </td><td> Para la calibración de la luz </td></tr><tr><td> Anti-vibración de mesa </td><td></td><td> Técnico Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Para reducir al mínimo el ruido mecánico </td></tr><tr><td> Compresor de aire Pantera P 15TC </td><td></td><td> Werther Internacional </td><td> P 15TC </td><td> Conectado a la mesa anti-vibración </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Para la disección del ratón ocular </td></tr><tr><td> Convertidores de imagen por infrarrojos </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Ligado a estereomicroscopio </td></tr><tr><td> Amplificador diferencial DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A digitalizador </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel de 8 polos del filtro </td><td></td><td> Krohn-HITE Corporación </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Resistencia de cerámica </td><td></td><td> TE Conectividad </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Para recalentar la solución de perfusión </td></tr><tr><td> Termopar </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> TI-18 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de temperatura </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Conectado a un termopar </td></tr><tr><td> LED de 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Para aplicar destellos de luz de prueba o de blanqueo </td></tr><tr><td> Pluma de cauterización </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Para marcar la parte dorsaldel globo ocular ratón </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Electrofisiología de Adquisición de Datos y Análisis </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal grabaciones erg de retina del ratón: rod y el cono photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Hay dos clases distintas de formación de la imagen-los fotorreceptores de la retina de los vertebrados: los bastones y conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz, mientras que los conos de funcionar de forma continua en las cambiantes condiciones de luz brillante. La absorción de luz por la A-Rod y específicos de cono pigmentos visuales en los segmentos externos de fotorreceptores desencadena una cascada de fototransducción que finalmente conduce al cierre de los nucleótidos cíclicos-bloqueados los canales de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la célula. Este cambio inducido por la luz en la membrana de actuales y potenciales pueden ser registrados como una foto-, ya sea por 1,2 de electrodos de aspiración clásica técnica de grabación o grabaciones transretinal electrorretinograma (ERG) de retinas aisladas con componentes farmacológicamente bloqueados respuesta postsináptica 3-5. Este último método permite drogas accesibles duraderos grabaciones de fotorreceptores de ratón y es particularmente útil para obtener photoresponses estables from los conos de ratones escasos y frágiles. En el caso de los conos, estos experimentos se puede realizar tanto en las condiciones adaptados a la oscuridad y la iluminación intensa siguiente que blanquea prácticamente todos pigmento visual, para supervisar el proceso de recuperación de cono de fotosensibilidad en adaptación a la oscuridad 6,7. En este video, vamos a mostrar cómo llevar a cabo de vara y M / L de cono-impulsadas por las grabaciones de transretinal adaptada a la oscuridad retina del ratón. Grabaciones Rod se llevó a cabo utilizando retina de tipo salvaje (C57BL / 6) ratones. Por simplicidad, las grabaciones de cono se obtendrá a partir modificado genéticamente varilla transducina α-subunidad extractor (Tα - / -) ratones que carecen de barra de señalización 8.

Se describe un método relativamente simple de transretinal electrorretinograma (ERG) para la obtención de grabaciones photoresponses conos y bastones de la retina del ratón intacto. Este enfoque se aprovecha del bloque de la transmisión sináptica de fotorreceptores para aislar sus respuestas de luz y grabar usando electrodos colocados sobre el terreno a través de la aislada plana montada en la retina.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

Existen dos clases distintas de fotorreceptores formadores de imágenes en la retina de los vertebrados: los bastones y los conos. Los bastones son capaces de detectar fotones individuales de luz...

El objetivo general de este procedimiento es realizar grabaciones de electroretinograma transretiniano en retina de ratón intacta y aislada para obtener respuestas fotoeléctricas mediadas por bastones y conos. Primero, se preparan capilares de vidrio y una cámara de perfusión para las grabaciones. Ambas copas oculares de un ratón adaptado a la oscuridad se hemisectan.Bajo iluminación infrarroja, se eliminan la córnea, la lente y el humor vítreo. La retina se separa del epitelio pigmentario y se coloca sobre papel filtro con el lado de los fotorreceptores hacia arriba. La retina sobre el papel filtro se transfiere a la cámara de perfusión situada en la platina del microscopio y se coloca entre dos electrodos conectados a la etapa principal de un amplificador diferencial.Finalmente, se registran las respuestas fotomediadas por bastones y conos en la retina de ratón montada en plano. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como las grabaciones clásicas de una sola célula, es que permite grabaciones prolongadas con acceso a fármacos desde fotorreceptores de bastones y conos en ratones de tipo salvaje y modificados genéticamente. Esta técnica está resultando particularmente útil para obtener respuestas estables de los escasos y frágiles fotorreceptores de ratón.Comience preparando las capilares de vidrio. Prepare 10 mililitros de agar al 1,2 % en un baño de agua caliente. Llene las capilares de vidrio con la solución de agar utilizando una jeringa de plástico, donde el agar se solidifica rápidamente.Corte las capilares en dos mitades utilizando un cuchillo de diamante. Sumerja los electrodos de vidrio resultantes en solución de electrodo para ratón durante al menos 24 horas a cuatro grados Celsius. Ahora prepare el microscopio en general para minimizar el ruido mecánico y electromagnético.Coloque el microscopio sobre una mesa antivibración y protéjalo dentro de una jaula de Faraday. Sin embargo, estas características no son esenciales. Calibre la fuente de luz utilizando un fotómetro colocado en el plano de la retina.En el caso de la fuente de luz LED, utilice un difusor óptico para lograr una uniformidad de la luz mediante un tubo de plástico y una capilar de vidrio. Realice la conexión entre el electrodo inferior y el soporte del electrodo. A continuación, llene el espacio del electrodo inferior de la cámara de perfusión con la solución de electrodo.Asegúrese de que no haya burbujas en el electrodo, en el tubo de conexión ni en el porta-electrodos. Elimine cualquier burbuja purgando la solución con una jeringa. Después de colocar la cámara de registro bajo el microscopio, conecte el porta-electrodos inferior al polo positivo del amplificador diferencial.Luego centre y alinee la abertura del electrodo inferior de la cámara con la burbuja del punto de luz del estímulo, la solución de perfusión tamponada con bicarbonato con 95% oxígeno, 5% dióxido de carbono mientras se incuba en un baño de agua a 40 grados Celsius. El pH de la solución alcanzará 7,2. Conecte la línea de perfusión a la cámara de registro y encienda la perfusión.La solución fluye desde el frasco hasta la cámara de registro por gravedad. Pasa a través de una resistencia cerámica, recalentándola a 36 o 37 grados Celsius. Para reducir la pérdida de calor, el calentador debe colocarse lo más cerca posible de la cámara de registro.Idealmente, en la etapa del microscopio, coloque un regulador de flujo en la trayectoria de las soluciones y ajústelo a aproximadamente un mililitro por minuto. A continuación, conecte el electrodo superior al segundo polo negativo de la etapa de la cabeza mediante un portaelectrodos con una junta tórica, sujete la sonda del termopar a este electrodo con sus puntas lo más cercanas posible, de modo que la medición de temperatura se realice cerca del centro de la retina. Luego, sumerja la punta del electrodo superior en la solución de perfusión y colóquela en el centro de la cámara.Permita de 10 a 15 minutos para la estabilización de la línea base. Finalmente, ajuste el voltaje de corriente continua para el calentador de modo que la temperatura de la solución sea de 36 a 37 grados Celsius. Prepare el ratón en la oscuridad, adaptándolo durante la noche.Utilice ratones de tipo salvaje como C57 negro seis para grabaciones transretinianas impulsadas por bastones o ratones knockout del gen de la alfa transducina de bastones, que carecen de señalización de bastones, para grabaciones transretinianas de conos. Antes de trabajar en la oscuridad, prepare un trozo de papel de filtro cuadrado haciendo un orificio de dos a 2,5 milímetros en su centro y engrasando sus esquinas. Todos los pasos siguientes deben realizarse bajo luz infrarroja. El microscopio de disección está equipado con convertidores de imagen infrarroja a partir de los ojos seccionados por la mitad.Extraiga ambas córneas y lentes. Elimine la mayor cantidad posible de humor vítreo durante estos procesos. Continúe trabajando con una copa ocular a la vez.El segundo copa ocular puede guardarse durante varias horas en un recipiente con solución de incubación, colocado en una caja de tipo luminoso saturada con oxígeno puro y a temperatura ambiente, para realizar registros de retinas completas. Pela la primera retina desde la capa del epitelio pigmentario, y si es necesario, límpiala cuidadosamente con pinzas para eliminar los gránulos residuales del epitelio pigmentario. Para registrar desde la región dorsal de la retina, elimina la parte ventral de la copa ocular antes de pelar la retina, utilizando una cuchilla de afeitar o tijeras microquirúrgicas.Y con referencia en los marcadores corry, retire la copa ocular ventral. Utilice una pipeta para transferir la retina aislada a una gota de solución de perfusión sobre la tapa de una placa de Petri. Luego agregue cinco o seis gotas pequeñas de solución electrolítica que contenga cloruro de bario.Coloque el filtro preparado con el orificio en una gota de solución de perfusión con la retina utilizando pinzas. Coloque la retina encima del papel filtro con el lado de los fotorreceptores hacia arriba. Luego presione sus bordes en la periferia para montarla plana.La retina debe estar centrada sobre la abertura en el papel filtro. Ahora transfiera el papel filtro con la retina a la cámara de perfusión y colóquelo sobre el punto de estímulo, alineado con el espacio del electrodo inferior. Presione ligeramente los bordes de grasa del papel filtro para adherirlo a la cámara.Por último, coloque el electrodo superior sobre el centro de la retina de forma que el electrodo toque ligeramente la capa de fotorreceptores. Ahora continúe con el experimento realizando grabaciones transretinianas. Para nuestro análisis, utilizamos el software de adquisición y análisis de datos Peak Lamp 10 de Molecular Devices Rotten Ate Our Accordance.Utilizamos una luz LED de 505 nanómetros proveniente de esta fuente LED durante sesiones prolongadas de grabación. Para mantener una supresión eficiente del componente glial de la respuesta fotóica, se cambia la solución del electrodo inferior. Antes de la prueba, cada retina debe ser suficiente.La intensidad del destello de la fuente de luz LED fue controlada mediante una combinación de control informático del voltaje del LED, resistencias conmutables y un conjunto de filtros de densidad neutra colocados entre el LED y la retina. La duración del destello de prueba del LED, típicamente de 20 milisegundos, fue controlada por una computadora. Estas grabaciones transretinianas mediadas por bastones en ratones C57 black six muestran trazas que representan promedios de cinco a seis respuestas a intensidades de luz tenue, y de dos a tres respuestas a intensidades de luz saturante.Cada traza de estos datos de regrabación de trans-retinal generados por el cono procedentes del ratón con eliminación del gen de la transducina alfa representa un promedio de cinco a diez respuestas a intensidades de luz tenue, y de tres a cinco respuestas a intensidades de luz saturantes. Así, tras ver este video, deberíamos tener una comprensión clara de cómo realizar y registrar electroretinogramas a partir de retina aislada de ratón para obtener respuestas fotópicas generadas por bastones y conos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Le mostraremos cómo registrar las respuestas de flash de conos ratón utilizando un electrodo de succión.

Una sola célula grabaciones de succión de los conos del ratón

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Este video muestra la grabación de un electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) en un epitelio pigmentario de la retina (EPR) de ratón anestesiado y adaptado a la oscuridad. Después de aplicar gotas dilatadoras, el animal se coloca en una configuración de registro y el electrodo capilar lleno de un tampón de sal se coloca en la córnea. Después de establecer la línea de base, se registra el DC-ERG.

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Se describe la preparación de rodajas finas de la retina acuáticos salamandras tigre...

Simultáneas registros de células de fotorreceptores y las neuronas de segundo orden en una rebanada preparación retina Anfibios

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

El electrorretinograma (ERG) es un potencial eléctrico generado por la retina en respuesta a la luz. En este trabajo se describe cómo utilizar el ERG para evaluar la función de la retina, en ratas adaptadas a la oscuridad, y cómo se puede utilizar para evaluar una intervención neuroprotectora, en el presente caso el precondicionamiento isquémico a distancia.

Utilizando el Electrorretinograma para evaluar la función en el Roedor Retina y los efectos protectores de distancia Limb Preacondicionamiento Isquémico

Ex vivo ERG se puede utilizar para registrar la actividad eléctrica de las células de la retina directamente a partir de retinas intactas aisladas de animales o humanos. Demostramos aquí cómo los sistemas ERG in vivo comunes se pueden adaptar para registros ERG ex vivo con el fin de diseccionar la actividad eléctrica de las células de la retina.

Simultáneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pruebas funcionales de dos retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Electrorretinograma

Este protocolo describe la medición simultánea del electrorretinograma y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas.

Grabación simultánea de Electrorretinografía y los potenciales evocados visuales en ratas anestesiadas

Mostramos implantación y grabación de los procedimientos quirúrgicos para medir señales electrofisiológicas visuales desde el ojo (electrorretinograma) y el cerebro (potencial evocado visual) en ratas conscientes, que se parece más a la condición humana, donde las grabaciones se realizaron sin anestesia confunde.

Implantación y grabación de Electrorretinograma Wireless y del potencial evocado visual en ratas conscientes

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

Aprende a realizar grabaciones ERG transretinales en retina de ratón para obtener fotorespuestas de bastones y conos. Este método permite registrar respuestas fotoreceptoras aisladas con precisión.

Transretinal Grabaciones ERG de retina del ratón: Rod y el Cono Photoresponses

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