Name: Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a aislar células LacZ positivas de cóclea neonatal en ratones mediante citometría de flujo. Este método permite analizar perfiles génicos de poblaciones celulares específicas en investigación auditiva.

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Agradecemos a S. Heller, K. Oshima, R. Nusse y Y. Zeng por las fructíferas discusiones, y a C. Tang, A. Lee, E. Liaw y al personal de la Stanford Shared FACS Facility por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Beca de Formación en Investigación Médica del Instituto Médico Howard Hughes, el programa de Médicos Investigadores de la Universidad de Stanford (ambos para T.A.J.), la Beca del Decano de la Universidad de Stanford (para R.C.), la Sociedad Otológica Americana, la Sociedad Triológica, el Premio Percy Memorial, el Fondo de Becarios de Facultad Akiko Yamazaki y Jerry Yang, y NIDCD/NIH K08 DC011043 (todos para A.G.C.).

1. Microdisección de la cóclea
<ol>
	<li>Prepare el microscopio de disección bajo la campana aspiradora limpiando las superficies con etanol al 70% y colocando bloques de hielo.</li>
	<li>Prepare 10-15 placas de Petri de 35 mm en condiciones estériles y llénelas hasta la mitad (~2 ml) con solución salina equilibrada de Hank con calcio (HBSS) estéril.</li>
	<li>Prepare dos placas de Petri de 35 mm en condiciones estériles y llénelas hasta la mitad (~2 ml) con solución tampón fosfato estéril 1x (PBS).</li>
	<li>Esterilice la micro-pinza en un tubo cónico Falcon de 50 ml con etanol al 70%.</li>
	<li>En una habitación separada de la campana estéril, use tijeras de iris para decapitar 12-15 ratones posnatales (P) de 0 a 3 días de edad, portadores del gen reportero Axin2LacZ/+, y coloque las cabezas en una placa de Petri de 60 mm sobre un bloque de hielo.</li>
	<li>Utilizando pinzas Dumont #5 y tijeras de iris, extirpe la mandíbula y la lengua y corte a través de la base del cráneo a nivel del paladar.</li>
	<li>Retire la piel sobreyacente de la calota craneal y seccione la base del cráneo insertando las tijeras en la parte inferior del foramen magno hasta el centro del paladar.</li>
	<li>Realice otra incisión con las tijeras de iris desde el borde cortado del paladar hasta la parte superior de la calota craneal en ambos lados, teniendo cuidado de no dañar la cápsula ótica.</li>
	<li>Complete el aislamiento del hueso temporal realizando dos incisiones anguladas a 45 grados que comiencen desde la parte superior del foramen magno y se extiendan hasta el corte coronal en el paladar duro.</li>
	<li>Coloque los huesos temporales aislados en placas de Petri de 35 mm que contengan HBSS sobre un bloque de hielo.</li>
	<li>Recolecte huesos temporales de aproximadamente 12-15 animales sacrificados, para un total de 24-30 huesos temporales.</li>
	<li>Transfiera la placa de Petri con los huesos temporales aislados a la campana de disección estéril previamente preparada (1.1).</li>
	<li>Transfiera cuatro huesos temporales a cada placa de Petri de 35 mm previamente preparada que contenga HBSS (1.2) y colóquelas sobre un bloque de hielo.</li>
	<li>Comience la microdisección utilizando dos pinzas #55 para retirar suavemente la corteza, el bulbo raquídeo y el cerebelo del hueso temporal que recubre la cápsula ótica.</li>
	<li>Sin retirar la cápsula ótica, desprenda partes de la cápsula coclear comenzando por la entrada del nervio vestibulococlear en la cápsula ótica.</li>
	<li>Tras exponer la base de la cóclea, extraiga suavemente la cóclea y los tejidos circundantes. Retire cualquier ganglio espiral residual y la estría vascular comenzando desde la base.</li>
	<li>Transfiera la cóclea a una placa de Petri de 35 mm que contenga PBS sobre un bloque de hielo.</li>
	<li>Para una viabilidad tisular óptima, el tiempo total de disección debe ser inferior a 60 minutos.</li>
	<li>Repita los pasos anteriores con 3-5 ratones silvestres (WT) de P0-P3 como controles para los ratones Axin2-LacZ.</li>
</ol>
2. Disociación celular (modificado de métodos descritos previamente)2,10
<ol>
	<li>Coloque 50 μl de PBS estéril en el centro de un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos sin recubrir.</li>
	<li>Transfiera hasta 20 cócleas Axin2LacZ/+ a cada gota de 50 μl de PBS. Se debe usar una nueva gota de 50 μl de PBS para más de 20 cócleas.</li>
	<li>Caliente previamente alícuotas de 50 μl de tripsina al 0,125 % durante aproximadamente 2 minutos en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Añada 50 μl de tripsina precalentada al 0,125 % al PBS que contiene las cócleas.</li>
	<li>Coloque la placa de 6 pocillos a 37 °C durante 8 minutos, teniendo cuidado de no agitarla.</li>
	<li>Para detener la tripsinización, añada 50 μl de inhibidor de tripsina de soja a cada gota de 100 μl.</li>
	<li>Añada adicionalmente 50 μl de medio completo (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilina en DMEM/F12)2.</li>
	<li>Utilizando una punta de pipeta romo de 300 μl y una pipeta p200 ajustada a 125 μl, triture suavemente las células 80 veces, teniendo cuidado de no generar burbujas.</li>
	<li>Tras la trituración de cada gota, añada adicionalmente 200 μl de FM a cada pocillo.</li>
	<li>Pase las células a través de un filtro celular azul Falcon de 40 μm hacia un nuevo pocillo.</li>
	<li>Transfiera las células a tubos estándar Falcon para FACS (quedan aproximadamente 300 μl tras la trituración y filtración).
	<ol class="lalpha">
		<li>Divida las células procedentes de cócleas de tipo salvaje en tres tubos, diluyendo 100 μl con 300 μl de FM en cada tubo. Un tubo se utilizará como control en blanco, otro se tiñirá solo con yoduro de propidio (PI, 1 μg/ml) (no añadir en este paso), mientras que el último se tiñirá con 3-carboxiumbelil β-D-galactopiranósido (CUG, ver 2.15) para detectar la fluorescencia de fondo.</li>
		<li>Coloque 400 μl de células disociadas procedentes de cócleas Axin2-LacZ en cada tubo FACS. Como control solo con CUG, diluya 10 μl de células en 390 μl de FM (ver tubo F en el paso 2.15). Ajuste el volumen de los tubos restantes a 400 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incube las células en un incubador húmedo a 37 °C durante 10 minutos.</li>
	<li>Prepare la solución de CUG:
	<ol class="lalpha">
		<li>Prepare 200 μl de CUG para cada tubo FACS que requiera tinción.</li>
		<li>Diluya el CUG en FM 1:50 en un lugar oscuro con exposición mínima a la luz.</li>
		<li>Caliente previamente el CUG diluido a 37 °C durante 3-5 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A continuación, añada 200 μl de CUG diluido a cada tubo FACS adecuado. Para los tubos que no deban recibir CUG, añada solo FM (ver 2.15).</li>
	<li>En este punto, debe haber cinco categorías de tubos con los siguientes contenidos (no añada PI en este paso):
	<ol class="ualpha">
		<li>Tipo salvaje: sin CUG ni PI (para compensación, ver pasos 3.5-6)</li>
		<li>Tipo salvaje: solo con PI (para compensación)</li>
		<li>Tipo salvaje: con CUG y PI (para control frente a células Axin2-LacZ)</li>
		<li>Axin2-LacZ: solo con CUG (para compensación)</li>
		<li>Axin2-LacZ: con CUG y PI (para ordenación real de células)</li>
		<li>Axin2-LacZ: con CUG y PI (para análisis de eventos)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proteja todos los tubos de la luz e incúbelos en un incubador húmedo a 37 °C durante 25 minutos.</li>
	<li>Prepare una solución fresca de HEPES + suero bovino fetal (FBS) para detener la reacción tras la incubación:
	<ol class="lalpha">
		<li>Diluya 400 μl de FBS recién descongelado en 10 ml de HEPES estéril 10 mM (en PBS) en un tubo Falcon de 15 ml.</li>
		<li>Coloque el tubo en hielo hasta completar el paso 2.16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añada 1,8 ml de solución de HEPES fría a cada tubo FACS bajo una campana estéril con las luces apagadas para minimizar la exposición a la luz.</li>
	<li>Centrifugue las células a 1200 rpm durante 5 minutos.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y re-suspenda las células en 300 μl de FM, reuniendo todas las alícuotas para la muestra de ordenación (Axin2-LacZ teñida con CUG y PI).</li>
	<li>Añada PI a cada tubo para alcanzar una concentración final de 1 μg/ml.</li>
	<li>Coloque las células en hielo y protéjalas de la luz.</li>
</ol>
3. Citometría de flujo
<ol>
	<li>Utilizamos un BD Aria II equipado con láseres de 488 nm, 633 nm y 407 nm. La detección de CUG se realizó utilizando el láser violeta de 407 nm y la PI con el láser azul de 488 nm en la Instalación Compartida de FACS de Stanford.</li>
	<li>Se requiere un operador capacitado en citometría de flujo. Continúe con el siguiente paso tras calentar los láseres, calibrar los detectores del citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante y establecer los parámetros óptimos de ordenación. En nuestra experiencia, el uso de una boquilla de 100 μm optimiza la viabilidad celular para experimentos posteriores.</li>
	<li>Se utilizaron los siguientes parámetros: umbral en 5.000 eventos, velocidad de flujo inferior a 3.000 eventos/segundo, dispersión hacia adelante (FSC) a 125 voltios y dispersión lateral (SSC) a 250 voltios; el canal PE-Cy5 se usó para PI y Cascade Blue para CUG.</li>
	<li>Lave la cámara del citómetro con etanol al 70 % y PBS, dos veces cada uno, en ese orden.</li>
	<li>Comience el análisis con células silvestres sin teñir (tubo A en el paso 2.15). Recolecte 1.000 eventos para determinar la distribución celular en el gráfico de FSC frente a SSC. Si no se desea la dispersión, ajuste los parámetros de FSC y SSC.</li>
	<li>Realice la compensación utilizando células WT sin teñir (tubo A), WT teñidas con PI (tubo B) y células Axin2-LacZ teñidas con CUG (tubo D). La compensación permitirá una mejor discriminación de señales entre las diferentes longitudes de onda del láser.</li>
	<li>Comience el análisis con células silvestres teñidas con PI y CUG (tubo C) y establezca los parámetros de selección para:
	<ol class="lalpha">
		<li>Exclusión de restos basada en el gráfico de FSC frente a SSC.</li>
		<li>Exclusión de dobletes y agregados mediante el gráfico de FSC-altura frente a FSC-área.</li>
		<li>Exclusión de células muertas basada en el gráfico de FSC-área frente a PE-Cy5-área.</li>
		<li>Configure un gráfico de FSC-área frente a Cascade Blue-área con cualquier colocación de puerta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A continuación, analice 10.000 eventos del tubo de muestra para ordenación que contiene células Axin2-LacZ teñidas con PI y CUG (tubo F).
	<ol class="lalpha">
		<li>Todas las puertas establecidas con células silvestres deben aplicarse aquí.</li>
		<li>Utilizando los gráficos de las células silvestres, cree puertas para células con alta intensidad de Cascade Blue que representen menos del 1 % del número total de eventos.</li>
		<li>Esta misma puerta de Cascade Blue-alto ahora abarca aproximadamente el 15-20 % de las células en la muestra Axin2-LacZ, identificando así a estas células como Axin2-alto.</li>
		<li>Utilizando el gráfico de análisis de las células Axin2-LacZ, cree una puerta para el 15-20 % de células con menor fluorescencia, denominadas a partir de ahora células Axin2-bajo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Basándose en la estrategia de selección mencionada anteriormente, ordene las células en tubos FACS que contengan 500 μl de FM, un tubo para células Axin2-alto y otro para células Axin2-bajo. Asegúrese de que los tubos de recolección estén en una cámara enfriada a 4 °C durante la ordenación.</li>
	<li>Registre el número de células contadas por el citómetro de flujo para cada población.</li>
</ol>
4. Resultados representativos (ver Figura 2):
Con el protocolo anterior, normalmente recuperamos entre un 40 y un 45 % de células libres de restos celulares de las cócleas tanto del tipo salvaje como de Axin2LacZ/+ (Figuras 2A y B), con aproximadamente el 70 % de ellas libres de dobletes (véanse las Figuras 2A' y B'). La mayoría de las células clasificadas son viables y no incorporaron yodo de propidio (PI) (~95 %) (Figuras 2A'' y B''). En promedio, el ~20 % superior de células positivas para CUG se consideran células positivas para Axin2-LacZ (Figura 2B''') y equivalen a unas 15 000 células con alto nivel de Axin2-LacZ por cada 10-12 animales.
El análisis de reordenación por citometría de flujo de células con alto contenido de Axin2 reveló una pureza superior al 93 % en el canal Cascade Blue. Para confirmar aún más la identidad de estas células, realizamos una inmunotinción posterior a la clasificación de células con alto y bajo contenido de Axin2 utilizando anticuerpos anti-β-galactosidasa, y encontramos que las células con alto contenido de Axin2 contenían aproximadamente un 93,4 % de células positivas para β-galactosidasa (más de 1.500 células analizadas) y que las células con bajo contenido de Axin2 contenían aproximadamente un 4,8 % de células positivas para β-galactosidasa.
Figuras y tablas:
<img alt="Proceso de aislamiento de la cóclea y marcado con LacZ; diagrama de análisis por citometría de flujo." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Paradigma experimental. La figura anterior muestra la estrategia y las técnicas experimentales generales descritas en la sección del protocolo. Se obtuvieron cócleas de ratones silvestres y de ratones Axin2LacZ/+, que se disociaron en células individuales y luego se trataron con CUG, un sustrato fluorescente para la β-galactosidasa. A continuación, las células con alto y bajo contenido de Axin2-LacZ se separaron mediante citometría de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig1large.jpg">Haga clic aquí para ver una versión de mayor tamaño de esta imagen.</a>
<img alt="Gráficos de dispersión de citometría de flujo, tipo silvestre frente a Axin2-lacZ, detritos, dobletes, viabilidad, análisis de LacZ." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Estrategias de selección (gating). Esta figura ilustra las estrategias de selección utilizadas en citometría de flujo. A) Se analizan aquí células disociadas de tipo silvestre que recibieron el mismo tratamiento que las células Axin2-LacZ, utilizando un total de 10.000 eventos. El primer panel muestra la dispersión lateral en función del área (SSC-A) frente al área de dispersión frontal (FSC-A). Aquí, un grupo distinto de eventos presenta un tamaño mucho mayor que aquellos eventos más cercanos al eje Y. Estos eventos se designan como «Negativos para detritos». La siguiente compuerta, A', analiza las células «Negativas para detritos» del panel A, que representan el 43,8 % del número total de eventos (véase la tabla inferior). En este panel, se utiliza la altura de dispersión frontal (FSC-H) frente al FSC-A para excluir dobletes. Se excluyen los eventos que se desvían del comportamiento lineal esperado del gráfico. Esta preparación suele producir aproximadamente un 70 % de eventos dentro de la compuerta definida, excluyéndose el resto de las células. En el panel A'', el yoduro de propidio (PI), detectado mediante el canal PE-Cy5, se utiliza para marcar las células muertas (5,3 %). En el siguiente panel (A'''), se utiliza el canal azul Cascade para detectar el sustrato fluorescente CUG. Aquí, las compuertas LacZ-alto incluyen menos del 1 % del total de eventos. B) Se analizan aquí células disociadas de ratones Axin2-LacZ tratadas con CUG y PI, utilizando un total de 10.000 eventos. Se aplican aquí compuertas idénticas a las del panel A. B' muestra que el 29,5 % de las células se excluyen como dobletes, mientras que B'' demuestra que el 5,4 % no son viables. Las compuertas iniciales para células LacZ-alto y LacZ-bajo se trazan utilizando el panel B''', estableciendo inicialmente LacZ-alto en un 19,7 % y LacZ-bajo en un 20,4 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig2large.jpg">Haga clic aquí para ver una versión de mayor tamaño de esta imagen.</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>Número de evento</td>
			<td>Porcentaje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Análisis de tipo silvestre</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'</td>
			<td>Negativo para detritos</td>
			<td>4,381</td>
			<td>43,80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A''</td>
			<td>Negativo para dobletes</td>
			<td>3,116</td>
			<td>71,10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'''</td>
			<td>Negativo para PI</td>
			<td>2,951</td>
			<td>94,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-alto</td>
			<td>16</td>
			<td>0,54%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-bajo</td>
			<td>2,790</td>
			<td>94,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Análisis de Axin2-LacZ</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'</td>
			<td>Negativo para detritos</td>
			<td>4,218</td>
			<td>42,2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B''</td>
			<td>Negativo para dobletes</td>
			<td>2,973</td>
			<td>70,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'''</td>
			<td>Negativo para PI</td>
			<td>2,813</td>
			<td>94,6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-alto</td>
			<td>553</td>
			<td>19,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-bajo</td>
			<td>573</td>
			<td>20,40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1. Análisis cuantitativos de las estrategias de selección en la Figura 2.

<ol><li>Li, H., Liu, H., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+from+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med.%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear.</a> Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).</li>
<li>Oshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+stem+cells+in+the+auditory+and+vestibular+organs+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Jaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Kalani, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-mediated+self-renewal+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).</li>
<li>Willert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+lipid-modified+and+can+act+as+stem+cell+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.</a> Nature. 423, 448-452 (2003).</li>
<li>Zeng, Y. A., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+self-renewal+factors+for+mammary+stem+cells+and+promote+their+long-term+expansion+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.</a> Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.</li>
<li>Chai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+of+Lgr5%2C+a+Wnt+Target+Gene%2C+in+the+Developing+and+Mature+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.</li>
<li>Lustig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+loop+of+Wnt+signaling+through+upregulation+of+conductin%2Faxin2+in+colorectal+and+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors.</a> Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).</li>
<li>Savary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+stem%2Fprogenitor+cells+from+a+postnatal+cochlea+respond+to+Jagged1+and+demonstrate+that+notch+signaling+promotes+sphere+formation+and+sensory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential.</a> Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).</li>
<li>White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cochlear+supporting+cells+can+divide+and+trans-differentiate+into+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells.</a> Nature. 441, 984-987 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).</li>
</ol>

No se declararon conflictos de intereses.

Estudios de investigación independientes han caracterizado una capacidad regenerativa limitada dentro de los cócleas neonatales2,10,12,13. Mediante el uso de ratones con reportero GFP y citometría de flujo, White y colaboradores aislaron células de sostén cocleares específicas y descubrieron que presentaban características de células progenitoras12.
Se ha demostrado que la vía canónica de Wnt marca poblaciones de células madre o progenitoras en múltiples sistemas orgánico...

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri, poliestireno, estéril Geriner Bio-one 35 x 10 mm &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-540 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Filtros para células, estériles, BD Biosciences, azul, 40 &amp;mu;m &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>21008-949 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Solución salina equilibrada (HBSS). Solución con calcio, magnesio y sin rojo de fenol, estéril &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-456 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos para centrífuga Cellstar, de polipropileno, estériles, Greiner Bio-One, 50 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-346 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos Cellstar, de polipropileno, estériles, Greiner Bio-One, 15 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-278 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento libre de suero B-27 (50x), líquido &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x), líquido &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>bFGF, factor de crecimiento de fibroblastos básico humano &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1, factor de crecimiento similar a la insulina-1 de ratón &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8779&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EGF, factor de crecimiento epidérmico humano &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Eagle modificado&amp;rsquo;s Medio/Ham&amp;rsquo;s F-12 50/50 Mix: 1X, con L-glutamina y 15 mM HEPES&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-350&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubos cónicos, desechables, de poliestireno, 12x75&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>60819-295&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25 % (1X) con EDTA 4Na, líquida&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ep Dualfilter TIPS 300 μL, 960 TIPS&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>22491245&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la tripsina, de soja, purificado&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003570&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Filtros celulares BD Falcon de 40 μm&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>21008-949&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipozo, de poliestireno, Greiner Bio-One, placas no tratadas, 6 pocillos&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-846&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detección de beta-galactosidasa LacZ para FACS azul con gen marcador&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Tecnologías de Genes Marcadores</td><td>M0255&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

aislar las células que expresan lacz de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

El aislamiento de tipos celulares específicos permite analizar poblaciones celulares raras, como las células madre o progenitoras. Dicho enfoque para estudiar los tejidos del oído interno representa un desafío único debido a la escasez de células de interés y a la limitada disponibilidad de modelos de ratones transgénicos con reporteros. Aquí describimos un protocolo que utiliza sondas conjugadas con fluorescencia para etiquetar selectivamente células positivas para LacZ procedentes de cócleas neonatales.
La patología subyacente más común de la hipoacusia neurosensorial es el daño irreversible y la pérdida de las células ciliadas sensoriales cocleares, que son necesarias para transducir las ondas sonoras en impulsos nerviosos. Evidencias recientes sugieren que los órganos auditivos y vestibulares de los ratones albergan células madre o progenitoras que podrían tener potencial regenerativo1,2. Estos hallazgos justifican una investigación más profunda, incluyendo la identificación de tipos celulares específicos con características de células madre o progenitoras. Se ha demostrado que la vía de señalización Wnt desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de poblaciones de células madre o progenitoras en varios sistemas orgánicos3-7. Recientemente, hemos identificado células que expresan Axin2 y responden a Wnt en la cóclea neonatal, pero su función es en gran parte desconocida8.
Para comprender mejor el comportamiento de estas células sensibles a Wnt in vitro, hemos desarrollado un método para aislar células que expresan Axin2 de cócleas de ratones transgénicos reporteros Axin2-LacZ9. Mediante citometría de flujo para aislar células positivas para Axin2-LacZ de cócleas neonatales, podríamos a su vez realizar una variedad de experimentos en células vivas para investigar su comportamiento como células madre o progenitoras. Aquí describimos en detalle los pasos para la microdisección del cóclea neonatal, la disociación de estos tejidos, la marcación de las células positivas para LacZ mediante un sustrato fluorogénico y la clasificación celular. Se han descrito técnicas para disociar cócleas en células individuales y aislar células cocleares mediante citometría de flujo2,10-12. Hemos realizado modificaciones a estas técnicas para establecer un protocolo novedoso que permite aislar células que expresan LacZ del cóclea neonatal.

La citometría de flujo es una herramienta poderosa que permite el aislamiento y estudio de poblaciones celulares específicas. Este protocolo describe los pasos para aislar células que expresan LacZ a partir de tejidos cocleares de ratones transgénicos neonatos. Las células cocleares disociadas se marcaron utilizando sustratos conjugados con fluoróforos de β-galactosidasa antes de la separación mediante citometría de flujo.

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

El aislamiento de tipos celulares específicos permite analizar poblaciones celulares raras, como las células madre o progenitoras. Este enfoque para estudiar los tejidos del oído interno...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en aislar células positivas para LAX Z del cóclea de ratón neonato mediante citometría de flujo. Esto se logra primero aislado un gran número de cócleas de ratón en un período de tiempo relativamente corto para mantener viables las células y disponer de un tejido inicial adecuado. Como segundo paso, las células positivas para LAX Z se disocian y luego se marcan para preparar el tejido para su clasificación. Luego, las células se ordenan mediante citometría de flujo. Las poblaciones resultantes de LAX Z alta y baja lax pueden utilizarse entonces para experimentos adicionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación auditiva, como cuáles son los perfiles genéticos o las poblaciones celulares específicas dentro del oído interno.El procedimiento será demostrado por Taha Gen, un estudiante de medicina de nuestro laboratorio. Primero, llene platos de Petri de 35 milímetros con HBSS y colóquelos sobre un bloque de hielo. Luego, tras usar tijeras de iris para decapitar de 12 a 15 ratones postnatales, de cero a tres días de edad, con reportero axón dos laxy y tipo salvaje, ya eutanasiados.Coloque las cabezas sobre una placa de Petri de 60 milímetros sobre un bloque de hielo. A continuación, utilice la pinza Dumont número cinco y tijeras de iris para extirpar la mandíbula y la lengua de las cabezas, y luego corte a través de la base del cráneo a la altura del paladar. Ahora retire la piel superpuesta del cráneo y seccione la base del cráneo insertando las tijeras en la parte inferior del foramen magno hasta el medio del paladar.Realice otra incisión con las tijeras desde el borde cortado del paladar hasta la parte superior del cráneo en ambos lados. Tenga cuidado de no dañar la cápsula ótica. Luego, complete el aislamiento del hueso temporal realizando dos incisiones anguladas de 45 grados, que comienzan desde la parte superior del armazón y del foramen magno y se extienden hasta el corte coronal en el paladar duro.Luego, coloque los huesos temporales aislados en las placas de Petri de 35 milímetros que contienen HBSS sobre el bloque de hielo y transfiera el bloque de hielo a una campana de disección estéril. A continuación, llene otra placa de Petri de 35 milímetros, esta vez con PBS, y colóquela sobre el bloque de hielo. Utilizando dos pinzas número 55.Comience la microdisección retirando suavemente la corteza, el tronco encefálico y el cerebelo del hueso temporal que recubre la cápsula ótica. Luego, sin retirar la cápsula ótica, elimine partes de la cápsula coclear comenzando por la entrada del nervio vestibulococlear y continúe hacia el interior de la cápsula ótica. Tras exponer la base de la cóclea, extraiga suavemente el órgano de Corti y los tejidos circundantes.Luego, comenzando desde la base, retire cualquier ganglio espiral y estría vascular residual y transfiera la cóclea a la placa de Petri llena de PBS. Pese 50 microlitros de PBS estéril en el centro de uno o dos pozos de una placa de cultivo de seis pozos sin recubrir. A continuación, transfiera no más de 20 axones, dos cócleas laxas, a cada gota de PBS.A continuación, caliente previamente alícuotas de 50 microlitros de tripsina al 0,125% durante aproximadamente dos minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Luego, agregue la tripsina a la cóclea, teniendo cuidado de no agitar el recipiente.Incube la cóclea a 37 grados Celsius durante ocho minutos. Detenga la digestión con tripsina añadiendo 50 microlitros de inhibidor de tripsina de soja a cada gota, y luego agregue 50 microlitros adicionales de medio completo después de ajustar una pipeta P-200 al volumen de 125 microlitros. Utilice una punta de pipeta romblada de 300 microlitros para agitar suavemente las células 80 veces, teniendo cuidado de no generar burbujas.Luego, después de que cada gota haya sido triturada, agregue 200 microlitros adicionales de medio completo a cada una. Ahora pase las células a través de un filtro celular de 40 micrones hacia un nuevo pocillo dentro de la misma placa de seis pocillos y luego transfiera las células de cada pocillo a tubos cónicos individuales estándar.A continuación, agregue 100 microlitros de células de tipo silvestre en cada uno de tres tubos, seguido de una dilución con 300 microlitros de medio completo solo para el CUG. Como control, diluya 10 microlitros de axón, dos células LAX Z, en 390 microlitros de medio completo. Transfiera las células axón dos LAX Z restantes a tubos de fax en 400 microlitros de OTs.Luego de incubar los tubos en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 10 minutos, añada 200 microlitros de CUG diluido a cada tubo de fax adecuado. A continuación, protegiendo todos los tubos de la luz, incube las células en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 25 minutos. Para la tinción, mientras las células están incubando, coloque 10 mililitros de hepes recién preparado más FBS en un tubo de 15 mililitros y coloque el tubo en hielo.Luego, agregue 1,8 mililitros de la solución fría de hielo a cada uno de los tubos fax bajo la campana estéril con las luces apagadas para minimizar la exposición a la luz. A continuación, centrifugue las células a 1200 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, retire el sobrenadante y re suspenda los pellets en 300 microlitros de medio completo.Reúna todas las alícuotas para la muestra de clasificación y luego agregue yoduro de propidio a cada tubo adecuado hasta una concentración final de un microgramo por mililitro. Finalmente, después de cubrir las células nuevamente, colóquelas en hielo. Configure las compuertas de clasificación recolectando primero 1000 eventos de las células silvestres no teñidas para determinar la distribución celular en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral.Ajuste los parámetros de dispersión directa y lateral según sea necesario. Luego, realice la compensación con el tipo silvestre sin teñir, el tipo silvestre teñido con PI y el axón teñido con CUG. Dos células LAX Z.Llene dos tubos de citómetro con 500 microlitros de medio completo. Luego inicie el análisis con las células de tipo silvestre teñidas con PI y la población de células teñidas con axón dos Lae CUG, utilizando la compuerta para excluir restos basándose en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral. Excluya dobletes y agregados utilizando el gráfico de altura de dispersión directa versus área de dispersión directa.Luego excluya las células muertas positivas para PI en función del gráfico de área de dispersión directa versus área de PE sci cinco. Para cada colocación de compuerta, configure un gráfico de área de dispersión directa versus área de azul cascada o azul Pacífico. Analice 10 000 eventos del tubo de muestra ordenado que contiene células teñidas con axón dos laxy PI y CUG utilizando todas las compuertas establecidas con las células de tipo silvestre mediante gráficos de las células de tipo silvestre.Cree compuertas para las células con alta intensidad de azul de cascada que representen menos del 1 % del número total de eventos. Las compuertas de azul de cascada alto ahora deben contener aproximadamente del 15 al 20 % de las células en la muestra de Axon dos laxy. Utilizando estas células de Axon dos alto, y con el gráfico de análisis de células de Axon dos laxy, cree ahora una compuerta para las células con menor fluorescencia, del 15 al 20 %, empleando la estrategia de compuertas antes mencionada.Ordene las células en los tubos de fács que contienen medio completo, manteniendo los tubos de recolección en una cámara enfriada a cuatro grados Celsius durante la ordenación. Registre el número de células contadas por el citómetro de flujo para cada población en estas dos figuras. Las áreas de dispersión lateral frente a las áreas de dispersión frontal del tipo silvestre disociado a la izquierda y del axón dos LA Z a la derecha.Se muestran las células cocleares. Observe la selección de los grupos distintos de eventos de tamaño mucho mayor que los eventos más cercanos al eje Y, designados como la población negativa para restos celulares. Típicamente, se recupera de un 40 a 45 % de células libres de restos celulares tanto del oído interno de tipo salvaje como del oído interno axin dos LAX Z en estos dos paneles.Se utiliza la altura del dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante para excluir dobletes de los restos previamente seleccionados. Se excluyen los eventos de la población negativa que se desvían de la naturaleza lineal esperada del gráfico. Esta preparación suele producir un 71,1 % de eventos dentro de la compuerta designada. Aquí.El yoduro de propidio, detectado mediante el canal PE SCI de cinco canales, se utiliza para excluir las células muertas, como se observa en estos diagramas de dispersión. Aproximadamente el 95 % de las células ordenadas eran viables y no incorporaron PI en estos paneles. El canal azul Cascade se utilizó para detectar el sustrato fluorescente CUG, como se muestra en la figura de la derecha.En promedio, las células positivas CUG superiores aproximadamente al 20 % son células lae altas que se correlacionan con unos 15 000 axones, dos células altas por cada 10 a 12 animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar células laxy altas mediante citometría de flujo a partir de tejidos del oído interno, tanto para experimentos de Turing celular como para experimentos como el perfilado genético.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La inflamación juega un papel central en la patogénesis del ictus isquémico. Cada vez hay más pruebas que sugieren que actúa como un arma de doble filo que exacerba las lesiones cerebrales tempranas, pero también contribuye a la reparación posterior. Este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias del cerebro isquémico y su posterior fenotipado por citometría de flujo.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Millones de personas sufren de enfermedades degenerativas retinianas que resultan en ceguera irreversible. Un elemento común de muchas de estas enfermedades es la pérdida de células ganglionares de la retina (RGCs). Este protocolo detallado describe el aislamiento de los RGC murinos primarios mediante selección positiva y negativa con citometría de flujo.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&amp;RUN).

Un protocolo eficiente para el análisis CUT&amp;RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Para investigar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales, un enfoque común es analizar los cambios en las células inmunitarias. Aquí, se proporcionan dos protocolos simples y efectivos para aislar células inmunitarias del tejido cerebral murino y la médula ósea del cráneo.

Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Aprenda a aislar células LacZ positivas de cóclea neonatal en ratones mediante citometría de flujo. Este método permite analizar perfiles génicos de poblaciones celulares específicas en investigación auditiva.

Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

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