Aislar las células que expresan LacZ de tejidos de ratón del oído interno mediante citometría de flujo

El objetivo general del siguiente experimento es aislar células Z laxas positivas de la cóclea neonatal de ratón mediante citometría de flujo. Esto se logra aislando primero un gran número de cócleas de ratón en un período de tiempo relativamente corto para mantener las células viables y tener un tejido de partida adecuado. Como segundo paso, las células LAX Z positivas se disocian y luego se etiquetan para preparar el tejido para la clasificación.

A continuación, las células se clasifican por citometría de flujo. Las poblaciones LAX Z altas y laxas bajas resultantes se pueden utilizar para una mayor experimentación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del oído, como cuáles son los perfiles genéticos o las poblaciones celulares específicas dentro del oído interno.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Taha Gen A, estudiante de medicina de nuestro laboratorio. Primero, llene placas de Petri de 35 milímetros con HBSS y colóquelas en un bloque de hielo. Luego, después de usar tijeras de iris para decapitar de 12 a 15 ratones postnatales sacrificados, de cero a tres días de edad, dos ratones laxy reporter y de tipo salvaje.

Coloque las cabezas en una placa de Petri de 60 milímetros sobre un bloque de hielo. A continuación, use las pinzas Dumont número cinco y las tijeras de iris para extirpar la mandíbula y la lengua de las cabezas, y luego corte la base del cráneo al nivel de la paleta. Ahora retire la piel suprayacente del ternero y seccione la base del cráneo insertando las tijeras en la parte inferior del foramen magnum hasta el centro del paladar.

Haz otra incisión con las tijeras desde el borde cortado del paladar hasta la cara superior de la pantorrilla en ambos lados. Teniendo cuidado de no dañar la cápsula ótica. A continuación, complete el aislamiento del hueso temporal haciendo 2 incisiones en ángulo de 45 grados, comenzando desde la cara superior del marco y la magnum extendiéndose hasta el corte coronal en el paladar duro.

A continuación, coloque los huesos temporales aislados en las placas de Petri de 35 milímetros que contienen HBSS en el bloque de hielo y transfiera el bloque de hielo a una campana de disección estéril. A continuación, llene otra placa de Petri de 35 milímetros, esta vez con PBS, y colóquela en el bloque de hielo. Usando dos pinzas del número 55.

Comience la microdisección extirpando suavemente la corteza, el tronco encefálico y el cerebelo del hueso temporal que recubre la cápsula ótica. Luego, sin quitar la cápsula ótica, corte partes de la cápsula coclear comenzando en la entrada del nervio coclear vestibular y continuando hacia la cápsula ótica. Después de la exposición de la base de la cóclea, extraiga suavemente el órgano de corti y los tejidos circundantes.

Luego, comenzando por la base, retire cualquier ganglio espiral y estría restantes y transfiera la cóclea a la placa de Petri llena con la primera pipeta de PBS. 50 microlitros de PBS estéril en el centro de uno o dos pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos sin recubrimiento. A continuación, transfiera no más de 20 axinas, dos cócleas laxas en cada gota de PBS.

A continuación, precaliente 50 alícuotas de microlitros de tripsina al 0,125% durante unos dos minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Y luego agregue la tripsina a la cóclea. Teniendo cuidado de no agitar el plato.

Incubar la cóclea a 37 grados centígrados durante ocho minutos. Termine la tripsina agregando 50 microlitros de inhibidor de tripsina de soja a cada gota, y luego agregue 50 microlitros adicionales de medio completo después de ajustar un pipeta P 200 a 125 microlitros. Utilice una punta de pipeta roma de 300 microlitros para tatear suavemente las células 80 veces, teniendo cuidado de no crear burbujas.

Luego, después de triturar cada gota, agregue 200 microlitros adicionales de medio completo a cada una. Bueno, ahora pase las células a través de un filtro de células de 40 micras a un nuevo pocillo. Dentro de la misma placa de seis pocillos y luego transfiera las celdas de cada pocillo a tubos de fax estándar individuales.

A continuación, agregue 100 microlitros de células de tipo salvaje en cada uno de los tres tubos, seguido de una dilución con 300 microlitros de medio completo solo para el CUG. Control diluido 10 microlitros de axón, dos celdas LAX Z en 390 microlitros de medio completo. Transfiera el axón restante, dos células Z laxas, a tubos de fax en OT de 400 microlitros.

Luego, después de incubar los tubos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 10 minutos, agregue 200 microlitros de CUG diluido a cada tubo de fax apropiado. A continuación, protegiendo todos los tubos de la luz, incube las células en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 25 minutos. Para la tinción mientras las células están incubando, coloque 10 mililitros de montones recién preparados más FBS en un tubo de 15 mililitros y coloque el tubo sobre hielo.

A continuación, añada 1,8 mililitros de la solución helada a cada uno de los tubos de fax situados bajo la funda estéril con las luces apagadas para minimizar la exposición a la luz. A continuación, centrifuga las celdas a 1200 RPM durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 300 microlitros de medio completo.

Agrupe todas las alícuotas de la muestra de clasificación y, a continuación, añada yoduro de propidio a cada tubo apropiado hasta una concentración final de un microgramo por mililitro. Finalmente, después de cubrir las celdas, una vez más, colócalas en hielo. Configure las puertas de clasificación recopilando primero 1000 eventos de las celdas de tipo salvaje sin teñir para determinar la distribución de celdas en el diagrama de dispersión frontal frente a lateral.

Ajuste los parámetros de dispersión frontal y lateral según sea necesario. A continuación, compénselo con el tipo salvaje sin teñir, el tipo salvaje teñido con PI y el axón teñido con CUG. Dos celdas LAX Z.

Llene dos tubos de fax con 500 microlitros de papel completo. A continuación, comience el análisis con la puerta de células teñidas con PI de tipo salvaje y con dos células teñidas con Lae CUG para excluir los residuos en función del diagrama de dispersión frontal frente a lateral. Excluya los dobletes y los grupos utilizando la gráfica de altura de dispersión hacia adelante frente a área de dispersión hacia adelante.

A continuación, excluya las células muertas positivas PI en función del área de dispersión directa frente a la gráfica de cinco áreas de PE sci. Para cada ubicación de la marcha, establezca un gráfico del área de dispersión hacia adelante frente a la cascada o el área azul del Pacífico. Analice 10.000 eventos del tubo de muestra de clasificación que contiene células teñidas con PI y CUG con axón dos laxas utilizando todas las puertas establecidas con las células de tipo salvaje utilizando gráficos de las células de tipo salvaje.

Cree puertas para celdas altas azules en cascada que sean inferiores al 1% del número total de eventos. La cascada Blue High Gates debería contener ahora entre el 15 y el 20% de las células de la muestra laxa del axón dos. Hacer que estos axones sean dos celdas altas usando el gráfico de análisis de células laxas de Axon dos ahora crea una puerta para la menor gripe, del 15 al 20% de las células usando la estrategia de compuerta antes mencionada.

Clasifique las células en los tubos de fax que contienen medios completos, manteniendo los tubos de recolección en una cámara enfriada a cuatro grados centígrados durante la clasificación. Registre el número de células contadas por el citómetro de flujo para cada población en estas dos cifras. Las áreas de dispersión lateral frente a las áreas de dispersión frontal del tipo comodín disociado a la izquierda y el axón dos LA Z a la derecha.

Se muestran las células cocleares. Obsérvese la compuerta de los distintos grupos de eventos de un tamaño mucho mayor que los eventos más cercanos al eje Y designados como la población negativa de escombros. Por lo general, se recuperan entre un 40 y un 45% de células libres de residuos tanto de la cóclea de tipo salvaje como de dos cocleas LAX Z en estos dos paneles.

La altura de dispersión frontal frente al área de dispersión directa se utiliza para excluir dobletes de los escombros previamente cerrados. Se excluyen los eventos poblacionales negativos que se desvían de la naturaleza lineal esperada de la parcela. Esta preparación suele producir un 71,1%dentro de la puerta designada. Aquí.

El yoduro de propidio, detectado por el canal PE SCI de cinco canales, se utiliza para excluir las células muertas, como se observa en estos diagramas de dispersión. Alrededor del 95% de las células clasificadas eran viables y no absorbieron PI PI en estos paneles. El canal azul Cascade se utilizó para detectar el sustrato fluorescente CUG como se ve en la figura de la derecha.

En promedio, las células positivas para aproximadamente el 20% de CUG son células altas que se correlacionan con aproximadamente 15.000 axones, dos células altas por cada 10 a 12 animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y aislar células laxas altas mediante citometría de flujo de tejidos del oído interno tanto para experimentos de Turing celular como para experimentos como el perfil de genes.