RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans

El objetivo de este procedimiento es identificar reguladores postembrionarios de la expresión y localización de proteínas en Celegance utilizando un cribado genómico basado en ARNi y proteínas marcadas con fluorescencia. Una vez que se construye la cepa de cribado adecuada, se elige una biblioteca de ARNi. El primer paso del procedimiento es empaquetar los clones de la biblioteca en bacterias.

A continuación, las bacterias se seleccionan, se cultivan y se alimentan con nematodos c elegance por etapas. Después de permitir que los nematodos crezcan durante 72 horas, se observan alteraciones en el fenotipo de interés. En última instancia, los cambios en la expresión o localización subcelular de la proteína atacada se visualizan con microscopía de fluorescencia.

Este método puede identificar los genes necesarios para la localización subcelular adecuada de una proteína marcada con fluorescencia. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar genes que afectan a otros fenotipos postembrionarios de interés. La principal ventaja de esta técnica sobre los protocolos publicados existentes es que hemos optimizado la consistencia y el nivel de la respuesta de ARNi en animales al inducir la producción de ARN bicatenario en bacterias antes de la siembra.

A los dos meses de comenzar el experimento, preparará la primera raya de bacterias de la biblioteca de clones de clones seleccionados de la biblioteca de alimentación, así como los controles positivos y negativos en placas de tetraciclina carbónica LB. Para un control positivo, use un clon que contenga un gen que produzca un fenotipo postembrionario dependiente de la dosis, como BLE 4. Para un control negativo, utilice un vector vacío o un clon que contenga un pseudogen predicho sin fenotipos observados.

Incubar las placas durante la noche: para cada clon inocule dos mililitros de medio LB que contenga 50 microgramos por mililitro. El ácido carbónico con una sola colonia de las placas de vetas, incuba los cultivos durante la noche con agitación a la mañana siguiente. Las soluciones deben ser turbias inducidas por la producción de ARN bicatenario mediante la adición de IPTG a los cultivos e incubarlos durante cuatro o cinco horas adicionales en las mismas condiciones.

La adición de IPTG garantiza una eliminación más consistente y robusta del producto génico inducida por el ARN que confiar únicamente en el IPTG y el sinfín de la placa NGM. Después de la incubación del IPTG, coloque 30 microlitros de cultivo de cada clon en cada pocillo de las placas de ARNi NGM preparadas de 24 pocillos. Un clon por pocillo. Cada placa debe tener dos pocillos dedicados a los controles.

Revisa cuidadosamente la ubicación de cada biblioteca. Clone en las placas de 24 pocillos ahora coloque las placas descubiertas en una campana de flujo estéril para que se sequen durante unos 20 minutos. No permita que los bordes del agar se separen de la placa.

Una vez secos en los nematodos por etapas en las placas, se dan instrucciones sobre la preparación de los nematodos. En la siguiente sección, comience con una población estadificada de nematodos en primera etapa larvaria o L uno. A partir de la L one, las larvas pasan por alto los posibles fenotipos embrionarios letales.

Tener una población de animales por etapas para examinar también aumenta la confianza de que cualquier variación observada se debe al ARNi y no son simplemente variaciones normales que ocurren en diferentes etapas. Sin embargo, si el ARNi causa un retraso en el desarrollo, esto debe ser anotado por el cribador Bleach. Población de estadio mixto de la cepa de cribado.

Solo los embriones protegidos con cáscara de huevo sobrevivirán a este paso, los animales se clasifican dentro de las 12 horas si se realizan a 20 grados centígrados o hasta dentro de las 18 horas. Si se realiza a 16 grados centígrados el día en que se inoculan los cultivos bacterianos. Seleccione tres placas de 100 milímetros de animales de cribado que estén sanos y contengan tanto gravedad, adultos y embriones.

Lave a todos los animales en medios estériles M nine y transfiera el lavado a un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca. Si el lavado es superior a 3,5 mililitros, gire sobre los animales y elimine todo el líquido excepto 3,5 mililitros. Si es inferior a 3,5 mililitros.

Aumentar el volumen a 3,5 mililitros con agua o M nueve para liberar los embriones de los adultos a 1,5 mililitros de una mezcla de hidróxido de sodio y lejía a cada lavado. Permita que los animales incuben durante no más de 10 minutos en esta solución. Después de iniciar un temporizador, agite cada tubo durante 10 segundos y repita el vórtice cada dos minutos.

Después de cada vórtice, observe la solución bajo un osciloscopio de disección para cadáveres de animales. En seis a ocho minutos, los adultos estarán fragmentados y los embriones deberían ser liberados. Retire los embriones de la solución de lejía granulándolos y eliminando la mayor cantidad posible del sobrenadante sin alterar la pastilla.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en un volumen de 10 mililitros añadiendo M nine estéril y utilizando agitación. Repite este proceso de lavado al menos una vez más hasta que el olor a lejía sea completamente indetectable. Para que los animales estén más apretados, los detengan en su primera etapa incubando los embriones en un medio M nueve sin alimento.

Esto se hace transfiriendo los embriones en M nueve a un pequeño matraz Erlenmeyer. Agite el matraz durante la noche a la temperatura adecuada para la colada y experimente. En este tiempo, todos los animales eclosionarán y se detendrán en la diapausa L one al día siguiente.

Reanudar el crecimiento de las larvas a partir de un punto de tiempo establecido transfiriéndolas a las bacterias preparadas que expresan RN bicatenario. Este es el mismo día en que las placas de 24 pocillos han sido detectadas con bacterias. Comience transfiriendo los animales L one a un tubo de 15 mililitros y girándolos hacia abajo. Luego concentre los animales en medio a un mililitro de M nueve y coloque cinco microlitros de nematodos concentrados en un plato.

Cuente el número de animales en el plato y ajuste la solución concentrada de nematodos. TE 30 gusanos por cada tres a 10 microlitros. Finalmente, detecte aproximadamente 30 L de animales de una etapa sobre las bacterias en cada pocillo del preparado.

Placa de 24 pocillos Más de 30 animales por pocillo pueden resultar en inanición Después de que las manchas se hayan secado, lo que tomará unos minutos, asegure la tapa con la banda elástica e incube los animales invertidos a la temperatura y el tiempo requeridos para marcar a los animales en la etapa deseada. Una vez que los nematodos estén listos para el cribado, confirme que los controles positivos y negativos producen los fenotipos esperados. A continuación, observe a los animales de experimentación para detectar anomalías en el desarrollo.

A continuación, utilizando un microscopio de disección, monte de ocho a 12 animales de cada pocillo en portaobjetos de PET al 4% Agri con una gota de anestésico de cinco microlitros. Después de aplicar el cubreobjetos apropiado, haga observaciones de al menos cinco animales utilizando microscopía compuesta. Mantener una base de datos organizada del gen, el número de animales observados y los resultados fenotípicos.

Para cada experimento de ARN, verifique cualquier fenotipo de ARNi R producido por otro fenotipo secundario si es posible, y al repetir el experimento, los experimentos repetidos pueden usar bacterias de la misma raya. Las rayas más viejas pueden resultar en un crecimiento deficiente en cultivos líquidos durante la noche, y deben volver a rayarse primero. Algunos cultivos bacterianos no crecen bien debido al producto genético expresado en su plásmido.

En este caso, simplemente concentre las bacterias antes de enchapar. En el caso de un cribado continuo, es importante mantener muchos embriones siempre listos para la estadificación. La cepa de cribado siempre debe ser alimentada, no hambrienta, y libre de contaminantes que puedan afectar el fenotipo de interés.

Establecimos un programa de mantenimiento para la alimentación de los animales. Los genes que afectan a la localización de DBL uno se identificaron mediante ARNi utilizando un diseño de cepa para este cribado. La expresión normal de la etiqueta GFP dbl uno incluye cuerpos celulares del cordón nervioso ventral y una fila de animales puncti alimentados con AR antisentido a DBL.

Un ARNm mostró una expresión severamente atenuada de DBL uno. Estos animales también eran pequeños, como los animales que carecían de DBL L uno funcional. El cribado de ARN I identificó con éxito muchos otros genes cuyos productos afectan a la localización de DBL uno, ampliando así nuestra comprensión de cómo se trafica el TGF beta subcelular y proporcionando un punto de partida para muchas más investigaciones.

Con este método, una sola persona puede organizar y observar razonablemente de dos a cuatro conjuntos de experimentos cada semana. Por ejemplo, los animales escenificados el lunes y el martes se pueden observar el jueves y el viernes respectivamente, y los animales se pueden volver a escenificar el viernes y el sábado para el lunes y el martes. Observación Mientras sigue este procedimiento en toda la pantalla.

Es importante mantener muchos embriones listos para la estadificación, así que mantenga la cepa de detección con regularidad. Además, es importante tomar notas detalladas de todas las observaciones.