Name: RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a identificar reguladores postembrionarios de expresión y localización proteica en C. elegans mediante un método de detección sensibilizado con ARN interferente y proteínas marcadas con fluorescencia.

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Los autores desean agradecer al Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por el don de la DBL-1 cDNA y el Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, la Universidad de Rutgers, Nueva Jersey) por un marcador de la inyección. El laboratorio del Dr. Barth Grant realizó el bombardeo de pistola de genes para la integración de bajo número de copias de la GFP-etiquetados-1 dbl construcción. El laboratorio de René García brindó asistencia técnica durante la creación de texIs100. El René García, Lints Robyn, y Hongmin Qin laboratorios proporcionó asesoramiento productivo. Este trabajo fue financiado por la puesta en marcha de fondos del Departamento de TAMHSC de Medicina Molecular y Celular. El ámbito de aplicación compuesto y confocal de disco giratorio fueron comprados con fondos proporcionados por el departamento y el Colegio TAMHSC de la Oficina de Medicina del Decano.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

El método de cribado ARNi presentado aquí permite un análisis sensible y rápido de los productos de genes necesarios para una normal (o transgénicos) fenotipo postembrionario. El ejemplo que se muestra es una pantalla de genes implicados en la localización subcelular de una proteína fluorescente etiquetados. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para identificar los genes que afectan a otros fenotipos postembrionario de interés. Este método tiene la ventaja de un enfoque de genes ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NGM agar </td><td> Nematodos medio de crecimiento </td><td> MIP Scientific, Inc </td><td> Se puede preparar siguiendo el protocolo de agar NGM 25 </td></tr><tr><td> Medio M9 </td><td> 22mm KH 2 PO 4, 42mm de Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM de MgSO 4 </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td> Agar agar </td><td> EMD Chemicals Inc. </td><td> 1.01614.1000 </td><td> 2% en agua para placas NGM. 4% en agua para almohadillas portaobjetos de microscopio (autoclave inicialmente y microondas para fundir posteriormente). </td></tr><tr><td> Bacto peptona </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 211677 </td><td> 0,25% </td&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> I56000-5.0 </td><td> 1 mM de concentración final </td></tr><tr><td> carbenicilina </td><td> Investigación de Productos International Corp. </td><td> C46000-5.0 </td><td> 50 ug / ml de la dilución de trabajo </td></tr><tr><td> LB caldo Lennox </td><td> Becton Dickinson - Difco CP </td><td> 240230 </td><td> 20 g / litro </td></tr><tr><td> tetraciclina </td><td> Sigma </td><td> 268054 </td><td> 12,5 mg / ml de la dilución de trabajo </td></tr><tr><td> hipoclorito de sodio </td><td> Cualquier marca </td><td> 5% de lejía </td><td> Use cloro libre. </td></tr><tr><td> de hidróxido de sodio </td><td> Cualquier marca </td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 N de valores </td></tr><tr><td> Medio M9 </td><td> Wormlab Libro de Recetas </td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td> Sigma </td><td> 31742 </td><td> 100 mM mM - una dilución de trabajo </td></tr><tr><td> azida de sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227 </td><td> 10 mM en M9 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> 24-pocillos </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 662160 </td><td> VWR distribuidor </td></tr><tr><td> portaobjetos de microscopio </td><td> Cualquier marca </td><td> 75 x 25 x 1 mm </td><td></td></tr><tr><td> se desliza la cubierta del microscopio </td><td> Cualquier marca </td><td> 22 x 22 mm No.1.5 </td><td> Utilizar el espesor recomendado por el fabricante del microscopio. </td></tr><tr><td> microscopio compuesto </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> A1m </td><td> Utilice objetivos y filtros para que coincida con las necesidades del experimento. </td></tr><tr><td> los medios de comunicación de la bomba</td><td> Manostat Varistaltic bomba </td><td> Kate modelo # 72-620-000 </td><td> Use tubería y ajustes adecuados para la máquina </td></tr></tbody></table>

rnai de detección para identificar fenotipos postembrionarios en c. elegans</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y caracterización funcional de muchos genes y 1 vías genéticas. Herramientas más sofisticadas y los recursos para los estudios en este sistema están facilitando continuo descubrimiento de los genes con los fenotipos más sutiles o roles. Aquí se presenta un protocolo generalizado hemos adaptado para la identificación de C. elegans genes con fenotipos postembrionarios de interés utilizando RNAi 2. Este procedimiento se puede modificar fácilmente para ensayar el fenotipo de elección, ya sea por la óptica de luz o de fluorescencia en un microscopio de disección o compuesto. Este protocolo de cribado saca provecho de los activos físicos del organismo y las herramientas moleculares de la C. elegans comunidad de investigación ha producido. Como un ejemplo, se demuestra el uso de un transgén integrado que expresa un producto fluorescente en una pantalla de ARNi para identificar los genes necesarios para la localización normal de esteproducto en las larvas de fase tardía y adultos. En primer lugar, hemos utilizado una biblioteca genómica disponible en el mercado con el RNAi de larga duración en insertos de cDNA. Esta biblioteca facilita la rápida identificación de los múltiples candidatos por la reducción de RNAi el producto del gen candidato. En segundo lugar, hemos generado un transgen integrado que expresa nuestra proteína fluorecently etiquetado de interés en un fondo de RNAi y minúsculas. En tercer lugar, mediante la exposición de los animales nacidos de RNAi, esta pantalla permite la identificación de los productos de los genes que tienen un papel vital embrionaria que podría ocultar un papel post-embrionario en la regulación de la proteína de interés. Por último, esta pantalla utiliza un microscopio compuesto equipado para la resolución de células individuales.

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización en<em&gt; C. elegans</em&gt; Con una pantalla de genómica basada en RNAi y un transgén integrado que expresa una proteína funcional, con fluorescencia etiquetados.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

*C. elegans* ha demostrado ser un sistema modelo valioso para el descubrimiento y la caracterización funcional de numerosos genes y rutas génicas1. Más sofisticados...

El objetivo de este procedimiento es identificar reguladores posembriónicos de la expresión y localización de proteínas en C. elegans mediante una pantalla genómica basada en ARNi y proteínas marcadas con fluorescencia. Una vez construida la cepa adecuada para el cribado, se selecciona una biblioteca de ARNi. El primer paso del procedimiento consiste en empaquetar los clones de la biblioteca en bacterias.Las bacterias se seleccionan, cultivan y se administran a nematodos de C. elegans en etapas determinadas. Después de permitir que los nematodos crezcan durante 72 horas, se observan alteraciones en el fenotipo de interés. Finalmente, los cambios en la expresión o en la localización subcelular de la proteína atacada se visualizan mediante microscopía de fluorescencia.Este método puede identificar genes necesarios para la correcta localización subcelular de una proteína marcada con fluorescencia. Sin embargo, este protocolo puede modificarse para identificar genes que afecten otros fenotipos posembrionarios de interés. La ventaja principal de esta técnica frente a los protocolos publicados existentes es que hemos optimizado la consistencia y el nivel de la respuesta de ARNi en los animales mediante la inducción de la producción de ARN bicatenario en bacterias antes del siembra.La persona que demostrará el procedimiento será Kathy Fuss, asociada de investigación de mi laboratorio. Dentro de los dos meses siguientes al inicio del experimento, prepare la biblioteca de clones; primero realice un aislamiento bacteriano a partir de clones seleccionados de la biblioteca de alimentación, así como de los controles positivo y negativo, en placas de LB con tetraciclina. Como control positivo, utilice un clon que contenga un gen que produzca un fenotipo pos-embrionario dependiente de la dosis, como BLE cuatro. Como control negativo, utilice un vector vacío o un clon que contenga un pseudogen predicho sin fenotipos observados.Incube las placas durante la noche; para cada clon, inocule dos mililitros de medio LB que contenga 50 microgramos por mililitro de ácido carbónico con una colonia aislada de las placas de estría. Incube los cultivos durante la noche con agitación. A la mañana siguiente, las soluciones deben estar turbias; induzca la producción de ARN bicatenario añadiendo IPTG a los cultivos e incúbelos durante cuatro a cinco horas adicionales en las mismas condiciones.Añadir IPTG asegura una inhibición inducida por ARNi más consistente y robusta del producto génico que depender únicamente del IPTG y del inductor de la placa NGM. Después de la incubación con IPTG, depositar 30 microlitros de cultivo de cada clon en cada pocillo de las placas NGM de ARNi preparadas de 24 pocillos. Un clon por pocillo. Cada placa debe tener dos pocillos destinados a los controles.Marque cuidadosamente la ubicación de cada biblioteca. Clone en placas de 24 pocillos y coloque ahora las placas descubiertas en un flujo laminar estéril para que sequen durante aproximadamente 20 minutos. No permita que los bordes del agar se separen de la placa.Una vez secos los nematodos en estadios definidos sobre las placas, se proporcionan instrucciones sobre la preparación de los nematodos. En la siguiente sección, comience con una población estadiada de nematodos en el primer estadio larval o L1. Comenzar con larvas L1 evita fenotipos letales embrionarios potenciales.Tener una población de animales en etapas definidas para el cribado también aumenta la confianza en que cualquier variación observada se deba al ARNip y no simplemente a variaciones normales que ocurren en diferentes etapas. Sin embargo, si el ARNip provoca un retraso en el desarrollo, esto debe ser anotado por quien realiza el cribado. Población de etapas mixtas de la cepa utilizada en el cribado.Solo los embriones protegidos por la cáscara sobrevivirán a esta etapa, estadiando los animales dentro de las 12 horas si se realiza a 20 grados Celsius o dentro de las 18 horas si se realiza a 16 grados Celsius el día en que se inoculan los cultivos bacterianos. Seleccione tres placas de 100 milímetros de animales de la cepa de tamizaje que estén sanos y contengan tanto larvas, adultos y embriones.Lave todos los animales en medio M nueve estéril y transfiera el lavado a un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca. Si el lavado es mayor a 3,5 mililitros, centrifugue los animales y retire todo el líquido excepto 3,5 mililitros. Si es menor a 3,5 mililitros.Aumente el volumen hasta 3,5 mililitros con agua o M nueve para liberar los embriones de los adultos en 1,5 mililitros de una mezcla de hidróxido de sodio y lejía por cada lavado. Deje que los animales se incuben durante no más de 10 minutos en esta solución. Después de iniciar un temporizador, vortex cada tubo durante 10 segundos y repita la vortexación cada dos minutos.Después de cada vortexado, observe la solución bajo un microscopio estereoscópico en busca de cadáveres de animales. Dentro de los seis a ocho minutos, los adultos se fragmentarán y deberían liberarse los embriones. Retire los embriones de la solución de lejía centrifugándolos y eliminando la mayor cantidad posible del sobrenadante sin perturbar el precipitado.Luego, resuspenda el precipitado en un volumen de 10 mililitros añadiendo M nueve estéril y agitando. Repita este proceso de lavado al menos una vez más hasta que el olor a lejía sea completamente indetectable. Para obtener un enquistamiento más estrechamente sincronizado, detenga a los animales en su estadio L uno haciendo eclosionar los embriones en medio M nueve sin alimento.Esto se realiza transfiriendo los embriones en M nueve a un matraz erlenmeyer pequeño. Agite el matraz durante la noche a la temperatura adecuada para la cepa y el experimento. Durante este tiempo, los animales eclosionarán todos y se detendrán en la diapausa L uno al día siguiente.Reanude el crecimiento de las larvas a partir de un punto temporal establecido transfiriéndolas a las bacterias preparadas que expresan ARN bicatenario. Este es el mismo día en que las placas de 24 pocillos han sido inoculadas con bacterias. Comience transfiriendo los animales L1 a un tubo de 15 mililitros y centrifugándolos. Luego concentre los animales en medio millilitro a un mililitro de medio M9 y coloque cinco microlitros de nematodos concentrados sobre una placa.Cuente el número de animales en la placa y ajuste la solución concentrada de nematodos. Tres a 10 microlitros por cada 30 gusanos. Finalmente, coloque aproximadamente 30 µL de animales de una misma etapa sobre la bacteria en cada pocillo de la placa preparada.Placa de 24 pocillos: más de 30 animales por pocillo puede provocar inanición. Después de que las gotas se sequen, lo cual tomará unos minutos, sujete la tapa con la banda de goma, incube los animales en posición invertida a la temperatura y duración requeridas, y luego analice los animales en la etapa deseada. Una vez que los nematodos estén listos para ser examinados, confirme que los controles positivo y negativo produzcan los fenotipos esperados. A continuación, observe los animales experimentales en busca de anomalías en el desarrollo.A continuación, utilizando un microscopio estereoscópico, monte ocho a 12 animales de cada pocillo sobre portaobjetos de Agri PET al 4% con una gota de cinco microlitros de anestésico. Después de colocar el cubreobjetos adecuado, realice observaciones de al menos cinco animales utilizando microscopía compuesta. Mantenga una base de datos organizada del gen, el número de animales observados y los resultados fenotípicos.Para cada experimento de ARNi, verifique cualquier fenotipo producido por el ARNi de R mediante otro fenotipo secundario, si es posible, y repitiendo el experimento; los experimentos repetidos pueden utilizar bacterias de la misma siembra. Las siembras más antiguas pueden dar lugar a un crecimiento deficiente en cultivos líquidos nocturnos y deben resiembrarse primero. Algunos cultivos bacterianos no crecerán bien debido al producto génico expresado en su plásmido.En este caso, simplemente concentre las bacterias antes de sembrarlas. Para una criba en curso, es importante mantener siempre muchos embriones listos para su clasificación. La cepa utilizada en la criba siempre debe estar alimentada, no privada de alimento, y libre de contaminantes que puedan afectar el fenotipo de interés.Establecimos un programa de mantenimiento para la alimentación de los animales. Los genes que afectan la localización de DBL uno se identificaron mediante ARNi utilizando una cepa diseñada para esta prueba. La expresión normal del marcador GFP en DBL uno incluye cuerpos celulares del cordón nervioso ventral y una fila de puntos en animales alimentados con AR antisentido dirigido contra DBL.Un ARNm mostró una expresión severamente atenuada de DBL uno. Estos animales también eran pequeños, al igual que los animales que carecían de DBL L uno funcional. La pantalla de ARN I identificó con éxito muchos otros genes cuyos productos afectan la localización de DBL uno, ampliando así nuestra comprensión de cómo se transporta a nivel subcelular la TGF beta y proporcionando un punto de partida para muchas otras investigaciones.Utilizando este método, una sola persona puede razonablemente preparar y observar de dos a cuatro series de experimentos cada semana. Por ejemplo, los animales preparados el lunes y el martes pueden observarse el jueves y el viernes respectivamente, y los animales pueden volver a prepararse el viernes y el sábado para el lunes y el martes. Observación mientras sigue este procedimiento durante todo su análisis.Es importante mantener muchos embriones listos para la clasificación, por lo tanto conserve regularmente la cepa de cribado. Asimismo, es fundamental tomar notas detalladas de todas las observaciones.

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Este protocolo describe cómo estudiar procesos celulares durante la conversión de destino celular en Caenorhabditis elegans en vivo. Uso de animales transgénicos, permitiendo sobreexpresión impulsado por el promotor de shock térmico la neurona destino-inducción del factor de transcripción CHE-1 y agotamiento RNAi-mediada de la regulación de cromatina factor LIN-53 germen célula neurona reprogramación puede observarse en vivo.<br...

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Aprende a identificar reguladores postembrionarios de expresión y localización proteica en C. elegans mediante un método de detección sensibilizado con ARN interferente y proteínas marcadas con fluorescencia.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans

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