Name: Imagen de Espectrometría de Masas MALDI de neuropéptidos en la enfermedad de Parkinson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Aprende a detectar cambios en neuropéptidos en cerebro de rata mediante espectrometría de masas MALDI. Este método permite localizar alteraciones inducidas por tratamiento en la enfermedad de Parkinson con alta especificidad molecular.

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Damos las gracias a Hanna Warner por su contribución a los datos de la Figura 3 y el Prof. Jonas Bergquist para sus valiosos comentarios. El Consejo Sueco de Investigación (Grant 522-2006-6416 (MA), 521-2007-5407 (MA), la Fundación La Åke Wiberg (MA, JH), La Real Academia Sueca de las Ciencias (MA, JH), y el químico sueco Sociedad (JH) se agradece por el apoyo financiero.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varias ventajas del empleo de la espectrometría de masas MALDI imágenes en el estudio de los neuropéptidos. Un análisis imparcial de los datos de MS puede revelar que los núcleos del cerebro sólo específicos, o como en los resultados presentados aquí, donde sólo la parte dorsolateral del cuerpo estriado se asocia con un estado fisiopatológico determinado. Al retener la información espacial es entonces posible volver a definir regiones de interés para el análisis estadístico con mayor sensibilidad y una menor variabilidad en comparación con el análisis de las secciones de todo el cerebro o utilizando estudios Peptidomics tradicionales en extractos peptídicos. Además, es importante darse cuenta de MALDI IMS fácilmente puede detectar previamente desconocidos modificaciones post-traduccionales, pero los análisis estructurales deben seguir para determinar las posiciones exactas de aminoácidos que están modificados. Errores comunes en la visualización de los datos de MALDI IMS incluyen el mapeo de la intensidad del pico máximo de una escala lineal óptica de blACK (0%) a color (100%) para todos y cada sección de la serie experimental (Figura 3), en lugar de mapear todas las secciones a una escala absoluta común donde 100% es la intensidad del pico máximo de todas las secciones (Figura 5) . Este último método permite la comparación de los datos del grupo y la visualización de las diferencias entre los grupos de tratamiento. Un obstáculo importante en el análisis de MALDI IMS es la asignación de los péptidos a los picos de comunicación específicos. En los tejidos en tándem de espectrometría de masas es a veces posible, pero a menudo resulta muy difícil 13,14. Nos parece que un enfoque más tradicional, incluyendo un fraccionamiento de preparación en la cromatografía de intercambio catiónico fuerte, seguido por LC-MS/MS de fase reversa se puede utilizar para la secuencia con éxito muchos neuropéptidos y péptidos opioides en particular. Todavía no es raro obtener una buena calidad de MS / MS espectros que no coinciden con las entradas de base de datos usando los motores de búsqueda comunes, tales como mascota. En estos casos de novo de secuenciación a mano es la ONLy opción. La última prueba de la identidad de pico se puede obtener por MALDI IMS de las secciones de tejido del ratón knock-out adecuada, pero esto no siempre está disponible o posible. Una alternativa consiste en validar los resultados mediante un método diametralmente distinto, por ejemplo, inmunotransferencia occidental o inmunohistoquímica. A menudo, esto puede incluir la producción de anticuerpos y una cantidad significativa de trabajo la validación de los nuevos anticuerpos. La estrategia general se presenta en este protocolo está optimizado para los experimentos a gran escala neuropéptido MALDI IMS, incluyendo varias secciones y las condiciones experimentales. El protocolo se ha optimizado especialmente para los péptidos opioides y tendrá un gran impacto en futuros estudios, tal como se emplea en diversos campos de investigación, incluyendo el dolor y los mecanismos subyacentes a la respuesta endógena a las drogas de adicción.

1.1 Toma de muestras y preparación <ol><li> El isoflurano (Apoteksbolaget AB, Suecia) </li><li> Instrumentos quirúrgicos, dos pares de tijeras, una gubia, espátula </li><li> De hielo seco finamente trituradas </li><li> Papel de aluminio y bolsas de plástico para el almacenamiento </li><li> Criostato (Microm, Heidelberg, Alemania) </li><li> Indio-estaño (ITO) revestida de diapositivas MALDI (Bruker Daltonics, Alemania) </li><li> de corte óptimo de temperatura media (PTU) (Sakura Finetek Europa, Países Bajos) </li><li> desecador de vacío </li></ol> 1.2 Matriz de la aplicación <ol><li> Acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de pro-análisis grado (Merck, Alemania). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> El agua se purificó con un sistema de purificación Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japón) o Retrato 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 Espectrometría de masas <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> Software de FlexImaging (v 2.0, Bruker Daltonics) </li><li> Péptido o proteína de calibración estándar (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Tratamiento de datos <ol><li> Origen v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab versión 7.9.0.529 (The MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 La neuropéptido <ol><li> La ecografía de ultrasonidos </li><li> 10 kDa de peso molecular de corte de filtro (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C 25 en gel (Sigma, Alemania) </li><li> Hypersil columna (ThermoFisher) </li><li> Piridina, ácido fórmico (AF), acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) de grado pro-análisis (Merck, Alemania). </li><li> Ácido trifluoroacético (TFA), Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). </li><li> Agilent 1100 LC de nanoflujo, microWPS, columna C18 (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 de Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip tablilla de puntería (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Bio funciona el software (V.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Mascota de software (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep base de datos ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

imagen de espectrometría de masas maldi de neuropéptidos en la enfermedad de parkinson

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imágenes de espectrometría de masas (IMS) es un enfoque poderoso que facilita el análisis espacial de las especies moleculares en muestras de tejidos biológicos 2 (Fig. 1). Una sección 12 micras tejido delgado está cubierta con una matriz de MALDI, lo que facilita la desorción y la ionización de péptidos y proteínas intactas que pueden ser detectadas con un analizador de masa, típicamente usando una TOF MALDI / espectrómetro TOF. Por lo general cientos de picos se puede evaluar en una sección de tejido cerebral de rata sola. En contraste con las técnicas de imagen comúnmente utilizados, este enfoque no requiere conocimiento previo de las moléculas de interés y permite el análisis no supervisado y completa de múltiples especies moleculares mientras se mantiene una alta especificidad y sensibilidad molecular 2. Aquí se describe un método MALDI basada en IMS a fin de elucidar los perfiles específicos de la región de distribución de neuropéptidos en el cerebro de la rata de la enfermedad de un modelo animal de Parkinson (EP). Enfermedad de Parkinson es una enfermedad común neurodegenerativa con una prevalencia del 1% para las personas mayores de 65 años de edad 3,4. El tratamiento sintomático más común se basa en la sustitución de la dopamina mediante L-DOPA 5. Sin embargo, esto se acompaña de efectos secundarios graves, incluyendo movimientos involuntarios anormales, llamados L-DOPA discinesias inducidas (LID) 1,3,6. Uno de los cambios moleculares más destacado en la tapa es una regulación del ARNm precursor de prodinorfina opioides 7. Los péptidos dinorfina modular la neurotransmisión en áreas del cerebro que están esencialmente involucrados en el control de movimiento de 7,8. Sin embargo, hasta la fecha los péptidos opioides exactas que se originan en el procesamiento del precursor neuropéptido no se han caracterizado. Por lo tanto, hemos utilizado MALDI IMS en un modelo animal experimental de la enfermedad de Parkinson y la L-DOPA discinesia inducida. MALDI imágenes espectrometría de masas demostrado ser particularmente ventajoso con respecto a neuropéptido caracterizaciónción, ya que los enfoques basados ​​en anticuerpos de uso común dirigido a las secuencias de péptidos conocidos y previamente observados modificaciones post-traduccionales. Por el contrario MALDI IMS puede desvelar nuevos productos de procesamiento de péptidos y así revelar nuevos mecanismos moleculares de la modulación de neuropéptido de la transmisión neuronal. Mientras que la cantidad absoluta de los neuropéptidos no se puede determinar por MALDI IMS, la abundancia relativa de los iones de péptidos se pueden delinear a partir de los espectros de masas, ofrecerá una visión de cambio en los niveles de salud y la enfermedad. En los ejemplos que aquí se presentan, las intensidades máximas de dinorfina B, alfa neoendorphin y la sustancia P se encontró que se incrementó significativamente en el dorso-lateral, pero no el cuerpo estriado dorsomedial, de los animales con discinesia grave en el tronco facial, y los músculos orolingual (Fig. 5). Por otra parte, MALDI IMS reveló una correlación entre la severidad de la discinesia y los niveles de des-tirosina alfa-neoendorphin, lo que representa un mecanismo previamente desconocido de la inactivación funcionalvación de dinorfinas en el cuerpo estriado como la eliminación de la N-terminal de la tirosina reduce la dinorfina de los receptores opiáceos capacidad de unión 9. Este es el primer estudio sobre la caracterización de neuropéptido Y en tapa con MALDI IMS y los resultados destacan el potencial de la técnica para su aplicación en todos los ámbitos de la investigación biomédica.

Farmacoterapia de reemplazo de dopamina mediante L-DOPA es el tratamiento más comúnmente utilizado sintomático de la enfermedad de Parkinson, pero se acompaña de efectos secundarios como movimientos involuntarios anormales, discinesia denomina<sup&gt; 1</sup&gt;. En este caso, un protocolo para la espectrometría de masas MALDI imagen se presenta que detecta cambios en los niveles de rata neuropéptidos cerebrales relacionadas con la discinesia.

Imagen de Espectrometría de Masas MALDI de neuropéptidos en la enfermedad de Parkinson

La espectrometría de masas por imagen (IMS) MALDI es un enfoque potente que facilita el análisis espacial de especies moleculares en muestras de tejido biológico2 ...

El objetivo principal de este procedimiento es elucidar la distribución espacial de neuropéptidos, específicamente péptidos opioides directamente en secciones cerebrales delgadas mediante espectrometría de masas por imágenes con matriz. Esto se logra primero recolectando secciones de tejido de 12 micrómetros de espesor de cerebro de rata previamente congelado rápidamente y luego montándolas sobre portaobjetos de vidrio conductivos. El segundo paso consiste en aplicar la matriz Matrixx en arreglos a través de las secciones utilizando una impresora química de inyección de tinta, y posteriormente adquirir un espectro de masas de cada punto de matriz.A continuación, se visualizan varios picos de péptidos para asegurar el éxito general del experimento. Esto va seguido de la inspección y procesamiento de la exportación de los espectros de masas y el postprocesamiento de los datos de péptidos, así como la evaluación estadística. El paso final consiste en analizar y validar los datos de péptidos obtenidos mediante espectrometría de masas por imagen de moho.En última instancia, los resultados muestran diferencias significativas en los niveles relativos de péptidos opioides en distintas áreas del cerebro entre los diferentes grupos de tratamiento. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como los enfoques basados en inmunoensayos con radioisótopos o geles SAO, es que la imagen múltiple permite la localización de cambios inducidos por el tratamiento manteniendo una alta especificidad molecular. Esto, a su vez, nos brinda la posibilidad de detectar, por primera vez, truncamientos no detectados previamente en modificaciones postraduccionales.Las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio porque la técnica requiere una preparación profunda de la muestra y un procesamiento exhaustivo de los datos. Aquí se hará hincapié en la calidad del tejido, la matriz, el protocolo de aplicación, la evaluación de los datos y los experimentos de validación posteriores. Es esencial trabajar con rapidez y diligencia durante la disección del tejido para evitar la degradación proteolítica.Después de sacrificar la rata según los protocolos aprobados, retire inmediatamente el cerebro, transfiéralo a hielo seco pulverizado y permita que el cerebro se congele relativamente despacio; luego almacénelo en un congelador a menos 80 grados Celsius. Los cerebros completos pueden almacenarse durante varios años antes del corte sin pérdida de calidad de la señal de MS. Cuando esté listo para comenzar el procedimiento, monte el cerebro sobre el portaobjetos utilizando medio de inclusión tipo Tissue Tech, evitando la contaminación de la parte del cerebro que se va a cortar, ya que el medio de inclusión interfiere con la ionización y la desorción de péptidos.Corte el tejido congelado en un microtomo criostato en secciones de 12 micrones y monte las secciones tisulares sobre portaobjetos conductivos para MALDI. En este momento, se puede realizar la tinción de las secciones tisulares y se puede inspeccionar la calidad del tejido. Esta figura muestra la tinción con violeta de genciana en tejido cerebral congelado rápidamente en nitrógeno líquido, lo que provocó que el tejido se agrietara y desgarrara.Este tejido no sería adecuado para espectrometría de masas de imágenes de molde con alta resolución, ya que la matriz se dispersará y no cristalizará de manera uniforme. Seque los cortes durante 15 minutos bajo vacío y almacene los portaobjetos a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior. Los cortes de tejido deben analizarse en el menor tiempo posible tras el corte, incluso si se almacenan a menos 80 grados Celsius. Primero, descongele los cortes en un desecador durante una hora, luego lave los portaobjetos con los cortes en etanol al 70 % a temperatura ambiente durante 10 segundos, seguido de dos lavados en etanol al 95 % a temperatura ambiente durante 10 segundos cada uno. Después del lavado, seque los portaobjetos en un desecador durante 10 minutos.Examine las secciones bajo un microscopio para asegurarse de que las secciones de tejido sean de buena calidad, sin distorsión del tejido, microdesgarros ni grietas pequeñas que pudieran afectar la calidad de la EMS del molde. A continuación, prepare una solución matricial fresca compuesta por 50 miligramos por mililitro de DHB y 50% de metanol, 10% de acetato de amonio 150 milimolar y 0,3% de ácido trifluoroacético en agua. Escanee el portaobjetos con la sección de tejido y alinee el portaobjetos con los puntos de referencia respectivos utilizando la función de análisis de imagen en el software del chip.Luego, seleccione los parámetros adecuados de aplicación de la matriz para la región cerebral y los analitos objetivo. A continuación, especifique la resolución espacial. Ahora, aplique la matriz utilizando el protocolo optimizado en la impresora química Jett.Escanee las secciones finales con puntos de matriz y guarde la imagen antes de la solicitud múltiple de datos. Esta se utilizará posteriormente para cruzar los depósitos de la matriz con las coordenadas del motor del estadio maldi. Si no se utilizan inmediatamente, las secciones con puntos de matriz pueden almacenarse en un desecador bajo vacío hasta que sean necesarias.Para la mayoría de los experimentos, se analizarán varias secciones al mismo tiempo, como se observa aquí. Cada portaobjetos contiene dos portaobjetos de vidrio, por lo tanto, deben analizarse múltiples pares de dos para todos los portaobjetos. Los métodos y parámetros de adquisición de TOF por molde deben ser los mismos; sin embargo, las calibraciones de masa de péptidos deben verificarse para cada portaobjeto.Luego, optimice los parámetros de adquisición en la muestra de tejido, incluyendo el enfoque del láser y la intensidad del láser. A continuación, introduzca el número de disparos necesarios para obtener una señal de MS óptima sin elevar la línea base ni reducir la resolución de los picos. Sature el detector o ablate matriz de depósitos de matriz vecinos y seleccione el movimiento del láser.Estime el número máximo de disparos que se pueden realizar por punto de matriz hasta que solo se detecte ruido aquí. Se acumulan 600 disparos de cada depósito de matriz en pasos de 25 disparos, para un total de 24 pasos, utilizando un patrón aleatorio de movimientos. Compare los escaneos de todas las secciones punteadas con las coordenadas del motor de la etapa MALDI utilizando el software flex imaging.Luego, utilizando software de ejecución automática por lotes, realice la adquisición de datos en modo por lotes. Utilice herramientas de visualización de datos, como Flex Imaging, para inspeccionar visualmente las imágenes de IMS de Maorí y evaluar las distribuciones de intensidad de picos, y determinar si dichas distribuciones están relacionadas con características del tejido, calidad del punteado o efectos de normalización. Este ejemplo muestra la distribución de 10 picos de péptidos diferentes en nueve animales distintos.La corriente total de hierro o CTH que se utiliza para la normalización se muestra en blanco. La CTH es la suma de cada valor de intensidad en un espectro de masas. El valor de CTH es muy bajo en el animal tres, y las imágenes de péptidos muestran más ruido que información específica.El cerebro del animal número seis muestra un área en la parte inferior de la sección con valores de TIC muy altos. Esto se refleja como intensidades anormalmente elevadas en esa zona de las imágenes de péptidos, C y D. Este es un posible efecto de sobre-normalización que puede influir en el análisis de datos. Los efectos de sobre-normalización pueden llevar a resultados inexactos si están presentes específicamente en solo un grupo de tratamiento.En este ejemplo, la CIT es significativamente más alta para el grupo C, lo que puede afectar anormalmente las intensidades individuales de los picos. Por ejemplo, la intensidad promedio del pico de citocromo C es mayor para el grupo C que para el grupo B en los datos crudos, pero tras la normalización, la intensidad del pico ahora es menor. Para el grupo C, esto puede conducir a interpretaciones erróneas graves de los resultados.Es importante calcular siempre el TIC promedio para cada grupo de tratamiento antes de proceder con una validación extensiva de los datos. A continuación, para definir la región de interés, es fundamental tener en cuenta que el ARN mensajero de pro dinorfina se traduce en el pro péptido de pro dinorfina de 14 kilodalton. En neuronas estriadas, la pro dinorfina se empaca en vesículas que son transportadas a través de las dendritas hacia otras neuronas estriadas, y a través de los axones hacia la sustancia negra, ubicada a varios milímetros del cuerpo celular.Las vesículas contienen enzimas que procesan aún más el pro péptido en péptidos di norfina, como la alfa neo endorfina di norfina A o la di norfina B. Cada uno puede activar diferentes receptores opiáceos al liberar la estructura diana, la sustancia negra; las dinorfinas se procesan y eliminan adicionalmente mediante endo y exopeptidasas. Algunos de estos péptidos solo pueden detectarse mediante espectrometría de masas, ya que los anticuerpos existentes solo se dirigen al extremo C-terminal de los péptidos y no al extremo terminal. La secuencia Y-G-G-F-L, responsable de la activación del receptor opioide, las células productoras de di norfina residen en la región AUM y proyectan hacia la sustancia negra.Por lo tanto, en el siguiente experimento, tanto el AUM extraviado como la sustancia negra se analizaron mediante IMS con moho, utilizando los espectros de cada región de interés. La región estriatal dorsomedial y dorsolateral del AUM, así como la sustancia negra medial y lateral, se definieron en el software de análisis Flex y se exportaron para el análisis de datos. Para la reducción de datos, realice la detección de picos utilizando las herramientas de búsqueda de picos incluidas en diferentes softwares.Por ejemplo, utilice análisis de picos en Origin o MS Peaks en Matlab. Exporte la lista de picos de todos los espectros como un único archivo de texto delimitado por tabulaciones, determine los límites inicial y final de los picos utilizando software como el binario P de Freeway, calcule el área bajo la curva entre los límites del pico y utilice estos valores para el análisis estadístico. La reproducibilidad entre los grupos de tratamiento se puede evaluar calculando la traza media de MS y el error estándar para cada valor de masa.En este ejemplo, los espectros promedio de la sustancia negra control intacta se utilizarán para evaluar la variabilidad a lo largo del rango de masas analizado. Se puede observar una buena reproducibilidad ya que las intensidades de los picos son iguales en ambos grupos control y la desviación estándar es baja. Esto garantiza un análisis estadístico válido.Si los conjuntos de datos muestran un alto grado de variación, casi siempre es necesario repetir el experimento Maori IMS, reduciendo en lo posible las fuentes experimentales de variación. Típicamente, procesamos tantas secciones y animales como sea posible en una sola sesión, a veces incluyendo varias personas trabajando por turnos. Sin embargo, en algunos casos, esto aún no es suficiente y se pueden emplear otras estrategias.Por ejemplo, si algunos espectros consisten en ruido, estos pueden eliminarse mediante la representación gráfica de la distribución de frecuencia de la TIC y puede utilizarse un valor umbral de corte para eliminar datos subóptimos. Otra forma de evaluar los datos es representar gráficamente todos los picos de dos animales dentro del mismo grupo uno frente al otro. Si las intensidades de los picos son iguales en ambos animales, el gráfico de intensidad frente a intensidad muestra una línea estrecha y recta.Si un animal contiene datos espectrales de baja calidad, la gráfica normalmente muestra desplazamientos asimétricos respecto a la línea recta, como se observa a la derecha. Para la identificación de secuencias de péptidos, realice un análisis de peptid Dominic en extractos de tejido cerebral de rata utilizando cromatografía líquida multidimensional acoplada a espectrometría de masas de alta resolución. Breve descripción: los neuropéptidos se extraen de secciones cerebrales de rata y se prefraccionan mediante cromatografía de intercambio catiónico fuerte.Las diferentes fracciones luego se separan adicionalmente mediante HPLC de fase reversa de flujo nano. A continuación, caracterice los neuropéptidos mediante espectrometría de masas en tándem con electroaspersión utilizando un instrumento híbrido de trampa iónica lineal con transformada de Fourier en resonancia ciclotrónica de iones; finalmente, realice la identificación de la secuencia de péptidos mediante coincidencia con bases de datos. Existen anticuerpos específicos disponibles para algunos neuropéptidos, y experimentos de inmunohistoquímica pueden validar tanto la identificación de péptidos como los resultados experimentales. La resolución es mayor que la de la espectrometría de masas por imágenes Maori y se puede obtener información adicional.En este ejemplo, se pueden observar fibras nerviosas inmunorreactivas a la Dior bee en el hipocampo, panel superior izquierdo, y en la sustancia negra, panel inferior izquierdo, mientras que la imagen de IMS Maori en la parte inferior derecha revela la localización a nivel de diferentes áreas cerebrales. La prueba definitiva de que un pico de masa puede asignarse inequívocamente a un péptido específico consiste en realizar IMS moldy en animales knockout del péptido, en el ratón knockout de la pronina. Varios picos, indicados por las flechas, faltan en el knockout, pero no en el control de tipo silvestre.Animales Picos de péptidos no relacionados, como la sustancia P y la P tinta, no muestran diferencias entre los animales knockout y los controles. Las intensidades de los picos de dinorfina B y alfa-neoendorfina están significativamente aumentadas en la lesión por seis hidroxidopamina. El estriado parkinsoniano de animales con discinesia severa, indicado mediante flechas, en comparación con los grupos control de lesión y de discinesia leve.El análisis estadístico también reveló un aumento significativo en una masa peptídica correspondiente a la alfa-neoendorfina truncada, en la cual la tirosina terminal fue eliminada. De hecho, la inspección visual de los resultados de imagen muestra una alta colocalización de los péptidos parentales di-norfina mostrados en verde, y sus metabolitos relacionados con DES tirosina mostrados en rojo; el amarillo indica superposición regional en el panel de superposición a la derecha. El gran potencial de esta técnica queda resaltado por los hallazgos sobre el procesamiento selectivo de péptidos en diferentes estructuras cerebrales que no pueden detectarse con otros métodos.Aquí, los metabolitos específicos de tirosina de DES mostrados en rojo se colocalizaron con el péptido progenitor mostrado en verde y solo se observaron en el estriado, pero no en la sustancia negra de ratas discinéticas. En el análisis de imágenes de la sustancia negra, se reveló que el producto de degradación lu y kelin arch mostrado en rojo estaba inversamente localizado respecto a la di norfina B mostrada en verde, lo que indica que durante la discinesia, la di norfina B fue liberada localmente en la sustancia negra lateral y luego metabolizada a lu y cuidadoso en un sistema AR Uno. Un solo experimento utilizando imágenes moldeadas puede realizarse en un día o dos, incluyendo la preparación de muestras y la adquisición de datos.Esto va seguido luego por otro día o dos para la evaluación de datos. Dependiendo del tamaño de la muestra, los experimentos de validación requerirían otro día o dos de experimentos prácticos en el laboratorio si se realizan adecuadamente. Es importante tener especial cuidado en los siguientes pasos.La disección y congelación de tejidos debe realizarse rápidamente para evitar la degradación de pep, y el lavado y el protocolo de aplicación de matriz deben optimizarse para cada experimento. La evaluación de datos y el análisis estadístico deben evaluarse cuidadosamente para evitar falsos positivos debido a efectos de sobre-normalización o detecciones deficientes de picos.

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A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

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Se describe una ELISA que ofrece un enfoque cuantitativo novedoso. Detecta específicamente alfa-sinucleína asociada a la enfermedad (αSD) en un modelo de ratón transgénico (M83) de sinucleinopatía utilizando varios anticuerpos contra la forma de alfa-sinucleína fosforilada en Ser129 o la parte C-terminal de la proteína.

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