Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función génica de manera cuantitativa y observar la elegancia a escala del genoma completo. Esto se logra primero mediante la reducción de la expresión de cada gen mediante ARN de interferencia en placas de 96 pocillos.

A continuación, se realiza la prueba pertinente para la función génica. En este ejemplo, se evalúa la capacidad de la anémona de mar para responder normalmente a una infección fúngica mediante el análisis de la expresión de un reportero fluorescente inducible. Luego, se lleva a cabo un análisis cuantitativo automatizado utilizando el Coss bio sortt. Finalmente, el análisis de rasgos cuantificables, como la expresión de un gen reportero fluorescente, revela subconjuntos de genes que son necesarios para modular vías particulares, gobernar el desarrollo, el comportamiento o la fisiología.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diversos campos en los que se observa elegancia, como el desarrollo, la neurobiología y las interacciones entre patógenos y huéspedes. Tuvimos la idea original de este método cuando el laboratorio de Oranger publicó las primeras cribas a gran escala de ARN en ojos. Se requirió un esfuerzo considerable para desarrollar las herramientas necesarias y perfeccionar la automatización.

Voy a demostrar el procedimiento junto con Olivia Ti, científica titular y asistente de investigación del laboratorio de Jonathan Eubanks. Para preparar de 10 a 1296 placas de cultivo, comience preparando 100 mililitros de medio de crecimiento para nematodos, o NGM, en agua desionizada. Consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones.

Mientras el medio aún esté tibio, añada 100 microgramos por mililitro de ampicilina, 12,5 microgramos por mililitro de tetraciclina y cuatro milimolar de IPTG, y distribuya rápidamente 75 microlitros en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Revise y elimine cualquier burbuja de aire presente en los pocillos inmediatamente. Almacene las placas en una cámara húmeda a cuatro grados centígrados.

A continuación, prepare placas de 96 pocillos profundos añadiendo 1,5 mililitros de LB que contenga ampicilina y tetraciclina. Añada una etiqueta única o un código de barras a cada pocillo. Tape cada placa y almacénela a cuatro grados centígrados si se prepara con antelación; agite la placa de reserva de LB de 96 pocillos que contiene el RNAI.

Clones bacterianos con ampicilina, tetraciclina y glicerol, y distribuya tres microlitros de cada clone bacteriano en el pocillo correspondiente de una placa profunda de 96 pocillos previamente preparada. Utilice pocillos vacíos como controles, cubra las placas de 96 pocillos con una película adhesiva e incúbelas durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Coloque la placa de réplica de 96 pocillos utilizada a menos 80 grados Celsius a la mañana siguiente al cultivo nocturno.

Transfiera las placas NGM de 96 pocillos de cuatro grados centígrados a una cabina de flujo laminar estéril y déjelas calentar y secar durante cinco a 15 minutos. Luego agregue la etiqueta o código de barras correspondiente a cada placa. Recupere las placas de cultivo nocturno de 96 pocillos profundos del incubador.

Observe las culturas bacterianas crecidas con éxito en el centrífugo. Las placas de pozo profundo de 96 pocillos durante cinco minutos a 4.000 RPM. Elimine el sobrenadante volviendo bruscamente la placa boca abajo y seque rápidamente.

Los bordes de la placa sobre una toalla de papel resuspenden el pellet bacteriano en el líquido residual mediante vortex. Idealmente, utilizando un agitador dedicado para que cada placa reciba exactamente el mismo tratamiento. Transfiera cinco microlitros de las bacterias resuspendidas en Resus a las placas NGM de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal de ocho o 12 canales.

Evite tocar el NGM. Deje secar las bacterias bajo un gabinete de flujo laminar estéril durante aproximadamente dos horas. Verificando regularmente para evitar que el NGM se seque demasiado, incube las placas de 96 pocillos R-N-A-I-N-G-M a 37 grados centígrados durante la noche en una cámara húmeda.

Consulte el protocolo escrito para preparar una población sincronizada de gusanos tras enfriar las placas de 96 pozos R-N-A-I-N-G-M a temperatura ambiente. Añada aproximadamente de 100 a 200 gusanos en dos microlitros de medio M nueve a cada pozo. Verifique que cada pozo contenga gusanos.

Los gusanos deben estar nadando. Deje que las placas se sequen bajo una cabina de flujo laminar estéril durante un máximo de una hora. Revise las placas regularmente.

Los gusanos deben arrastrarse en lugar de nadar. Coloque las placas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche. Después de seleccionar un lote altamente infeccioso de esporas de Judge Miria.

Use el tampón M nueve para recolectar los esporos de una placa de nueve centímetros. Distribuya cuatro microlitros de esporos en cada pocillo y revise cada pocillo en busca de esporos. Los gusanos deben estar nadando.

Deje secar las placas bajo un gabinete de flujo laminar estéril durante aproximadamente una hora. Revise las placas regularmente hasta que los gusanos comiencen a desplazarse. Luego, coloque las placas infectadas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche.

Revise los gusanos antes del análisis observándolos rápidamente bajo un microscopio fluorescente para verificar un desarrollo exitoso, con buena inducción de GFP en el control negativo y reducción de la fluorescencia de GFP en los pocillos del control positivo. Si la inducción es adecuada, utilice una pipeta multicanal de ocho o doce canales para transferir los gusanos con 100 microlitros de NaCl 50 milimolar y 0,05 % de Tritón a una nueva placa de 96 pocillos con fondo redondo, etiquetada o con código de barras.

Congele las placas a menos 80 grados Celsius hasta el día del análisis. Ese día, descongele las placas congeladas a temperatura ambiente. Una vez que las placas se hayan descongelado, continúe con el análisis automatizado utilizando el COPA bios.

El equipo trata la placa pozo por pozo y analiza los parámetros de cada gusano, como su fluorescencia. Transcriba la información obtenida del biosortt COPA en un archivo de Excel para verificar la calidad de los datos. Luego, almacene los datos brutos, incluyendo densidad óptica, longitud axial y emisiones fluorescentes, en un paquete limbs para análisis cuantitativos detallados posteriores.

En este experimento, los gusanos transgénicos expresaron constitutivamente un reportero P call 12 ds red y un PNLP 29 GFP inducible. Los gusanos reporteros fueron expuestos a un control o a un clon de ARN de interferencia de GFP-A durante 48 horas. Los paneles de la izquierda corresponden a gusanos no infectados, y los de la derecha, a gusanos 18 horas después de la infección con D spora.

Cuando el fenotipo de interés es la expresión de un reportero GFP, los pozos con el clon de ARNi para GFP proporcionan un control robusto. COPA bios SORTT genera datos numéricos para cada gusano analizado. Estos gráficos muestran el promedio y la desviación estándar para cada pozo de gusanos transgénicos.

Expresando constitutivamente un reportero DS rojo p call 12 y un reportero GFP PNLP 29 inducible tras el ARNi y la infección con diaspora. El clasificador analiza el tiempo de vuelo (TOF), que corresponde al tamaño de los gusanos, la fluorescencia roja y la relación entre la fluorescencia verde y el TOF. Algunos clones provocan defectos de crecimiento y/o afectan la expresión de DS rojo P 12.

Otros afectan específicamente la expresión de las proteínas fluorescentes. Por ejemplo, este clon particular dirige el gen NS Y uno que previamente se ha demostrado importante para la regulación de NLP 29. La fluorescencia verde y roja, y el TOF, se miden en unidades arbitrarias pero constantes.

Una de las innovaciones de este protocolo es el uso de placas congeladas para posponer su análisis. La congelación permite almacenar las placas hasta dos semanas sin alterar sustancialmente los resultados, como se muestra aquí. Aunque los valores absolutos de la fluorescencia medida puedan cambiar, sus proporciones relativas permanecen similares.

Se infectaron o no cuatro gusanos portadores de los transgenes PNLP-29::GFP y Pcall-12::dsRed con diáspora. Tras 18 horas, cada placa se dividió aproximadamente en dos mitades: una mitad se analizó inmediatamente y la otra se congeló a menos 80 grados Celsius durante 24 horas antes de descongelarse. Se calcularon valores de análisis para el tamaño promedio, opacidad y fluorescencia verde y roja para cada muestra.

El gráfico muestra la relación del promedio de muestras infectadas dividido por el de muestras no infectadas, para las muestras congeladas y vivas mostradas aquí. A partir de análisis duplicados de una placa representativa, se obtienen las relaciones de fluorescencia normalizadas para cada pocillo, que corresponden al valor medio de fluorescencia de un pocillo dividido por la media recortada de la placa. Una vez dominado, este protocolo puede permitir que un grupo de dos a tres personas realice una criba a escala del genoma en dos a tres meses.

La ejecución exitosa de este protocolo requiere un buen trabajo en equipo. Los miembros de mi grupo invirtieron un esfuerzo enorme para elaborar un protocolo eficiente y relativamente fácil de llevar a cabo.