Name: Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprende a realizar pantallas de RNAi de alto rendimiento en C. elegans para estudiar inmunidad antifúngica innata mediante análisis automatizado de fluorescencia. Este método cuantitativo permite identificar genes clave en respuestas inmunes.

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Damos las gracias a D. Braendle, Kurz CL y F. Sanchis Montañana-por sus contribuciones. Este proyecto fue apoyado por becas de la ANR y el Consejo Regional PACA, y la financiación institucional del INSERM y el CNRS.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
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<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

El laboratorio de Ewbank colabora con la Unión Biometrica y Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; El protocolo actual permite a gran escala de cribado de RNAi en<em&gt; C. elegans</em&gt; En medios sólidos, utilizando el nivel de expresión de un gen reportero fluorescente como una lectura. Se ha optimizado con herramientas automatizadas para facilitar los ensayos de alto rendimiento, lo que permite un manejo fácil y rápida de grandes cantidades de muestras, de una manera eficiente, fiable y reproducible. Otros métodos se han descrito que no depender tanto de tratamiento automatizado de muestras líquidas<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Uno de los aspectos clave de la organización para que el protocolo ha sido el desarrollo de un método robusto de seguimiento de la muestra mediante la adaptación del software comercial MBioLIMS al procedimiento pantalla de RNAi en colaboración con la ModulBio empresa. En cada etapa del procedimiento, las placas están identificados por códigos de barras generados en el LIMS. Como el LIMS también registra la identidad de los clones en cada pocillo en cada placa, pasando de bien a gen putativo es simple. Y más allá de esto, los enlaces de LIMS a la base de datos de WormBase comunidad, permitiendo el acceso directo a los datos moleculares y funcionales acerca de un determinado gen. El LIMS también facilita el análisis que se llevó a cabo en la placa o incluso a nivel de cromosomas y todo el genoma. Para estos análisis, los datos se almacenan en una forma que es totalmente compatible con las herramientas descritas anteriormente, tales como COPAmulti<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Un punto crítico experimental en el método es el ajuste de la cantidad de alimentos en relación con el número de gusanos. Para los ensayos de muchos, es esencial que los gusanos no hambre al final del experimento, pero también es importante no tener demasiada comida en el comienzo. Hemos observado que una alta densidad de alimentos disminuye la inducción de fluorescencia en el protocolo utilizando gusanos que llevan la p<em&gt; PNL-29</em&gt; :: Reportero GFP. Esto puede reflejar una disminución de la eficiencia de la infección, cuando los gusanos se cultivan en las bacterias demasiado (BS, resultados no publicados). Al mismo tiempo, las condiciones de cultivo de la bacteria ARNi también es importante, ya que esto determina si dsRNA se produce a un nivel óptimo. Algunos protocolos de RNAi a gran escala requiere la cultura de los clones de RNAi en placas de agar antes de la siembra de cultivos líquidos<sup&gt; 8</sup&gt;. Se obtuvo el silenciamiento de genes robustos omitir este paso. Hemos optado por un exceso de crecimiento de cada cultura para garantizar resultados homogéneos. El protocolo descrito en el hecho proporciona material suficiente para llevar a cabo 2 o 3 pantallas en paralelo. Con el fin de obtener los resultados más sólidos, estamos a favor, sin embargo, la realización de las pantallas en duplicado utilizando cultivos independientes de los gusanos, bacterias y esporas de hongos RNAi.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Otro paso crítico está relacionado al uso de medio que no sea ni muy húmedo ni muy seco. Si las placas no se seque lo suficiente, el ARNi las bacterias no se seque correctamente y los gusanos van a nadar durante el ensayo. Esto puede causar problemas. Por ejemplo, los gusanos no son eficientemente infectados por<em&gt; D. coniospora</em&gt; En el líquido (C. Couillault, resultados no publicados). Por otro lado, en placas secas, la osmolaridad de los incrementos de medio de cultivo. Esto tiene efectos directos sobre la fisiología del gusano<sup&gt; 17</sup&gt;, Incluyendo la inducción de algunos genes de péptidos antimicrobianos, tales como<em&gt; PNL 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. El volumen utilizado para dispensar gusanos y esporas es crítico para permitir un secado rápido y eficaz. Si hay más de 10 l de líquido se añade a las placas frescas, los pocillos puede tomar muchas horas para secar. Esto puede significar que es difícil de utilizar métodos robóticos para añadir gusanos a las placas. Por ejemplo, cada gusano es dispensado por la Biosort en alrededor de 1 l de líquido. En la actualidad distribuir los gusanos de forma manual ya que también nos permite superar la tendencia de los gusanos en la solución de los sedimentos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Hemos informado anteriormente de un ajuste de la Biosort que permitió una placa de 96 pocillos a analizar en 36 minutos<sup&gt; 19</sup&gt;. IBU de la máquina fabricante ofrece ahora una modificación de la Biosort para disminuir aún más el tiempo de análisis. Con el &quot;FastReFlex&quot;, las muestras se enrutan directamente a través de la celda de flujo para el análisis, sin pasar por el filtro de burbuja trampa. Esto resulta en una reducción significativa en el tiempo para la adquisición de datos; una placa entera puede ser analizado en 22 minutos permitiendo alrededor de 20 placas a tratar por día. Si las placas no se congelaron, sin embargo, habría un intervalo de 8 horas entre las primeras y la última. Dada la relativamente corta duración del experimento, con la infección que dura sólo 18 horas, esto introduciría una variable inaceptable través de las placas. No sólo las placas de congelación antes del análisis de resolver este problema, pero también es esencial en el contexto de análisis de alto rendimiento, ya que con el protocolo actual y los robots estándar de manejo de líquidos, 2 personas puede procesar hasta 50 planchas a la semana. En la actualidad, de manera rutinaria la pantalla de 30 platos a la semana, lo que permite una pantalla de todo el genomaque se llevó a cabo una vez en menos de 2 meses.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Una característica interesante de este protocolo es el hecho de que utiliza agar sólido, permitiendo ensayos que no se pueden realizar en cultivo líquido. Como fisiología gusano difiere dependiendo de las condiciones de cultivo<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Siendo capaz de realizar los ensayos en medio sólido también puede complementar habituales pantallas de base líquida. Para ciertos fenotipos (por ejemplo, movimiento), el análisis puede llevarse a cabo directamente con placas de medio 96-bien sólidos. Para la pantalla actual, sin embargo, como la Biosort no puede muestrear de placas de medio sólido, gusanos se transfiere primero a líquido antes de la congelación. Por otro lado, la Biosort COPAS permite un análisis cuantitativo multiparamétrico compatible con la medición de muchos fenotipos diferentes. Es probable que para cualquier pantalla dado que no todos los parámetros medidos será la principal lectura. No obstante, estas medidas pueden ser útiles por varias razones. Ellos permiten una para determinar si el ensayo funcionó correctamente. Por ejemplo, se puede comprobar el número y tamaño de los gusanos en cada pocillo. Sólo cuando un clon ARNi debe bloquear el crecimiento o la reproducción no debe haber una desviación de los valores esperados. Los pozos con menos de 20 gusanos o / y de los animales un 30% más pequeños (TOF) en comparación con estándaresestándar de control sin efecto sobre el crecimiento (<em&gt; Por ejemplo, las buenas prácticas agrarias (RNAi</em&gt;)) Pueden ser excluidos de los análisis posteriores. La función de estos clones se pueden abordar utilizando un protocolo alternativo en el que los gusanos están expuestos a las bacterias RNAi después de su desarrollo está muy avanzada<sup&gt; 15</sup&gt;. Los diferentes parámetros también se pueden utilizar para refinar gen candidato (golpe) la selección, por ejemplo, la limitación de accesos sólo a los que afectan a la fluorescencia verde, pero no en rojo. El método exacto elegido para seleccionar muestras dependerá del tipo de pantalla y su exacta lectura. Dada la complejidad de los datos generados a partir de un análisis cuantitativo del genoma de pantalla ancha, la colaboración con un experto en estadística que sean necesarios.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; El protocolo se describe se puede adaptar fácilmente a otros tipos de ensayos. Por ejemplo, en la etapa de infección<em&gt; D. coniospora</em&gt; Podría ser reemplazado por cualquier otro patógeno capaz de infectar a los medios sólidos. Esto es potencialmente útil como hemos encontrado que muchos de los factores de virulencia importantes de Serratia marcescens infección en cultivo líquido no juegan un papel durante la infección en un medio sólido (E. Pradel, comunicación personal). El protocolo es también totalmente compatible con las pruebas de los compuestos químicos<sup&gt; 22-24</sup&gt;, O para identificar compuestos con actividad biológica con diferentes bibliotecas de las bacterias<sup&gt; 25</sup&gt;, Por lo que debe encontrar una utilidad general en el<em&gt; C. elegans</em&gt; Comunidad de investigación.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopeptona </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Película adhesiva AeraSeal </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 pozos profundos </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 96 pocillos plana </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96 placa redonda y </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> La tetraciclina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Todo proveedor que </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN robot </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Unión Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de rnai pantallas en c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

La interferencia de ARN es un poderoso método para comprender la función de genes, especialmente cuando se realiza a escala de todo el genoma y en un contexto cuantitativo. En C. elegans, la función del gen puede ser derribado sencilla y eficaz por la alimentación de los gusanos con bacterias que expresan el dsRNA correspondiente a un gen específico 1. Si bien la creación de bibliotecas de clones de RNAi cubriendo la mayor parte de la C. elegans genoma 2,3 abrió el camino para que los verdaderos estudios de genómica funcional (véase, por ejemplo 4-7), la mayoría de los métodos establecidos son laboriosos. Moy y sus colegas han desarrollado protocolos de semi-automatizados que facilitan todo el genoma de las pantallas de 8. El enfoque se basa en imágenes microscópicas y análisis de imágenes. A continuación se describe un protocolo alternativo para un alto rendimiento en todo el genoma de pantalla, basado en la manipulación robótica de clones bacterianos ARNi, el análisis cuantitativo utilizando el Biosort COPAS (Unión Biometrica (UBI)), y unsoftware integrado: el MBioLIMS (Laboratory Information Management System de Modul-Bio) una tecnología que proporciona un mayor rendimiento para la gestión de datos y el seguimiento de la muestra. El método permite que las pantallas se llevó a cabo en placas de medio sólido. Esto es particularmente importante para algunos estudios, como los que abordan las interacciones huésped-patógeno en C. elegans, ya que ciertos microbios no son eficientes gusanos infectan en cultivo líquido. Se muestra cómo el método puede ser utilizado para cuantificar la importancia de los genes en el anti-hongos inmunidad innata en C. elegans. En este caso, el método se basa en el uso de una cepa transgénica llevar una infección epidérmica inducible del gen reportero fluorescente, con GFP bajo el control del promotor del gen del péptido antimicrobiano nlp 29 y un reportero fluorescente de color rojo que se expresa constitutivamente en el epidermis. Este último proporciona un control interno para la integridad funcional de la epidermisy no específica del transgén silenciar 9. Cuando los gusanos de control están infectadas por el hongo que presentan fluorescencia verde. Derribar por RNAi un gen necesario para la expresión resultados Nlp 29 en la fluorescencia disminuida después de la infección. En la actualidad, este protocolo permite a los más de 3.000 clones de RNAi para ser probado y analizado por semana, abriendo la posibilidad de la detección del genoma completo en menos de 2 meses.

Se describe un protocolo de uso de<em&gt; C. elegans</em&gt; Y las bibliotecas de RNAi de alimentación que permite la medición automática de múltiples parámetros, como la fluorescencia, el tamaño y la opacidad de los gusanos individuales de una población. Damos un ejemplo de una pantalla para identificar genes implicados en la anti-hongos en la inmunidad innata<em&gt; C. elegans</em&gt;.

Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

La interferencia de ARN es un método potente para comprender la función génica, especialmente cuando se lleva a cabo a escala de genoma completo y en un contexto cuantitativo. En C. ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función génica de manera cuantitativa y observar la elegancia a escala del genoma completo. Esto se logra primero mediante la reducción de la expresión de cada gen mediante ARN de interferencia en placas de 96 pocillos.A continuación, se realiza la prueba pertinente para la función génica. En este ejemplo, se evalúa la capacidad de la anémona de mar para responder normalmente a una infección fúngica mediante el análisis de la expresión de un reportero fluorescente inducible. Luego, se lleva a cabo un análisis cuantitativo automatizado utilizando el Coss bio sortt. Finalmente, el análisis de rasgos cuantificables, como la expresión de un gen reportero fluorescente, revela subconjuntos de genes que son necesarios para modular vías particulares, gobernar el desarrollo, el comportamiento o la fisiología.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diversos campos en los que se observa elegancia, como el desarrollo, la neurobiología y las interacciones entre patógenos y huéspedes. Tuvimos la idea original de este método cuando el laboratorio de Oranger publicó las primeras cribas a gran escala de ARN en ojos. Se requirió un esfuerzo considerable para desarrollar las herramientas necesarias y perfeccionar la automatización.Voy a demostrar el procedimiento junto con Olivia Ti, científica titular y asistente de investigación del laboratorio de Jonathan Eubanks. Para preparar de 10 a 1296 placas de cultivo, comience preparando 100 mililitros de medio de crecimiento para nematodos, o NGM, en agua desionizada. Consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones.Mientras el medio aún esté tibio, añada 100 microgramos por mililitro de ampicilina, 12,5 microgramos por mililitro de tetraciclina y cuatro milimolar de IPTG, y distribuya rápidamente 75 microlitros en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Revise y elimine cualquier burbuja de aire presente en los pocillos inmediatamente. Almacene las placas en una cámara húmeda a cuatro grados centígrados.A continuación, prepare placas de 96 pocillos profundos añadiendo 1,5 mililitros de LB que contenga ampicilina y tetraciclina. Añada una etiqueta única o un código de barras a cada pocillo. Tape cada placa y almacénela a cuatro grados centígrados si se prepara con antelación; agite la placa de reserva de LB de 96 pocillos que contiene el RNAI.Clones bacterianos con ampicilina, tetraciclina y glicerol, y distribuya tres microlitros de cada clone bacteriano en el pocillo correspondiente de una placa profunda de 96 pocillos previamente preparada. Utilice pocillos vacíos como controles, cubra las placas de 96 pocillos con una película adhesiva e incúbelas durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Coloque la placa de réplica de 96 pocillos utilizada a menos 80 grados Celsius a la mañana siguiente al cultivo nocturno.Transfiera las placas NGM de 96 pocillos de cuatro grados centígrados a una cabina de flujo laminar estéril y déjelas calentar y secar durante cinco a 15 minutos. Luego agregue la etiqueta o código de barras correspondiente a cada placa. Recupere las placas de cultivo nocturno de 96 pocillos profundos del incubador.Observe las culturas bacterianas crecidas con éxito en el centrífugo. Las placas de pozo profundo de 96 pocillos durante cinco minutos a 4.000 RPM. Elimine el sobrenadante volviendo bruscamente la placa boca abajo y seque rápidamente.Los bordes de la placa sobre una toalla de papel resuspenden el pellet bacteriano en el líquido residual mediante vortex. Idealmente, utilizando un agitador dedicado para que cada placa reciba exactamente el mismo tratamiento. Transfiera cinco microlitros de las bacterias resuspendidas en Resus a las placas NGM de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal de ocho o 12 canales.Evite tocar el NGM. Deje secar las bacterias bajo un gabinete de flujo laminar estéril durante aproximadamente dos horas. Verificando regularmente para evitar que el NGM se seque demasiado, incube las placas de 96 pocillos R-N-A-I-N-G-M a 37 grados centígrados durante la noche en una cámara húmeda.Consulte el protocolo escrito para preparar una población sincronizada de gusanos tras enfriar las placas de 96 pozos R-N-A-I-N-G-M a temperatura ambiente. Añada aproximadamente de 100 a 200 gusanos en dos microlitros de medio M nueve a cada pozo. Verifique que cada pozo contenga gusanos.Los gusanos deben estar nadando. Deje que las placas se sequen bajo una cabina de flujo laminar estéril durante un máximo de una hora. Revise las placas regularmente.Los gusanos deben arrastrarse en lugar de nadar. Coloque las placas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche. Después de seleccionar un lote altamente infeccioso de esporas de Judge Miria.Use el tampón M nueve para recolectar los esporos de una placa de nueve centímetros. Distribuya cuatro microlitros de esporos en cada pocillo y revise cada pocillo en busca de esporos. Los gusanos deben estar nadando.Deje secar las placas bajo un gabinete de flujo laminar estéril durante aproximadamente una hora. Revise las placas regularmente hasta que los gusanos comiencen a desplazarse. Luego, coloque las placas infectadas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche.Revise los gusanos antes del análisis observándolos rápidamente bajo un microscopio fluorescente para verificar un desarrollo exitoso, con buena inducción de GFP en el control negativo y reducción de la fluorescencia de GFP en los pocillos del control positivo. Si la inducción es adecuada, utilice una pipeta multicanal de ocho o doce canales para transferir los gusanos con 100 microlitros de NaCl 50 milimolar y 0,05 % de Tritón a una nueva placa de 96 pocillos con fondo redondo, etiquetada o con código de barras.Congele las placas a menos 80 grados Celsius hasta el día del análisis. Ese día, descongele las placas congeladas a temperatura ambiente. Una vez que las placas se hayan descongelado, continúe con el análisis automatizado utilizando el COPA bios.El equipo trata la placa pozo por pozo y analiza los parámetros de cada gusano, como su fluorescencia. Transcriba la información obtenida del biosortt COPA en un archivo de Excel para verificar la calidad de los datos. Luego, almacene los datos brutos, incluyendo densidad óptica, longitud axial y emisiones fluorescentes, en un paquete limbs para análisis cuantitativos detallados posteriores.En este experimento, los gusanos transgénicos expresaron constitutivamente un reportero P call 12 ds red y un PNLP 29 GFP inducible. Los gusanos reporteros fueron expuestos a un control o a un clon de ARN de interferencia de GFP-A durante 48 horas. Los paneles de la izquierda corresponden a gusanos no infectados, y los de la derecha, a gusanos 18 horas después de la infección con D spora.Cuando el fenotipo de interés es la expresión de un reportero GFP, los pozos con el clon de ARNi para GFP proporcionan un control robusto. COPA bios SORTT genera datos numéricos para cada gusano analizado. Estos gráficos muestran el promedio y la desviación estándar para cada pozo de gusanos transgénicos.Expresando constitutivamente un reportero DS rojo p call 12 y un reportero GFP PNLP 29 inducible tras el ARNi y la infección con diaspora. El clasificador analiza el tiempo de vuelo (TOF), que corresponde al tamaño de los gusanos, la fluorescencia roja y la relación entre la fluorescencia verde y el TOF. Algunos clones provocan defectos de crecimiento y/o afectan la expresión de DS rojo P 12.Otros afectan específicamente la expresión de las proteínas fluorescentes. Por ejemplo, este clon particular dirige el gen NS Y uno que previamente se ha demostrado importante para la regulación de NLP 29. La fluorescencia verde y roja, y el TOF, se miden en unidades arbitrarias pero constantes.Una de las innovaciones de este protocolo es el uso de placas congeladas para posponer su análisis. La congelación permite almacenar las placas hasta dos semanas sin alterar sustancialmente los resultados, como se muestra aquí. Aunque los valores absolutos de la fluorescencia medida puedan cambiar, sus proporciones relativas permanecen similares.Se infectaron o no cuatro gusanos portadores de los transgenes PNLP-29::GFP y Pcall-12::dsRed con diáspora. Tras 18 horas, cada placa se dividió aproximadamente en dos mitades: una mitad se analizó inmediatamente y la otra se congeló a menos 80 grados Celsius durante 24 horas antes de descongelarse. Se calcularon valores de análisis para el tamaño promedio, opacidad y fluorescencia verde y roja para cada muestra.El gráfico muestra la relación del promedio de muestras infectadas dividido por el de muestras no infectadas, para las muestras congeladas y vivas mostradas aquí. A partir de análisis duplicados de una placa representativa, se obtienen las relaciones de fluorescencia normalizadas para cada pocillo, que corresponden al valor medio de fluorescencia de un pocillo dividido por la media recortada de la placa. Una vez dominado, este protocolo puede permitir que un grupo de dos a tres personas realice una criba a escala del genoma en dos a tres meses.La ejecución exitosa de este protocolo requiere un buen trabajo en equipo. Los miembros de mi grupo invirtieron un esfuerzo enorme para elaborar un protocolo eficiente y relativamente fácil de llevar a cabo.

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