Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es analizar la función de los genes de manera cuantitativa y ver la elegancia a escala de todo el genoma. Esto se logra primero derribando la expresión de cada gen por el ojo de ARN. En placas de 96 pocillos.

A continuación, se realiza la prueba pertinente para la función de los genes. En este ejemplo, se evalúa la capacidad de la elegancia marina para responder normalmente a la infección fúngica mediante el análisis de la expresión de un indicador fluorescente inducible. A continuación, se realiza un análisis cuantitativo automatizado utilizando el Coss bio sortt, en última instancia, el análisis de rasgos cuantificables, como la expresión de un gen reportero fluorescente, muestra subconjuntos de genes que son necesarios para modular vías particulares, gobernar el desarrollo, el comportamiento o la fisiología.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diferentes campos en los que se ve elegancia, como el desarrollo, la neurobiología, así como las interacciones entre el huésped y los patógenos. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando el laboratorio de Oranger publicó las primeras pantallas oculares de ARN a gran escala. Se necesitó un esfuerzo considerable para desarrollar las herramientas necesarias y perfeccionar la automatización.

Voy a demostrar el procedimiento junto con Olivia ti, una científica del personal y una asistente de investigación del laboratorio de Jonathan Eubanks para hacer 10 a 1296. Las placas de los pocillos comienzan preparando 100 mililitros de crecimiento de nematodos, medio o NGM en agua desionizada. Consulte el protocolo escrito para obtener instrucciones.

Mientras el medio aún está caliente, agregue 100 microgramos por mililitro de ampicilina, 12,5 microgramos por mililitro de tetraciclina y cuatro milimolares de IPTG y distribuya rápidamente 75 microlitros en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Compruebe y elimine inmediatamente las burbujas de aire presentes en los pozos. Guarde las placas en una cámara húmeda a cuatro grados centígrados.

A continuación, prepare 96 placas de pocillos profundos añadiendo 1,5 mililitros de LB que contengan ampicilina y tetraciclina. A cada pocillo agregue una etiqueta o código de barras único. Cubra cada plato y guárdelo a cuatro grados centígrados si se prepara con anticipación, agite el plato de caldo LB de 96 pocillos que contiene el RNAI.

Clones bacterianos con ampicilina, tetraciclina y glicerol, y distribuyen tres microlitros de cada clon bacteriano al pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos de profundidad previamente preparada. Utilice pocillos vacíos para controles, cubra las placas de 96 pocillos profundos con una película adhesiva e incube durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Coloque la placa replicada de 96 pocillos usada a menos 80 grados centígrados en la mañana siguiente al cultivo durante la noche.

Transfiera las placas NGM de 96 pocillos de cuatro grados centígrados a una cabina de flujo laminar estéril y deje que se calienten y sequen durante cinco a 15 minutos. A continuación, añada la etiqueta o el código de barras adecuado a cada plato. Recupere las 96 placas de cultivo nocturno de pozos profundos de la incubadora.

Observe el crecimiento exitoso de la centrífuga de cultivos bacterianos. Los 96 pozos profundos se platean durante cinco minutos a 4.000 RPM. Drene el sobrenadante volteando la placa bruscamente hacia abajo y séquela rápidamente.

Los bordes de la placa en una toalla de papel resuspenden la pelleta bacteriana en el líquido residual mediante vórtice. Lo ideal es utilizar un agitador específico para que cada placa reciba exactamente el mismo tratamiento. Transfiera cinco microlitros de las bacterias suspendidas de Resus a las placas NGM de 96 pocillos utilizando una pipeta múltiple de ocho o 12 canales.

Evite tocar el NGM. Deje que las bacterias se sequen bajo una cabina de flujo laminar estéril durante aproximadamente dos horas. Revisando regularmente para evitar que el NGM se convierta en dos incubaciones secas, las placas R-N-A-I-N-G-M de 96 pocillos se colocan a 37 grados centígrados durante la noche en una cámara húmeda.

Consulte el protocolo escrito para preparar una población sincronizada de gusanos después de enfriar las placas R-N-A-I-N-G-M de 96 pocillos a temperatura ambiente. Agregue aproximadamente de 100 a 200 gusanos en dos microlitros de M nueve a cada uno. Revisa que cada pozo tenga lombrices.

Los gusanos deben estar nadando. Deje que las placas se sequen bajo una cabina de flujo laminar estéril durante un máximo de una hora. Revise las placas con regularidad.

Los gusanos deben arrastrarse en lugar de nadar. Coloque las placas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche. Después de seleccionar un lote altamente infeccioso de la jueza Miria spora.

Use M nine Buffer para recolectar las esporas de un plato de nueve centímetros. Distribuya cuatro microlitros de esporas a cada pocillo y revise cada pocillo en busca de esporas. Los gusanos deben estar nadando.

Configure las placas para que se sequen bajo una cabina de flujo laminar estéril durante aproximadamente una hora. Revise las placas con regularidad hasta que los gusanos comiencen a arrastrarse. A continuación, coloque las placas infectadas en una cámara húmeda a 25 grados centígrados durante la noche.

Verifique los gusanos antes del análisis observándolos rápidamente bajo un microscopio fluorescente para un desarrollo exitoso, para una buena inducción de GFP en el control negativo y para reducir la fluorescencia de GFP en los pocillos de control positivo. Si la inducción es buena, utilizando una pipeta múltiple de ocho o 12 canales, transfiera los gusanos con 100 microlitros de NACL de 50 milimolares y 0,05% de tritón a una nueva etiqueta o código de barras. Placa inferior redonda de 96 pocillos.

Congele las placas a menos 80 grados centígrados hasta el análisis el día del análisis descongele las placas congeladas a temperatura ambiente. Una vez que las placas se hayan descongelado. Proceda al análisis automatizado utilizando el BIOS COPA.

La máquina trata bien por pozo la placa y analiza los parámetros de cada gusano, como su fluorescencia. Transcribir la información obtenida de la clasificación de la BIOS de COPA en un archivo Excel para la verificación de la calidad de los datos. A continuación, almacene los datos brutos, como la densidad óptica, la longitud axial y las emisiones fluorescentes, en un paquete de extremidades para realizar posteriores análisis cuantitativos detallados.

En este experimento, los gusanos transgénicos expresaron constitutivamente un P call 12 ds red reporter y un PNLP inducible 29 GFP. Los gusanos reporteros se expusieron a un clon ocular de control o A-G-F-P-R-N-A durante 48 horas. Los paneles de la izquierda son gusanos no infectados, y los de la derecha son gusanos 18 horas después de la infección con esporas D.

Cuando el fenotipo de interés es la expresión de un reportero de GFP, los pozos del gen con el clon GFP RNAi proporcionan un control robusto. El COPA bios SORTT genera datos numéricos para cada gusano analizado. Estos gráficos muestran el promedio y la desviación estándar para cada pocillo de gusanos transgénicos.

Expresando constitutivamente un reportero rojo de p call 12 DS y un reportero PNLP 29 GFP inducible después de RNAI e infección con diáspora. El clasificador analiza el tiempo de vuelo o TOF, que corresponde al tamaño de los gusanos, la fluorescencia roja y la relación entre la fluorescencia verde y el TOF. Ciertos clones provocan defectos de crecimiento y/o afectan a la expresión de P 12 DS rojo.

Otros afectan específicamente a la expresión de FP. Por ejemplo, este clon en particular se dirige al gen NS Y uno que anteriormente se había demostrado que era importante para la regulación de NLP 29. La fluorescencia verde y roja y el TOF se miden en unidades arbitrarias pero constantes.

Una de las innovaciones de este protocolo es el uso de placas de congelación para posponer su análisis. La congelación permite que las placas se almacenen hasta por dos semanas sin alterar sustancialmente los resultados, como se muestra aquí. Aunque los valores absolutos de la fluorescencia medida pueden modificarse, sus proporciones relativas siguen siendo similares.

L: cuatro gusanos portadores de los transgenes rojos PNLP 29 GFP y P call 12 ds estaban infectados con la diáspora o no. Después de 18 horas, cada placa se dividió aproximadamente en dos, la mitad se analizó inmediatamente y la otra mitad se congeló a menos 80 grados centígrados durante 24 horas antes de descongelarse. Se calcularon los valores de análisis de tamaño promedio, opacidad y fluorescencia verde y roja para cada muestra.

El gráfico muestra el cociente entre el promedio de infectados dividido por las muestras no infectadas para las muestras congeladas y vivas que se muestran aquí. A partir de análisis duplicados de una placa representativa se obtienen las proporciones de fluorescencia normalizadas para cada pocillo, que es la media de fluorescencia de un pocillo dividida por la media recortada de la placa. Una vez dominado, este protocolo puede permitir a un grupo de dos o tres personas realizar un cribado de genoma completo en dos o tres meses.

La ejecución exitosa de este protocolo requiere mucho trabajo en equipo. Los miembros de mi grupo invirtieron un enorme esfuerzo para hacer un protocolo que fuera eficiente y relativamente fácil de llevar a cabo.